Una técnica de Squash del túbulo seminífero para el análisis citológico de la espermatogénesis mediante el modelo de ratón

El objetivo general de esta técnica de aplastamiento de túbulos seminíferos es visualizar las características citológicas de la espermatogonia, los espermatocitos y las espermátidas de ratón, preservando al mismo tiempo su integridad celular. Para esta demostración, nos centramos en el análisis de los espermatocitos sometidos a meiosis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología reproductiva masculina, como la diferenciación de células madre espermatogoniales, la segregación cromosómica meiótica y la diferenciación postmeiótica de espermátidas redondas.

La principal ventaja de esta técnica es que se mantiene la integridad celular de las células germinales masculinas, lo que permite examinar estructuras celulares que no se visualizan fácilmente con otras técnicas. Este método se puede utilizar para mejorar nuestra comprensión de las causas paternas de la infertilidad en cualquier especie. Y se puede aplicar a sistemas de mamíferos como los testículos derivados de ratones o donantes de órganos.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para hacer una buena calabaza. La aplicación de suficiente fuerza y la disposición adecuada de los túbulos son factores importantes para producir una monocapa uniforme de células. Para cada ratón que se va a diseccionar, cargue dos placas de Petri de 35 milímetros, una con tres mililitros de PBS y la otra con dos mililitros de solución de lisis fijadora recién hecha.

Seleccione ratones que se sometan a la primera ola de espermatogénesis para observar una población enriquecida de interés. Después de sacrificar al ratón, limpie el abdomen con alcohol al 70% y luego proceda con la cirugía. Haga una abertura en forma de V en la cavidad pélvica abdominal y extraiga los testículos tirando de la almohadilla de grasa del epidídimo con pinzas, pero sin alterar la túnica albugínea.

Transfiera los testículos a la placa que contiene PBS. Allí, se retira la túnica albugínea testicular perforando el tejido con pinzas afiladas y se recogen los túbulos seminíferos sueltos. A continuación, transfiera los túbulos a la placa con la solución de lisis fijadora y deje que la reacción continúe durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Durante la incubación, prepare un portaobjetos de vidrio recubierto de poli-L-lisina delineando los bordes del portaobjetos con un rotulador de líquidos y luego llenando el portaobjetos con 100 microlitros de solución de lisis fijadora dentro de los bordes. Después de la incubación de cinco minutos, use pinzas y tijeras estériles para separar y cortar suavemente los túbulos seminíferos para obtener segmentos individuales de 20 milímetros. A continuación, transfiera cinco segmentos de túbulos de 20 milímetros al portaobjetos preparado.

A continuación, continúa dividiendo los segmentos en longitudes de 1,5 a tres milímetros con unas tijeras. Ahora, con las pinzas, coloque los segmentos de manera que no se superpongan. Distribúyalos uniformemente por el portaobjetos.

Lo ideal es que un tobogán ocupe de 20 a 40 tramos cortos. Comience eliminando el exceso de líquido en la preparación del portaobjetos con un pañuelo absorbente. Ahora, aplique un cubreobjetos y aplaste los túbulos con la presión del talón de la palma de la mano durante 10 a 20 segundos.

El objetivo es aplicar la fuerza suficiente para dispersar los espermatocitos de los túbulos seminíferos. Con un microscopio de disección, verifique que los segmentos hayan sido interrumpidos por la calabaza. Luego, vierta un poco de nitrógeno líquido en un pequeño Dewar y congele rápidamente el portaobjetos durante 15 segundos o hasta que el líquido deje de burbujear.

Para continuar con el amino secante, retire inmediatamente el cubreobjetos con una punta o borde afilado. Aunque no es lo ideal, los portaobjetos congelados pueden conservarse inmediatamente a menos 80 grados centígrados y guardarse hasta dos semanas. Para quitar el cubreobjetos más tarde, sumerja los portaobjetos en nitrógeno líquido durante 15 segundos y haga palanca para quitar el cubreobjetos.

Para proceder con el etiquetado de aminoácidos, lave los portaobjetos tres veces en PBS durante cinco minutos por lavado con un frasco Coplin de 50 mililitros. Después de los lavados, aplique un mililitro de tampón de dilución de anticuerpos en cada portaobjetos para que sirva como bloque. Deje que la reacción de bloqueo funcione durante una o dos horas en una cámara humidificada.

Nunca permita que los portaobjetos se sequen durante este procedimiento. A continuación, golpee los portaobjetos sobre una toalla de papel para retirar suavemente el tampón y devolverlos a la cámara humidificada. Luego, aplique 100 microlitros de anticuerpo primario diluido a cada portaobjetos y transfiéralos a 40 grados Celsius, donde la reacción de unión puede durar toda la noche.

Si la solución de anticuerpos es escasa, se puede usar la mitad del volumen si se cubre con un cubreobjetos o Parafilm. Al día siguiente, use tres lavados en PBS para eliminar el anticuerpo primario. A continuación, aplique 100 microlitros de anticuerpo secundario diluido y deje que esta reacción dure de una a una hora y media a temperatura ambiente.

Para evitar el fotoblanqueo, mantenga los portaobjetos en una cámara oscura humidificada durante esta incubación. A continuación, lave los portaobjetos dos veces con PBS. Ahora, puntee las diapositivas con un medio de montaje que contenga DAPI.

A continuación, selle los cubreobjetos con esmalte de uñas y proceda con la toma de imágenes. Para tomar imágenes, utilice un microscopio de epifluorescencia con una platina automatizada que permita un movimiento preciso del eje z. Utilice también una cámara de alta resolución para capturar imágenes.

Ahora, evalúe las diapositivas usando un objetivo 20x. Determine la calidad de la preparación de la calabaza. Una calabaza de buena calidad tendrá una monocapa de núcleos que se distribuyen uniformemente.

Algunas regiones de la calabaza pueden ser mejores que otras. Anote las coordenadas de las mejores regiones para encontrarlas fácilmente con un aumento mayor. Ahora, aumente el aumento hasta 100x.

A continuación, capture imágenes de regiones señaladas que tengan una monocapa consistente de núcleos. Configure las pilas z superior e inferior para asegurarse de que se capture toda la luz enfocada. El número óptimo de pilas z generalmente es designado por el software de adquisición de imágenes y es diferente para cada objetivo.

A partir de las imágenes, compile una imagen de profundidad extendida utilizando un software de procesamiento. El software combinará la luz enfocada de cada pila z, lo cual es esencial para obtener imágenes óptimas de las preparaciones de túbulos de calabaza. Utilizando el método de aplastamiento de túbulos descrito, se visualizaron poblaciones celulares transitorias que experimentan la transición de profase a metafase uno.

Las poblaciones enriquecidas de espermatocitos de la metafase uno se visualizaron utilizando los anticuerpos contra la alfa tubulina. Para visualizar las células en la profase uno, las preparaciones de túbulos de calabaza se inmunomarcaron con un anticuerpo contra la proteína 3 del complejo sinaptonémico. Se identificaron espermatocitos con estadios de leptoteno, cigoto y paquiteno.

utilizaron anticuerpos contra la quinasa del ciclo celular Aurora B para visualizar los eventos posteriores de la meiosis uno. Esta quinasa se localiza en el centrómero interno durante la metafase, luego se relocaliza en la zona media del huso durante la anafase y, finalmente, en el surco de escisión durante la citocinesis. Al mantener la integridad celular, la técnica de aplastamiento de túbulos permite la visualización de la organización subcelular en estructuras asociadas con la profase uno.

La dinámica del ramillete cromosómico se puede seguir a través de la profase uno. También se puede visualizar la duplicación de los centriolos en la disyunción del centrosoma. En la etapa temprana de diploteno, se visualizaron espermatocitos sometidos a disyunción del centrosoma después de la duplicación del centriolo con anticuerpos contra pericentrina, un componente proteico de la matriz pericentriolar, y anticuerpos contra Centrin-3 para marcar centriolos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar rápidamente las características citológicas de los espermatocitos de ratón en desarrollo mientras se preserva la integridad celular. Una vez dominado, la disección a través del aplastamiento se puede lograr en menos de una hora por ratón. Al intentar este procedimiento, es importante recordar aplicar suficiente fuerza para dispersar los espermatocitos de los túbulos seminíferos.

Además, la concentración del fijador y el tiempo de incubación se pueden optimizar en función de la estructura celular a estudiar. Con esta técnica se pueden implementar fácilmente estrategias de visualización alternativas, como los enfoques de peces de ADN y ARN. Al complementar las calabazas de los túbulos con ensayos bioquímicos posteriores, es posible evaluar los determinantes mecanicistas de una progresión meiótica exitosa.