Name: Usando el análisis de punto para analizar la migración de células de hojas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprende a usar el ensayo de punto para analizar la migración de láminas celulares cohesivas en respuesta a señales del microambiente. Este método permite evaluar la motilidad celular en investigación oncológica.

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El autor desea agradecer Bhagawat Subramanian, Chang Yi (Jason), Paul Randazzo y Carole Parent para leer y comentar el manuscrito. Este trabajo fue financiado por el programa de investigación Intramural del Instituto Nacional del cáncer, institutos nacionales de salud.

1. capa de platos (día 1)
Nota: Asegúrese de no dejar huellas dactilares o suciedad en la parte inferior de la placa al manejarla.
<ol><li>Descongelar el colágeno de ratón IV en el hielo y diluir con 50 mM HCl (pH 1.3) para preparar 3 mL de solución 10 μg/mL colágeno IV. Nota: Colágeno precipitará a 37 ° C. Por lo tanto es importante mantener la solución de colágeno a baja temperatura descongelamiento y trabajando con él. Evitar ciclos de congelación y descongelación repetida mediante la preparación de alícuotas de tamaños adecuado y almacenamiento a-80 ° C.</li>
	<li>Añadir solución de colágeno IV de 250 μl a cada pocillo de las placas de fondo de cristal 12-bien y colocarlos en una caja de plástico de tamaño adecuado, cierre firmemente. Coloque toalla de papel húmeda sobre y alrededor de las placas para la fabricación de una cámara húmeda y cerrar el cuadro. Incubar las placas durante la noche a temperatura ambiente. Nota: Como sólo el área de crecimiento necesita ser cubierto, es suficiente para cubrir solamente la hoja de cubierta, que se une a la parte inferior de la placa, con la solución de colágeno (ver figura 1A, B para un esquema de la placa).</li>
	<li>A la mañana siguiente, enjuagar las placas con desionizada de H2O dos veces para quitar el tampón y colágeno no absorbido. Dirigir el agua hasta el borde de la placa de la pozo, no hasta el borde formado por la placa inferior y el cubreobjetos (si agua se pipetea en esta área que salpicará). Deje secar al aire los platos en la campana de flujo laminar. Utilizar las placas inmediatamente o guardar a 4 ° C durante 5 días. Nota: Diferentes líneas celulares pueden requerir diferentes capa, como la fibronectina o colágeno I.</li>
</ol>2. galjanoplastia el ensayo de punto (día 2)
<ol><li>
Preparación de la suspensión de células
	<ol>
<li>Para preparar la suspensión celular, utilizar las células que se han cultivado en una placa de cultivo de tejido de 60 milímetros en medio DMEM/F12 suplementado con suero de caballo de 5% a 80% de confluencia</li>
		<li>Lavar las células con solución salina amortiguada de fosfatos de calcio y magnesio libres Dulbecco (DPBS) una vez, Añadir 500 μl de tripsina-EDTA (temperatura ambiente) e Incube las células 3-5 minutos en una incubadora a 37 ° C, 5% CO2ambiente humidificado.</li>
		<li>Suspender las células separadas 4,5 mL medio de cultivo para parar la actividad de tripsina y contar 20 alícuota μl de la suspensión de células en un hemocitómetro.</li>
		<li>Sedimenten las células restantes en un tubo cónico de 15 mL por centrifugación a 200 x g durante 3 minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en medio de cultivo a 3 x 106 células/mL. Nota: Para otros sustratos de capa o líneas celulares, la densidad celular óptima debe establecerse en una serie de diluciones. 3 x 106 células/mL se recomienda como punto de partida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Las células de la galjanoplastia
	<ol>
<li>Lugar un descenso de 10 μl de la suspensión celular en el centro de cada tapa del colágeno IV 12-bien vidrio inferior Placa revestida sin tocar ni rayar el recubrimiento (figura 1A, B). Incube la placa durante 30 min a 37 ° C, atmósfera humidificada, para permitir que las células a conectar. Ver en un microscopio invertido que se unen las células. Nota: Esto puede ser ve mejor en el borde de la gota, donde puede observarse la formación de una monocapa (figura 1C). Si es necesario, Incube la placa hasta 3 h. Asegúrese de que la humedad en la incubadora es lo suficientemente alta como las gotas pueden secar rápidamente. Si se observa una reducción del volumen de gota durante este paso, añadir PBS a los espacios entre los pozos para aumentar la humedad.</li>
		<li>Lave suavemente los pocillos con 1 mL de medio de cultivo dos veces para eliminar las células no inscritos. Añadir 1 mL medio de cultivo a cada pocillo. Ver en un microscopio invertido que ningunas células flotantes mantienen, de lo contrario lavar los pozos otra vez. Incube las células durante la noche a 37 ° C, 5% CO2, atmósfera humidificada, para obtener hojas de celda bien definida. Nota: Celdas de flotación están probable que vuelva a acoplar a la placa y formar colonias de células no deseadas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. estimulando a las células (día 3)
<ol><li>Compruebe todos los pozos utilizando un microscopio inverso para ese celular colonias han crecido adecuadamente. Si es necesario, marcar pozos inadecuados y no los utilice.</li>
	<li>Etiqueta de cada pocillo de la placa adecuada para cada condición de investigado. Ejecute cada condición en duplicado o triplicado.</li>
	<li>Cambiar el medio para matar de hambre las células en DMEM/F12 que contiene 0.1% de suero equino (medio muerto de hambre) 3 h antes de que las células son estimuladas.</li>
	<li>Estimular las células por adición de EGF (concentración final de 5 ng/mL) o por otros mediadores deseadas y mezcle suavemente el medio utilizando una micropipeta de 1 mL o agitando la placa.</li>
	<li>Incube la placa durante 1-4 días observar el desplazamiento de borde y contorno de borde tal como se describe en la sección 4.1 o realizar proyección de imagen de Time-lapse como se describe en la sección 4.2.</li>
</ol>4. visualización de colonias de células y la migración celular
<ol><li>
Hematoxilina-eosina (HE) tinción para medir el crecimiento de la Colonia (día 4-7)
	<ol>
<li>Fijar las células en etanol al 70% (1 mL/pocillo) durante 2 minutos.</li>
		<li>Tinción con hematoxilina (1 mL/pocillo), min ~ 2 núcleos.</li>
		<li>Células de lavado con agua del grifo (1 mL/pocillo) hasta los núcleos son de color azules, 5-10 minutos.</li>
		<li>Citoplasma de tinción con eosina (1 mL/pocillo), ~ 2 min.</li>
		<li>Enjuague con agua desionizada (1 mL/pocillo). Nota: Soluciones de hematoxilina y eosina pueden ser recogidas y utilizadas varias veces hasta que la coloración se convierte en débil.</li>
		<li>Placa de secado al aire.</li>
		<li>Dé vuelta la placa y medir el diámetro del punto con una regla. Alternativamente, tomar fotos de la placa con una cámara y analizar el punto de diámetro en ImageJ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Time-lapse microscopia (día 3)
	<ol>
<li>Encienda el microscopio de la incubadora y ajustar la temperatura a 37 ° C. Llene el humidificador con dH2O. ajustar el CO2 al 5%. Asegúrese de que la cámara de la incubadora es humidificada y que la etapa motorizada puede moverse libremente. Cierre la cámara incubadora y permita que el microscopio a 37 ° C. Nota: El microscopio (véase la tabla de materiales) utilizado aquí se debe calentar a 37 ° C durante al menos 3 horas antes de que las células son imágenes para evitar la deriva de la atención.</li>
		<li>Coloque la placa en la etapa del microscopio incubadora y configurar la lista de la etapa. Imagen dos bordes opuestos y el centro de cada punto de la célula (figura 1A).</li>
		<li>Tomar imágenes cada 3 minutos, para 15-24 h con el objetivo de X 10. Descargar los datos y proceder a su análisis de la imagen en un programa de elección, por ejemplo, ImageJ o Matlab.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li>
<li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li>
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<li>Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).</li>
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<li>Tang, B., Vu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+switches+from+tumor+suppressor+to+prometastatic+factor+in+a+model+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).</li>
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<li>Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+stretching+and+rearrangement+in+epithelial+sheet+migration%5BTitle%5D)+AND+%22New+J+Phys%22%5BJournal%5D)">Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration.</a> New J Phys. 15 (2), (2013).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+analysis+of+collective+cell+migration+using+the+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay.</a> J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).</li>
<li>Rosen, P., Misfeldt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+determines+epithelial+migration+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell density determines epithelial migration in culture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).</li>
</ol>

El autor no tiene nada que revelar.

En las células de la progresión del tumor migran fuera del tejido de origen, para invadir el tejido circundante y metastatizar a sitios distantes15. Migración de células de una colonia de células se observan en el análisis del punto. Aquí, el análisis de punto se ilustra mediante el análisis del fenotipo migratorio de las células de cáncer de mama humano en respuesta al EGF.
Para obtener resultados precisos y reproducibles en varios pasos en la configuración del punto e...

Ensayos de migración son ampliamente utilizados para evaluar el potencial invasivo y metastásico de las células de tumor en vitro. Por lo general, la herida o rasguño de análisis se utilizan para evaluar la migración de hojas epiteliales en un celular autorizado zona1,2,3. Para realizar el ensayo de rayado, las células se platean en una monocapa y se crea un "cero" o zona libre de células con una punta de pipeta. El ensayo de rayado es fácil de configurar con suministros de cultivo de tejidos comúnmente disponibles y puede ser realizado en placas de varios pocillos, permitiendo para el procesamiento de muestras múltiples. Sin embargo, mientras se hace la raya, las células se quitan físicamente de la monocapa y someterse a menudo a la muerte celular. Además, matriz extracelular, conectada a la placa a menudo se daña durante el proceso de raspado. Asimismo, el uso de silicona rellenos (tales como Ibidi cámaras4) o de plantillas de5,6,7 puede conducir a la interrupción mecánica de las células y la eliminación parcial de las proteínas de la matriz utilizada para el recubrimiento de la placas. Otra desventaja de ensayos de control de cierre de las heridas o rasguños es su curso de tiempo limitado, como la migración de la célula sólo puede ser analizada hasta que se cierre el cero.
Al realizar el ensayo de punto, las células se platean como Colonia circular en una placa cubierta o sin recubrimiento8. La razón fundamental de esta estrategia de la galjanoplastia es obtener hojas de células con bordes definidos, que pueden migrar o invadir en los alrededores libres de células sin molestar a la cultura por la eliminación de las células o partes movibles. El objetivo general de la prueba de dot es observar la migración de hojas de celular medida por el desplazamiento del borde o diámetro de Colonia, así como para realizar Time-lapse de imágenes para analizar el fenotipo migratorio de las células en mayor resolución espacio-temporal.
Migración de la célula puede verse afectada por una variedad de señales microambiental como quimiocinas, citoquinas y factores de crecimiento como el EGF. EGF es un factor de crecimiento que ejerce sus efectos biológicos por Unión a su receptor, del receptor de EGF9y aumenta el comportamiento invasivo y metastásico de tumor las células4,9,10. Aquí, el ensayo del punto se utiliza para el estudio de EGF estimula la migración de la célula en un humano invasor, pulmón formadoras mama cáncer célula línea (MCF10CA1a)8,11,12.

<table><tbody><tr><td>Células MCF10CA1a</td> Instituto de <td>Investigación Karmanos</td> N<td>/A</td><td>células utilizadas para el ensayo</td></tr><tr><td>de colágeno de ratón IV</td><td>BD Biosciences</td><td>354233</td><td>utilizadas para recubrir placas de</td></tr><tr><td>tripsina / EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300054</td><td>utilizadas para eliminar células de placas de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>DPBS&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td>utilizado para lavar células</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320082</td><td>utilizado como medio de cultivo</td></tr><tr><td>suero de caballo</td><td>Thermo Fisher</td><td>26050088</td><td>utilizado para complementar el medio de cultivo</td></tr><tr><td>Placa inferior de vidrio de 12 pocillos</td><td>MatTek</td><td>P12G-1.5-14-F</td><td>utilizado para cultivar células para la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>EGF (factor de crecimiento epidérmico, recombinante humano)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>utilizado para estimular las células</td></tr>, <tr><td>libre de ácidos grasos, BSA</td><td>Sigma</td><td>A8806-1G</td><td>utilizado para hacer tampón para EGF</td></tr>, <tr><td>hematoxilina</td><td>Sigma</td><td>, HHS32</td><td>utilizado para teñir colonias</td></tr>, <tr><td>eosina</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>26051-10</td><td>utilizado para teñir colonias</td></tr><tr><td>37 &#176; C, 5% CO2 incubadora</td><td>Sanyo</td><td>modelo MCO-18AIC (UV)</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver con cámara de incubadora y platina motorizada</td><td>Zeiss</td><td>modelo Axio Observer.Z1</td><td>utilizado para imágenes de lapso de tiempo</td></tr><tr><td>Cámara ORCA Flash LT sCMOS</td><td>BioVision</td><td>C11440-42U-KIT</td><td>utilizado para imágenes de lapso de tiempo en combinación con Zeiss AxioObserver</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>BioVision</td><td>MMACQMIC</td><td>software utilizado para la obtención de imágenes de lapso</td></tr><tr><td>de tiempo microscopio invertido</td><td>Olympus</td><td>modelo IX70</td><td>utilizado para contar células y verificar colonias en</td></tr> cultivo de tejidos <tr><td>caja de plástico</td><td>Lock& Cerradura</td><td>N/A</td><td>utilizada como cámara húmeda (se puede utilizar cualquier caja de plástico de cierre hermético que se ajuste a las placas)</td></tr></tbody></table>

usando el análisis de punto para analizar la migración de células de hojas

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Aunque organismos complejos aparecen estáticos, sus tejidos están bajo una rotación continua. Como las células de edad, mueren y son reemplazados por nuevas células, las células se mueven dentro de los tejidos de una manera bien orquestada. Durante el desarrollo del tumor, este equilibrio es perturbado, y salir de las células del tumor del epitelio de origen, para invadir el microambiente local, viajar a sitios distantes y en última instancia formar tumores metastásicos en sitios distantes. El punto es un análisis simple, de dos dimensiones de la migración sin restricciones, para evaluar el movimiento neto de las hojas de la célula en una zona libre de células y para analizar parámetros de migración de la célula usando proyección de imagen de Time-lapse. Aquí, el análisis de punto se demuestra con un humano invasor, línea de células de cáncer de mama, MCF10CA1a, formadoras de pulmón para analizar migratorias ante las células factor de crecimiento epidérmico (EGF), que se sabe para aumentar el potencial maligno de las células de cáncer de mama y para alterar el fenotipo migratorio de las células.

El ensayo de punto presentado (figura 1) se realizó con invasor, Colonia de pulmón formando las células de cáncer de mama (MCF10CA1a) como modelo. El ensayo de punto cede puntos celular altamente reproducibles en manos de principiantes, lo que es un conveniente y fácil de ejecutar el ensayo (figura 1D). El ensayo de punto combinado con la coloración, o proyección de imagen de Time-lapse y partícula posterior imag...

Migración celular es esencial para el desarrollo, mantenimiento de tejidos y reparación y tumorigenesis y está regulada por factores de crecimiento, quimiocinas y citocinas. Este protocolo describe el ensayo de punto, un análisis de la migración de dos dimensiones, sin restricciones para evaluar el fenotipo migratorio de hojas adjunta, cohesivo de la célula en respuesta a señales microambiental.

Usando el análisis de punto para analizar la migración de células de hojas

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

El objetivo general del ensayo dot es evaluar el fenotipo migratorio de las láminas de células cohesivas adheridas en respuesta a señales microambientales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer, como cómo las citocinas o los factores de crecimiento alteran la motilidad de las células tumorales. La principal ventaja del ensayo dot es que se realiza fácilmente y se utiliza para obtener resultados reproducibles.Aunque este método puede proporcionar información sobre la motilidad celular, también se presta a una serie de ensayos posteriores, como la tinción de células para evaluar la morfología de las colonias de crecimiento y la dispersión celular, la inmunotinción, el análisis de proteínas y ADN o ARN, o la inyección de células en animales. Para empezar, descongela el colágeno de ratón cuatro en hielo y dilúyelo con 50 micromolares de HCL para preparar tres mililitros de una solución de colágeno cuatro de 10 microgramos por mililitro. Agregue 250 microlitros de solución de colágeno cuatro a los pocillos de placas con fondo de vidrio de 12 pocillos y colóquelos en una caja de plástico de tamaño adecuado y cierre hermético.Coloque una toalla de pap

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Investigación

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Investigación del cáncer

De uso general, se describen métodos muy accesibles para el examen de la migración celular y la invasión in vitro. El primer método es el ensayo de cierre de la herida de células que mide la motilidad celular. El segundo método es la migración y la invasión de ensayo Transwell que evalúa la quimiotaxis y la capacidad invasiva de las células.

En la migración celular y la invasión ensayos in vitro

Un método cuantitativo para estudiar la migración espontánea de las células en un microambiente confinado unidimensional se describe. Este método tiene la ventaja de canales microfabricados y se puede utilizar para estudiar la migración de gran número de células bajo diferentes condiciones en los experimentos individuales.

Estudio de la Migración celular en Canales Microfabricated

Aquí se describe un protocolo que las parejas de dos técnicas de proteómica, es decir, de 2 dimensiones electroforesis (2DE) y espectrometría de masas (MS), para identificar expresados ​​diferencialmente / proteínas modificadas después de la traducción entre dos o más grupos de muestras primarias. Este enfoque, junto con los experimentos funcionales, permite la identificación y caracterización de los marcadores de pronóstico / dianas terapéuticas.

Desde un 2DE-Gel Spot para Función de Proteínas: Lección aprendida de HS1 en la leucemia linfocítica crónica

Las propiedades mecánicas y la microestructura de la matriz extracelular afectan fuertemente a la migración de las células 3D. Un método in vitro para estudiar el comportamiento de la migración celular espaciotemporal en entornos biofísico variables, tanto a la población y los niveles de células individuales, se describe.

Gel System Concentric para estudiar el papel de Biofísica de Matrix Microambiente en la migración de células en 3D

La investigación de la migración temprana de células endoteliales (EEC) es importante para comprender la fisiopatología de ciertas enfermedades y para identificar potencialmente nuevas estrategias para la intervención terapéutica. El siguiente protocolo describe las técnicas para evaluar la migración celular que han sido adaptadas para la investigación de la EEC.

Evaluación de la migración de células endoteliales después de la exposición a sustancias químicas tóxicas

Este protocolo detalla un método adaptable para medir la migración de células en respuesta a quimioatrayentes, que también pueden ser utilizados para determinar la velocidad de difusión de un fármaco fuera de una matriz de polímero.

Una Cámara personalizable para medir la migración celular

Este estudio divulga a dos diferentes métodos para el análisis de invasión celular y la migración: el análisis de la cámara de Boyden y en vitro video microscopio basado cicatrización ensayo. Los protocolos de estos dos experimentos se describen y se comparan con sus beneficios y desventajas.

Evaluación de la invasión celular y el proceso de migración: una comparación de Video cero basado en el microscopio de la herida el análisis y el análisis de la cámara de Boyden

El actual protocolo describe un método integrado de investigación migración de la célula de cáncer y la invasión en una única plataforma en tiempo real, proporcionando una opción fácilmente reproducible y eficiente para estudiar la morfología y movilidad de la célula.

Un flujo de trabajo Simple migración/invasión usando a un sensor automatizado de células vivas

Las fuerzas mecánicas son importantes para controlar la migración celular. Este protocolo demuestra el uso de hidrogeles elásticos que se pueden deformar utilizando una micropipeta de vidrio y un micromanipulador para estimular las células con un gradiente de rigidez local para provocar cambios en la estructura celular y la migración.

Ensayo Desafiador durotaxis de una sola célula para evaluar el control mecánico del movimiento celular y los eventos de señalización relacionados

Aquí se presenta un protocolo para la evaluación cuantitativa de la migración celular 3D dentro y hacia la interfaz de hidrogeles granulares.

Cuantificación de la migración celular tridimensional dentro y hacia biomateriales de hidrogel granular

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