Usando el análisis de punto para analizar la migración de células de hojas

El objetivo general del ensayo dot es evaluar el fenotipo migratorio de las láminas de células cohesivas adheridas en respuesta a señales microambientales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer, como cómo las citocinas o los factores de crecimiento alteran la motilidad de las células tumorales. La principal ventaja del ensayo dot es que se realiza fácilmente y se utiliza para obtener resultados reproducibles.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la motilidad celular, también se presta a una serie de ensayos posteriores, como la tinción de células para evaluar la morfología de las colonias de crecimiento y la dispersión celular, la inmunotinción, el análisis de proteínas y ADN o ARN, o la inyección de células en animales. Para empezar, descongela el colágeno de ratón cuatro en hielo y dilúyelo con 50 micromolares de HCL para preparar tres mililitros de una solución de colágeno cuatro de 10 microgramos por mililitro. Agregue 250 microlitros de solución de colágeno cuatro a los pocillos de placas con fondo de vidrio de 12 pocillos y colóquelos en una caja de plástico de tamaño adecuado y cierre hermético.

Coloque una toalla de papel húmeda sobre y alrededor de los platos para fabricar una cámara húmeda y cierre la caja. Luego, incube las placas durante la noche a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, para mover el colágeno no absorbido y tampón, use agua desionizada para enjuagar las placas dos veces, dirigiendo el agua al borde del pozo de la placa, en lugar del borde formado por la parte inferior del borde y el cubreobjetos.

Seque al aire las placas en una campana de flujo laminar y utilícelas inmediatamente o guárdelas a cuatro grados centígrados durante un máximo de cinco días. Para preparar la suspensión celular, utilice células que hayan sido cultivadas en una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros en medio DMEMF12, suplementada con un 5% de suero de caballo al 80% de confluencia. Use DPBS sin calcio y magnesio para enjuagar las células una vez, luego agregue 500 microlitros de tripsina EDTA a temperatura ambiente e incube las células a 37 grados Celsius en 5% de CO2 en una atmósfera humidificada durante tres a cinco minutos.

Suspenda las células desprendidas en 4,5 mililitros de medio de cultivo para detener la actividad de la tripsina y utilice un hemocitómetro para contar una alícuota de 20 microlitros de la suspensión celular. Extraiga las células restantes en un tubo cónico de 50 mililitros por centrifugación a 200 veces la gravedad durante tres minutos. A continuación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en el medio de cultivo a tres veces 10 a las seis células por mililitro.

Para colocar las células en el centro de cada cubreobjetos de la placa de fondo de vidrio de 12 pocillos recubierta de colágeno de cuatro pocillos, coloque una gota de 10 microlitros de suspensión celular, teniendo cuidado de no tocar ni rayar el recubrimiento. El recubrimiento de una gota no circular no producirá una lámina de celdas circular, y si el recubrimiento se toca o se raya, evitará que las celdas se adhieran bien. Incubar la placa a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada durante 30 minutos, para permitir que las células se adhieran.

Luego, verifique si hay un accesorio bajo un microscopio invertido. Con un mililitro de medio de cultivo, lave suavemente los pocillos dos veces, para eliminar las células no adheridas, luego agregue un mililitro de medio de cultivo a cada pocillo. Verifique bajo un microscopio invertido que no queden células flotantes, de lo contrario, vuelva a lavar los pocillos.

Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de CO2 en una atmósfera humidificada para obtener láminas celulares bien definidas. Con un microscopio invertido, revise todos los pocillos para asegurarse de que las colonias celulares hayan crecido correctamente. Si es necesario, marque los pozos inadecuados y no los utilice.

Etiquete cada pocillo de la placa de manera apropiada para cada condición investigada. Ejecute cada condición por duplicado o triplicado. Cambie el medio para matar de hambre a las células en DMEMF12 que contiene 0.1% de suero de caballo, tres horas antes de que se estimulen las células.

A continuación, estimula las células añadiendo EGF u otros mediadores deseados. Use una pipeta de un microlitro o agite la placa suavemente para mezclar el medio. Incube la placa durante uno a cuatro días para observar el desplazamiento y el contorno de los bordes.

Para llevar a cabo la tinción H y E, lave las células con PBS dos veces y fíjelas durante aproximadamente dos minutos. Agregue hematoxilina durante aproximadamente dos minutos para teñir los núcleos. Lave las células con agua del grifo durante cinco a 10 minutos, hasta que los núcleos estén azules.

A continuación, tiñe el citoplasma con eosina durante dos minutos antes de enjuagar las células con agua desionizada. Seque la placa al aire, luego déle la vuelta y use una regla para medir el diámetro del punto. Alternativamente, tome fotografías de la placa con una cámara y use ImageJ para analizar el diámetro del punto.

Para realizar microscopía de lapso de tiempo, encienda el microscopio de la incubadora y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados. Llene el humidificador con DH2O, luego ajuste el CO2 al 5%Asegúrese de que la cámara de la incubadora esté humidificada y que la etapa motorizada pueda moverse libremente. Luego, cierre la cámara de la incubadora y permita que el microscopio se ajuste a 37 grados centígrados.

Coloque la placa en la platina del microscopio de la incubadora y configure la lista de etapas, luego obtenga una imagen de dos bordes opuestos y el centro de cada punto de celda. Con un objetivo 10X, tome imágenes cada tres minutos durante 15 a 24 horas. Descargue los datos y proceda con el análisis de imágenes en un programa de su elección como Matlab.

Inicialmente, las imágenes de contraste de fase de los puntos celulares revelaron que las células de cáncer de mama invasivas formadoras de colonias pulmonares mantienen un fenotipo mesenquimal después de la estimulación con EGF. Sin embargo, las células individuales que abandonan la lámina se observan con mayor frecuencia en los puntos celulares estimulados por EGF. La respuesta de las células de cáncer de mama formadoras de colonias pulmonares al EGF se evaluó además mediante la tinción de H y E de cultivos estimulados con EGF durante cuatro días.

De hecho, la estimulación del EGF dio lugar a un aumento del diámetro de la colonia, lo que indica que la migración de las células estimuladas por el EGF podría estar alterada. En este ensayo de puntos, se obtuvieron imágenes de las células en los bordes de la lámina durante nueve horas después de la estimulación de las células de cáncer de mama formadoras de colonias con EGF. PIV reveló que el EGF aumentó la velocidad de la célula a 0,63 micrómetros por minuto desde 0,45 micrómetros por minuto en las células de control.

Además, el EGF redujo la variabilidad de la direccionalidad celular, o dispersión angular, de 0,95 en los cultivos de control a 0,79 en los cultivos estimulados por EGF. Además, como se observó en la tinción de H y E después de cuatro días, el EGF aumentó el desplazamiento radial del borde epitelial durante nueve horas, de 257 micrómetros a 356 micrómetros. Una vez dominada, el tiempo de práctica de esta técnica es de un par de horas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la obtención de imágenes de lapso de tiempo, la inmunotinción y el análisis de ADN y ARN para responder preguntas adicionales. Por ejemplo, se puede utilizar para analizar si las proteínas se expresan diferencialmente en células de migración rápida o lenta, o cuándo las células migran al entorno circundante. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo configurar el ensayo de puntos y usarlo para evaluar el fenotipo migratorio de las láminas de células cohesivas adjuntas en respuesta a las señales microambientales.