4.6: Ensayo de invasión con matrices 3D

Los científicos han desarrollado modelos 3D para estudiar con mayor precisión los procesos de invasión y migración de células. Si bien la mayoría de los sistemas de cultivo celular tradicionales son 2D, las células de nuestros tejidos existen dentro de una red 3D de moléculas conocida como matriz extracelular o ECM. Si bien muchos de los procesos mecanicistas necesarios para la motilidad celular en 2D y 3D son similares, factores como la rigidez reducida de la ECM en comparación con las superficies de plástico, la adición de una tercera dimensión para la migración y el obstáculo físico de moverse a través de la malla de polímeros largos en la ECM, presentan diferentes desafíos para la célula en comparación con la migración bidimensional.

Este video presentará brevemente la función básica y la estructura de la MEC, así como los mecanismos por los cuales las células modulan y migran a través de ella. A continuación, discutiremos un protocolo general utilizado para estudiar la invasión de células endoteliales. Por último, destacaremos varias aplicaciones de las matrices 3D al estudio de diferentes cuestiones biológicas.

Comencemos examinando la composición de la ECM y cómo interactúan las células con ella.

La MEC realiza muchas funciones, como proporcionar soporte a las células, facilitar la comunicación intercelular y separar los tejidos. La composición de la MEC varía entre los diferentes tejidos y tiene diferentes propiedades biológicas, pero se puede clasificar en dos grandes tipos. La membrana basal sirve para anclar y separar los tejidos, mientras que la matriz intersticial rodea y sostiene las células dentro de un tejido. La matriz intersticial está compuesta principalmente por la proteína fibrosa colágeno, pero también incluye elastina y fibronectina.

Es necesario que ocurran varios procesos biológicos para que las células migren a través de la MEC. La primera es la adhesión célula-matriz, que involucra proteínas transmembrana llamadas integrinas. Estos conectan la MEC con el andamio interno de la célula, conocido como citoesqueleto.

Otro proceso es el reordenamiento estructural del citoesqueleto de la célula. Esto conduce a la formación de estructuras especializadas llamadas invadopodios, que son protuberancias de la célula en su matriz circundante. El paso final es la modulación ECM. Por lo general, se trata de moléculas degradativas conocidas como metaloproteasas de matriz o MMP, que se acumulan en los invadopodias y degradan la MEC circundante, lo que facilita la invasión celular. Los ensayos de invasión de matrices en 3D permiten a los científicos visualizar y estudiar este complejo proceso.

Ahora que está familiarizado con la MEC y su interacción con las células, repasemos un protocolo para estudiar la invasión de la MEC por las células endoteliales para formar túbulos. Al cultivar células endoteliales en un entorno 3D, se puede simular el proceso biológico del crecimiento de los vasos sanguíneos, también conocido como angiogénesis, que es importante tanto durante el desarrollo normal como durante el cáncer.

Primero, se cultivan células endoteliales y se prepara una suspensión de una sola célula tratando las células con proteasas como la tripsina y pasándolas a través de un filtro de malla para romper los grupos celulares. La matriz 3D, comúnmente compuesta de colágeno, fibrina, laminina o combinaciones más complejas de estos componentes, que se pueden preparar en el laboratorio o pedir a proveedores comerciales, se descongela en hielo. Dado que la mayoría de las preparaciones de ECM polimerizan a temperaturas más altas, también es útil mantener fríos otros equipos y reactivos. La suspensión celular se mezcla con la solución de matriz descongelada para incrustar las células, y esta mezcla se coloca en una incubadora de cultivo celular donde la temperatura más alta hará que la matriz se polimerice.

Una vez que se establece la matriz que contiene células, se agregan medios de cultivo que contienen factores angiogénicos a la placa de matriz. Utilizando un software de microscopía de lapso de tiempo, se puede rastrear las células individuales para observar su migración a través de la matriz. Las imágenes resultantes se analizan y las posiciones de las celdas se utilizan para calcular la dirección y la distancia del movimiento en micras. Estos valores se pueden trazar para determinar la actividad locomotora, la tasa de migración promedio de las células. Por último, la formación de la red de tubos se observa y analiza utilizando un software de visualización para identificar características como nodos, tubos y bucles.

Ahora, exploremos algunas aplicaciones de las matrices 3D en experimentos específicos.

La migración celular está mediada por la modulación activa del citoesqueleto celular. En este experimento, se prepararon matrices de colágeno y se mezclaron con una tinción que contenía proteína fluorescente roja para permitir la visualización. Los esferoides celulares individuales, que son grupos de células que flotan libremente, se aislaron e incrustaron en la matriz de colágeno. Después de la incubación, las células incrustadas se tiñeron para componentes citoesqueléticos específicos y se obtuvieron imágenes mediante microscopía de fluorescencia. Los investigadores observaron los componentes del citoesqueleto y sus alteraciones a medida que las células migraban a través de la MEC.

Los científicos también pueden estudiar cómo las propiedades de la MEC afectan a la migración. Utilizando un sistema de gel concéntrico, en el que las células están incrustadas en una matriz de gel interna rodeada de matrices externas de concentraciones variables, los científicos pueden rastrear las células utilizando microscopía de lapso de tiempo para estudiar su migración desde el gel interno hasta el gel externo inicialmente libre de células. Los investigadores observaron que la mayor rigidez de los geles de mayor concentración dio lugar a aumentos tanto en el desplazamiento celular como en la distancia general de la migración celular.

Por último, los ensayos de invasión de la matriz pueden realizarse en un animal vivo para estudiar la angiogénesis en un contexto específico de un órgano. Aquí, se generaron geles de fibrina, comúnmente utilizados en ingeniería de tejidos debido a su naturaleza biodegradable, seguidos de la implantación en pulmones de ratón, donde los geles se mantuvieron en su lugar mediante un "pegamento". Hecho de la proteína fibrinógeno. Se permitió que ocurriera la migración celular y la formación de nuevos vasos sanguíneos durante los siguientes 7 a 30 días, después de lo cual se recolectaron, fijaron y seccionaron los pulmones y los geles de fibrina. Las imágenes de estas secciones revelaron la formación de vasos sanguíneos y alvéolos en los geles implantados, lo que brinda a los investigadores información sobre este aspecto crucial del desarrollo pulmonar en su entorno in vivo.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre los ensayos de invasión de matriz extracelular. En este vídeo se analizó la composición de la MEC y cómo migran las células a través de ella, se presentó un protocolo sencillo para estudiar la migración de las células endoteliales a través de una matriz 3D y se destacaron varios procesos celulares que se están estudiando actualmente en el contexto de las interacciones célula-MEC. Debido a que la migración celular endógena ocurre en el espacio 3D, estas condiciones biológicas se simulan mejor mediante técnicas de cultivo 3D. Las mejoras en la composición de la matriz continuarán permitiendo a los científicos replicar y estudiar con mayor precisión la migración celular en el laboratorio. Como siempre, ¡gracias por mirar!