Name: Una técnica de Squash del túbulo seminífero para el análisis citológico de la espermatogénesis mediante el modelo de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprende la técnica de squash del túbulo seminífero para analizar la espermatogénesis en ratón. Este método preserva la integridad celular y permite visualizar espermatocitos en meiosis, mejorando el estudio de la biología reproductiva masculina.

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Este trabajo fue apoyado por NIGMS (R01GM11755) a P.W.J. y por una beca de beca de capacitación desde el Instituto Nacional de cáncer (NIH) (CA009110) S.R.W. y J.H.

El uso de ratones fue aprobado por el cuidado institucional de Animal y Use Comité de la Universidad Johns Hopkins. Los experimentos fueron realizados en juveniles (20-26 días post parto, dpp) ratones C57BL/6J, tomando ventaja de la primera onda semi sincrónica de la espermatogénesis. Sin embargo, esta técnica puede realizarse también utilizando ratones adultos.
1. disección y aislamiento de los túbulos seminíferos ratón
<ol><li>Preparar el fix/solución y anticuerpo dilución tampón de lisis (Bad) se describe en la tabla 1 y tabla 2.</li>
	<li>Preparar un plato de Petri de 35 mm con 3 mL de 1 x de tampón fosfato salino (1 x PBS, pH 7,4) y otro plato de 35 mm con 2 mL de solución de lisis/fix por ratón.</li>
	<li>Sacrificar el ratón mediante dislocación cervical o CO2 asfixia y rociar el abdomen ventral con etanol al 70%. Abrir la cavidad de abdominopelvic con tijeras estériles, haciendo una abertura en forma de V. A continuación Quite los testículos en la almohadilla grasa Epididimal con unas pinzas y evitar molestar a la túnica albugínea. Coloque los testículos en un plato de Petri de 35 mm que contiene 1 x PBS. Nota: Utilizar la primera onda de la espermatogénesis para observar una población de celulares enriquecidos de interés14. Etapas específicas de la espermatogénesis se enriquecen en edades de ratón diferente (tabla 3).</li>
	<li>Retire la testicular túnica albugínea pinchando el tejido con pinzas con punta afiladas y recoger los túbulos seminíferos sueltos. Transferencia de los túbulos para un nuevo plato de Petri de 35 mm que contiene 2 mL de solución de lisis/fix.</li>
	<li>Incubar los tubos en la solución de fix/lisis durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
</ol>2. preparación de los túbulos seminíferos
<ol><li>Preparar un portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-l-lisina delineando los bordes de la diapositiva con un lápiz líquido bloqueador.</li>
	<li>Aplicar 100 μl de solución de lisis/fix para el centro de la diapositiva de cristal.</li>
	<li>Utilizando pinzas estériles y tijeras tease suavemente aparte los túbulos seminíferos. Corte de túbulo largo individual segmentos aproximadamente 20 mm de longitud. Nota: Para visualizar estructuras que son sensibles a la exposición prolongada de fijadores, como los centrosomas, los túbulos se separan primero en PBS 1 x, luego picar directamente los túbulos en la superficie de los portaobjetos de poli-lisina revestido en 100 μl de solución de lisis fix.</li>
	<li>Transferencia cinco segmentos del túbulo seminífero larga de 20 mm a la diapositiva preparado vidrio revestido poly-L-lisina que contiene solución de lisis/fix.</li>
	<li>Utilizando tijeras estériles picada túbulos seminíferos en segmentos de 1.5 a 3.0 mm.</li>
	<li>Utilizando pinzas estériles organizar los segmentos del túbulo en el portaobjetos de cristal para que se superponga con ningún tejido, y los túbulos se distribuyen uniformemente. Nota: El número óptimo de segmentos del túbulo en un portaobjetos de vidrio es entre 20 y 40.</li>
</ol>3. aplastamiento de los túbulos seminíferos
<ol><li>Transferencia de lo portaobjetos de vidrio que contiene segmentos del túbulo seminífero dispersos sobre una mesa. Retire el exceso de líquido con un laboratorio para limpiar para evitar la pérdida de tejido durante el paso de la calabaza.</li>
	<li>Aplica un cubreobjetos (22 x 60-1.5 mm) sobre el portaobjetos de cristal y aplicar presión con el talón de la Palma por 10-20 segundos. Es importante aplicar suficiente fuerza para dispersar a los espermatocitos de los túbulos seminíferos. Nota: Observar los túbulos usando un microscopio de disección con el fin de optimizar el paso squashing para que todos los segmentos del túbulo se interrumpen.</li>
	<li>Con unas pinzas de la diapositiva, inmediatamente flash congele el portaobjetos de cristal en un dewar pequeño de líquido N2 durante 15 segundos o hasta que el líquido deja de burbuja. Si inmunomarcación inmediatamente, quitar el cubreobjetos con una cuchilla de filo recto, finas pinzas de punta o aguja de calibre 21. Nota: Para obtener resultados óptimos, immunolabel las diapositivas inmediatamente (ver paso 4). Sin embargo, en este punto diapositivas pueden conservarse a-80 ° C hasta por dos semanas. Para maximizar la vida útil de las proteínas y estructuras celulares, guardar las diapositivas en hielo seco o transferencia a un congelador de-80 ° C y mantener el cubreobjetos sobre el portaobjetos. Cuando inmunomarcación almacena diapositivas, quitar el cubreobjetos sumergiendo los portaobjetos en líquido N2 durante 15 segundos, como se describe en el paso 3.3.</li>
</ol>4. inmunomarcación de túbulos seminíferos montados
<ol><li>Sumerja el portaobjetos en 1 x PBS y lavado tres veces durante 5 min en una jarra de Coplin de 50 mL que contiene 1 x PBS. Nota: Nunca deje que los portaobjetos a completamente seco durante la inmunomarcación.</li>
	<li>Aplicar 1 mL de tampón de dilución del anticuerpo sobre el portaobjetos de cristal bloquea durante 1-2 h en una cámara humidificada.</li>
	<li>Retirar el tampón de dilución de anticuerpo y aplicar 100 μl de anticuerpo primario diluido en tampón de dilución de anticuerpo en una cámara humidificada. Nota: Para mejores resultados, incuban anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Utilizar volúmenes más pequeños del anticuerpo (por ejemplo 50 μL) al cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos o parafilm. Validar y optimizar anticuerpos primarios15.</li>
	<li>Enjuagar el portaobjetos tres veces durante 5 min en una jarra de Coplin de 50 mL que contiene 1 x PBS. Nota: Para mejorar el lavado, agitar frascos Coplin utilizando una barra de agitación magnética pequeña y colocar en una placa de agitación magnética a baja velocidad o coloque la jarra de Coplin sobre una mesa mezcladora a baja velocidad.</li>
	<li>Aplicar 100 μl del anticuerpo secundario diluido en tampón de dilución de anticuerpos de 1 a 1.5 h en una cámara de vapor a temperatura ambiente. Incubar los portaobjetos en una caja oscura para evitar foto blanqueo de anticuerpos conjugado fluoróforo. Nota: Utilizar volúmenes más pequeños del anticuerpo (por ejemplo 50 μL) al cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos o parafilm.</li>
	<li>Enjuague las diapositivas dos veces durante 5 min en una jarra de Coplin de 50 mL que contiene 1 x PBS.</li>
	<li>Montar las diapositivas de medio de montaje que contiene 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5 μg/mL) y aplicar el cubreobjetos (22 x 60-1.5 mm).</li>
	<li>Sellar el cubreobjetos a las diapositivas con el pulimento de clavo claro preservar las diapositivas y evitar que el cubreobjetos se mueva.</li>
</ol>5. Análisis y proyección de imagen del túbulo squash preparados
<ol><li>Usar un microscopio de epifluorescencia con etapa automatizada que permite un movimiento preciso del eje z y una cámara de alta resolución de captura de imagen. Como alternativa, utilizar un microscopio confocal de láser. Nota: Utilice cualquier software y hardware disponible para este paso. Por ejemplo, las imágenes mostradas en la figura 1 y figura 2 fueron capturadas usando una célula Zeiss observador Z1 vinculado a una ORCA-Flash 4.0 CMOS de la cámara y analizados con el software de imagen edición de Zeiss ZEN 2012 azul.</li>
	<li>Evaluar las diapositivas con objetivo 20 X para determinar la calidad de la preparación de calabaza. Diapositivas de buena calidad tienen una monocapa de núcleos que se distribuyen uniformemente. Nota: Algunas secciones de la diapositiva pueden ser mejores que otros, es útil tener en cuenta las coordenadas de donde se pueden encontrar las mejores zonas de la diapositiva para su posterior análisis con aumento mayor.</li>
	<li>Usando el más alto objetivo de ampliación (por ejemplo, 63 X o 100 X), captura de regiones de la diapositiva que tiene una monocapa coherente de núcleos. Una vez que se selecciona una región, fijar la parte superior e inferior Z-pilas para asegurarse de que toda la luz en foco es capturada. Nota: El número óptimo de Z-pilas capturado entre el límite superior e inferior es señalado generalmente por el software de adquisición de imagen y es diferente para cada objetivo.</li>
	<li>Utilice el software de procesamiento de imágenes para compilar una imagen enfocada de profundidad extendida. El software combina la luz del foco de cada pila de Z y es esencial para la proyección de imagen óptima de preparados de calabaza del túbulo.</li>
</ol>

<ol><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
<li>Morelli, M. A., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+all+germ+cells+are+created+equal%3A+Aspects+of+sexual+dimorphism+in+mammalian+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis.</a> Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).</li>
<li>Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+meiotic+prophase+I+to+metaphase+I+transition+in+mouse+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes.</a> Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).</li>
<li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slide+preparation+method+to+preserve+three-dimensional+chromatin+architecture+of+testicular+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells.</a> J Vis Exp. (83), e50819(2014).</li>
<li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li>
<li>Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+spermatogenesis%3A+how+far+from+clinical+application%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Urol+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro spermatogenesis: how far from clinical application?</a> Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).</li>
<li>Staub, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+research+on+mammalian+male+germ+cell+meiotic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro.</a> J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).</li>
<li>Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Squash+procedure+for+protein+immunolocalization+in+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells.</a> Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).</li>
<li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li>
<li>Xu, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+cryosection+method+for+mouse+testis+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">A modified cryosection method for mouse testis tissue.</a> Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).</li>
<li>Hess, R., Moore, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+methods+for+evaluation+of+the+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Histological methods for evaluation of the testis.</a> Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).</li>
<li>Bellvé, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat%3A+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).</li>
<li>Bellvé, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+the+mouse+testis+and+characterization+of+isolated+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells.</a> J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+for+immunocytochemistry%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).</li>
<li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination%2C+pairing%2C+and+synapsis+of+homologs+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).</li>
<li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+recombination%3A+the+essence+of+heredity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic recombination: the essence of heredity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).</li>
<li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere+and+telomere+movements+during+early+meiotic+prophase+of+mouse+and+man+are+associated+with+the+onset+of+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing.</a> J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).</li>
<li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leptotene-zygotene+transition+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The leptotene-zygotene transition of meiosis.</a> Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).</li>
<li>Scherthan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bouquet+makes+ends+meet%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A bouquet makes ends meet.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).</li>
<li>Turner, J. <a target="_blank" href="http://dev.biologists.org/content/134/10/1823">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li>
<li>Royo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR+acts+stage+specifically+to+regulate+multiple+aspects+of+mammalian+meiotic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing.</a> Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).</li>
<li>Turner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+unsynapsed+meiotic+chromosomes+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse.</a> Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).</li>
<li>Marjanović, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEP63+deficiency+promotes+p53-dependent+microcephaly+and+reveals+a+role+for+the+centrosome+in+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination.</a> Nat Commun. 6, 7676(2016).</li>
<li>Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Centrosome-autonomous+signal+that+involves+centriole+disengagement+permits+centrosome+duplication+in+G2+phase+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage.</a> Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).</li>
<li>Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+mammalian+sperm+cells+identifies+new+components+of+the+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).</li>
<li>Fukuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transacting+factor+CBF-A%2FHnrnpab+binds+to+the+A2RE%2FRTS+element+of+protamine+2+mRNA+and+contributes+to+its+translational+regulation+during+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis.</a> PLoS Genet. 9 (10), e1003858(2013).</li>
<li>Lahn, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Previously+uncharacterized+histone+acetyltransferases+implicated+in+mammalian+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).</li>
<li>Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomal+association+of+histone+macroH2A1.2+in+embryonic+stem+cells+and+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells.</a> Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).</li>
<li>Shanmugam, M., Hernandez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+functions+for+SNAP45%2C+a+subunit+of+the+small+nuclear+RNA-activating+protein+complex+SNAPc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc.</a> J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).</li>
<li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).</li>
<li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li>
<li>Amory, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+spermatogenesis+by+bisdichloroacetyldiamines+is+mediated+by+inhibition+of+testicular+retinoic+acid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis.</a> J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).</li>
<li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami%3A+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18%2C446%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biol Reprod. 88 (2), 40(2013).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).</li>
<li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).</li>
<li>Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+early+and+massive+wave+of+germinal+cell+apoptosis+is+required+for+the+development+of+functional+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis.</a> EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).</li>
<li>Kangasniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+basal+and+FSH+dependent+cyclic+AMP+production+in+rat+seminiferous+tubules+staged+by+an+improved+transillumination+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique.</a> Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).</li>
<li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+arrest+of+spermiogenesis+and+germ+cell+apoptosis+in+mice+lacking+the+TBP-like+TLF%2FTRF2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene.</a> Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).</li>
<li>Henriksén, K., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+apoptosis+of+male+germ+cells+in+the+rat%3A+Mechanisms+of+cell+death+studied+by+supravital+squash+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations.</a> Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Ratones han demostrado para ser un organismo modelo útil para estudiar los eventos celulares que gobiernan la progresión meiótica durante la espermatogénesis. Además, es necesario desarrollar herramientas independientes para el estudio de la espermatogénesis debido a muchos eventos, tales como salir de la profase meiótica I, presentan dimorfismo sexual. Este protocolo describe un método de squash del túbulo seminífero de visualización y estudio de las diferentes etapas de la espermatogénesis del ratón. Este método conser...

La meiosis es un evento celular complejo en el que una sola ronda de replicación del ADN es seguida por dos sucesivas rondas de división celular. Varios eventos de meiosis específicos deben coordinarse durante las etapas iniciales de la meiosis para la segregación cromosómica precisa. Estos eventos incluyen la terminación de la recombinación homóloga, la orientación de la hermana cinetocoros durante la primera división meiótica y la pérdida gradual de los complejos de cohesina para resolver quiasmas entre homólogos. Regulación precisa de estos procesos es necesario para mantener la fertilidad y prevenir eventos de protooncogenes del cromosoma que pueden llevar a trastornos del desarrollo genéticos y aborto espontáneo1.
Mientras que los eventos clave de la meiosis ocurren en hombres y mujeres, existen diferencias significativas temporales y mecanicistas entre espermatogénesis y ovogénesis2. Por ejemplo, durante la meiosis femenina, profase I se produce durante el desarrollo embrionario y las detenciones en la etapa de dictyate hasta pubertad. Por el contrario, espermatogénesis comienza en la pubertad y progresa en oleadas a lo largo de la vida adulta sin detención. Las diferencias entre la meiosis masculina y femenina destaca la necesidad de desarrollar métodos que son atendidos específicamente hacia la evaluación de estos procesos en espermatocitos y ovocitos. En la actualidad, evaluar la progresión meiótica en gran parte se basa en el uso de la cromatina se separa3,4,5. Mientras que se separa de la cromatina es útil para estudiar los cromosomas meiotic, logran preservar la integridad celular, impidiendo la evaluación de estructuras celulares como los microtúbulos del huso, centrosomas, la envoltura nuclear y los accesorios de telómeros. Imágenes en vivo y técnicas de cultivo a largo plazo han avanzado grandemente nuestra comprensión de la meiosis femenina; enfoques similares para visualizar toda la célula intacta, sin embargo, se ejecutan con menos frecuencia para el estudio de la espermatogénesis6,7. Para poder visualizar eventos dinámicos a lo largo de la meiosis masculina, nos hemos adaptado técnicas de squash túbulo establecidos para evaluar rápidamente las características citológicas de desarrollo ratón espermatocitos8,9. El método descrito aquí mantiene la integridad de la célula, lo que permite el estudio de múltiples estructuras celulares durante las diferentes etapas de la espermatogénesis.
Esta técnica de squash del túbulo es un acercamiento entero de la célula, que permite la evaluación de las estructuras celulares mediante microscopia de la inmunofluorescencia. Métodos histológicos comunes para visualizar la progresión meiótica en ratones machos como haematoxylin y eosina de testículos de embebido de parafina y etiquetado inmunofluorescente de cryosections permiten una amplia visión de la progresión meiótica. Sin embargo, estas técnicas no logran resolver las células en la medida necesaria para el análisis detallado de los eventos que ocurren durante la meiosis10,11. Técnicas alternativas para visualizar procesos de meiosis dependen quimioautótrofos significativa interrupción el espermatocito a aislar y fijar materiales nucleares3,4,5. Estos tratamientos químicos impiden la observación de tipos celulares distintos de espermatocitos primarios. Un método recientemente descrito por Namekawa ha permitido a la comunidad de investigación para preservar la arquitectura nuclear de espermatocitos aislados, pero requiere el uso de un cytospin y accesorios que no pueden ser fácilmente disponibles en algunos laboratorios4. En cambio, la técnica de squash del túbulo sólo requiere de equipo que es generalmente estándar en la mayoría de los laboratorios biología celular.
El método de squash túbulo descrito aquí puede utilizarse para visualizar los tipos de células diversas dentro del túbulo seminífero, incluyendo células de sertoli, espermatogonias, espermatocitos primarios y secundarios y espermátidas. Por esta técnica de acoplamiento con la primera ola cerca-síncrono de la espermatogénesis de ratones jóvenes, es posible obtener poblaciones enriquecidas de células espermatogénica a medida que avancen a través de meiosis12. Este proceso permite el análisis detallado de los procesos a lo largo de la espermatogénesis, como eventos tempranos de la profase y la metafase a anafase transiciones y espermiogénesis y G2/MI. Además, preparados de calabaza del túbulo pueden utilizarse para visualizar las características citológicas de los cromosomas (por ejemplo dominios interchromatid (ICDs) y cinetocoros) y centrosomas (centriolos y el material pericentriolar/matrices). El método de la calabaza se puede realizar fácilmente en paralelo con otras aproximaciones experimentales, tales como extensiones de la cromatina y extracción de proteínas. Además, esta técnica se ha modificado con éxito para depositar espermatogénica células vivas en las diapositivas para la visualización directa de13.
El método aquí descrito requiere una técnica de squash de túbulos seminíferos células enteras para analizar la transición G2/MI en ratones C57BL/6J de tipo salvaje. Las características citológicas de espermatocitos primarios entrando en la primera división meiótica se visualizaron con microscopia de la inmunofluorescencia para observar el huso meiótico. Esta versátil técnica puede modificarse fácilmente para visualizar otras etapas meióticas y diferentes tipos de células. La técnica también es susceptible a las estrategias de visualización alternativa, tales como ADN y ARN pescado enfoques.

<table><tbody><tr><td>16% Paraformaldehído</td><td>Microscopía Electrónica Acuosa Ciencias (EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Calidad Biológico</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Placa de Petri, Estéril, sin tratar</td><td>CellTreat</td><td>P886-229638</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo bloqueador de líquidos</td><td>Microscopía electrónica Sciences (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Caja húmeda</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin Plato de tinción de vidrio para 5 o 10 portaobjetos</td><td>Fisher</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Montaje antidecoloración Medio con portaobjetos de</td> cubierta de microscopio DAPI <td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>(22 mm x 60 mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de uñas transparente</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microsopes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo </td><td>Comments</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Observador Z1</td><td>Zeiss</td><td>4109431007994000</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEN 2012 edición azul software de imagen</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 Cámara CMOS</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primary Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Mouse anti-SYCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74569</td><td>1 en 50</td></tr><tr><td>Conejo anti-SYCP3</td><td>Fisher (Novus)</td><td>NB300-231</td><td>1 en 1000</td></tr><tr><td>Cabra anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>1 en 50</td></tr><tr>Anticuerpos<td>Proteicos Anti-Centrómero Humanos</td><td>Incorporados</td><td>15-235</td><td>1 en 100</td></tr><tr><td>Ratón anti-alfa tubulina</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1 en 1000</td></tr><tr><td>Ratón anti-AIM1</td><td>BD Biosciences</td><td>611082</td><td>1 en 200</td></tr><tr><td>Ratón anti-y gamma; H2AX</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA1-2022</td><td>1 en 500</td></tr><tr><td>Ratón anti-CENT3</td><td>Abnova</td><td>H00001070-M01</td><td>1 en 200</td></tr><tr><td>Conejo anti-pericentrino</td><td>Abcam</td><td>ab4448</td><td>1 en 200</td></tr><tr><td>Conejo anti-REC8</td><td>Cortesía de&nbsp; Dra. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>1 en 1000</td></tr></tbody></table>

una técnica de squash del túbulo seminífero para el análisis citológico de la espermatogénesis mediante el modelo de ratón

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

La progresión meiótica en los hombres es un proceso que requiere la acción concertada de una serie de eventos celulares altamente reguladas. Errores que ocurren durante la meiosis pueden conducir a la infertilidad, la pérdida del embarazo o defectos genéticos. Comenzando en el inicio de la pubertad y continúa a lo largo de la edad adulta, ondas continuas semisincrónico de espermatocitos sufren espermatogénesis y en última instancia forman espermatozoides haploides. La primera ola de espermatocitos de ratón en iniciación meiótica aparecen en día 10 post parto (dpp 10) y se liberan en el lumen de los túbulos seminíferos como espermatozoides maduros en dpp 35. Por lo tanto, es ventajoso utilizar ratones dentro de esta ventana de tiempo del desarrollo con el fin de obtener poblaciones altamente enriquecidas de interés. Análisis de etapas rara de la célula es más difícil en los ratones más viejos debido al aporte de las ondas espermatogénica sucesivas, que incrementan la diversidad de las poblaciones celulares dentro de los túbulos. El método descrito aquí es una técnica fácilmente implementada para la evaluación citológica de las células que se encuentran dentro de los túbulos seminíferos de ratones, incluyendo espermatogonios, espermatocitos y espermátides. La técnica de squash túbulo mantiene la integridad de las células germinales masculinas aisladas y permite la examinación de estructuras celulares que no se visualizan fácilmente con otras técnicas. Para demostrar las posibles aplicaciones de esta técnica de squash del túbulo, montaje del huso fue supervisada en espermatocitos progresar a través de la profase metafase de la transición (la transición G2/MI). Además, duplicación del centrosoma, inactivación del cromosoma de sexo meiótica (MSCI) y formación del cromosoma ramo fueron evaluados como ejemplos de las estructuras citológicas que pueden ser observadas con este método de squash del túbulo. Esta técnica puede utilizarse para localizar defectos específicos durante la espermatogénesis que son causados por mutación o perturbación exógena, y por lo tanto, contribuye a la comprensión molecular de la espermatogénesis.

Aquí, hemos utilizado el método de squash del túbulo para visualizar las poblaciones de la célula transitoria en la profase metafase I (G2/MI) transición, que se enriquecieron con la cosecha de los testículos de los ratones de tipo salvaje menores sometidos a la primera onda de la espermatogénesis (24 DPP). La figura 1 muestra imágenes representativas de las diferentes etapas de la célula que pueden visualizarse mediante el método de squash del túbulo. Enriqu...

El objetivo de esta técnica de squash del túbulo es rápidamente evaluar características citológicas de desarrollo espermatocitos de ratón mientras que preserva la integridad celular. Este método permite el estudio de todas las etapas de la espermatogénesis y puede implementarse fácilmente junto a otros enfoques biológicos bioquímicos y moleculares para el estudio de la meiosis de ratón.

Una técnica de Squash del túbulo seminífero para el análisis citológico de la espermatogénesis mediante el modelo de ratón

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

El objetivo general de esta técnica de aplastamiento de túbulos seminíferos es visualizar las características citológicas de la espermatogonia, los espermatocitos y las espermátidas de ratón, preservando al mismo tiempo su integridad celular. Para esta demostración, nos centramos en el análisis de los espermatocitos sometidos a meiosis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología reproductiva masculina, como la diferenciación de células madre espermatogoniales, la segregación cromosómica meiótica y la diferenciación postmeiótica de espermátidas redondas.La principal ventaja de esta técnica es que se mantiene la integridad celular de las células germinales masculinas, lo que permite examinar estructuras celulares que no se visualizan fácilmente con otras técnicas. Este método se puede utilizar para mejorar nuestra comprensión de las causas paternas de la infertilidad en cualquier especie. Y se puede aplicar a sistemas de mamíferos como los testículos derivados de ratones o donantes de órganos.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para hacer una buena calabaza. La aplicación de suficiente fuerza y la disposición adecuada de los túbulos son factores importantes para producir una monocapa uniforme de células. Para cada ratón que se va a diseccionar, cargue dos placas de Petri de 35 milímetros, una con tres mililitros de PBS y la otra con dos mililitros de solución de lisis fijadora recién hecha.Seleccione ratones que se sometan a la primera ola de espermatogénesis para observar una población enriquecida de interés. Después de sacrificar al ratón, limpie el abdomen con alcohol al 70% y luego proceda con la cirugía. Haga una abertura en forma de V en la cavidad pélvica abdominal y extraiga los testículos tirando de la almohadilla de grasa del epidídimo con pinzas, pero sin alterar la túnica albugínea.Transfiera los testículos a la placa que contiene PBS. Allí, se retira la túnica albugínea testicular perforando el tejido con pinzas afiladas y se recogen los túbulos seminíferos sueltos. A continuación, transfiera los túbulos a la placa con la solución de lisis fijadora y deje que la reacción continúe durante cinco minutos a temperatura ambiente.Durante la incubación, prepare un portaobjetos de vidrio recubierto de poli-L-lisina delineando los bordes del portaobjetos con un rotulador de líquidos y luego llenando el portaobjetos con 100 microlitros de solución de lisis fijadora dentro de los bordes. Después de la incubación de cinco minutos, use pinzas y tijeras estériles para separar y cortar suavemente los túbulos seminíferos para obtener segmentos individuales de 20 milímetros. A continuación, transfiera cinco segmentos de túbulos de 20 milímetros al portaobjetos preparado.A continuación, continúa dividiendo los segmentos en longitudes de 1,5 a tres milímetros con unas tijeras. Ahora, con las pinzas, coloque los segmentos de manera que no se superpongan. Distribúyalos uniformemente por el portaobjetos.Lo ideal es que un tobogán ocupe de 20 a 40 tramos cortos. Comience eliminando el exceso de líquido en la preparación del portaobjetos con un pañuelo absorbente. Ahora, aplique un cubreobjetos y aplaste los túbulos con la presión del talón de la palma de la mano durante 10 a 20 segundos.El objetivo es aplicar la fuerza suficiente para dispersar los espermatocitos de los túbulos seminíferos. Con un microscopio de disección, verifique que los segmentos hayan sido interrumpidos por la calabaza. Luego, vierta un poco de nitrógeno líquido en un pequeño Dewar y congele rápidamente el portaobjetos durante 15 segundos o hasta que el líquido deje de burbujear.Para continuar con el amino secante, retire inmediatamente el cubreobjetos con una punta o borde afilado. Aunque no es lo ideal, los portaobjetos congelados pueden conservarse inmediatamente a menos 80 grados centígrados y guardarse hasta dos semanas. Para quitar el cubreobjetos más tarde, sumerja los portaobjetos en nitrógeno líquido durante 15 segundos y haga palanca para quitar el cubreobjetos.Para proceder con el etiquetado de aminoácidos, lave los portaobjetos tres veces en PBS durante cinco minutos por lavado con un frasco Coplin de 50 mililitros. Después de los lavados, aplique un mililitro de tampón de dilución de anticuerpos en cada portaobjetos para que sirva como bloque. Deje que la reacción de bloqueo funcione durante una o dos horas en una cámara humidificada.Nunca permita que los portaobjetos se sequen durante este procedimiento. A continuación, golpee los portaobjetos sobre una toalla de papel para retirar suavemente el tampón y devolverlos a la cámara humidificada. Luego, aplique 100 microlitros de anticuerpo primario diluido a cada portaobjetos y transfiéralos a 40 grados Celsius, donde la reacción de unión puede durar toda la noche.Si la solución de anticuerpos es escasa, se puede usar la mitad del volumen si se cubre con un cubreobjetos o Parafilm. Al día siguiente, use tres lavados en PBS para eliminar el anticuerpo primario. A continuación, aplique 100 microlitros de anticuerpo secundario diluido y deje que esta reacción dure de una a una hora y media a temperatura ambiente.Para evitar el fotoblanqueo, mantenga los portaobjetos en una cámara oscura humidificada durante esta incubación. A continuación, lave los portaobjetos dos veces con PBS. Ahora, puntee las diapositivas con un medio de montaje que contenga DAPI.A continuación, selle los cubreobjetos con esmalte de uñas y proceda con la toma de imágenes. Para tomar imágenes, utilice un microscopio de epifluorescencia con una platina automatizada que permita un movimiento preciso del eje z. Utilice también una cámara de alta resolución para capturar imágenes.Ahora, evalúe las diapositivas usando un objetivo 20x. Determine la calidad de la preparación de la calabaza. Una calabaza de buena calidad tendrá una monocapa de núcleos que se distribuyen uniformemente.Algunas regiones de la calabaza pueden ser mejores que otras. Anote las coordenadas de las mejores regiones para encontrarlas fácilmente con un aumento mayor. Ahora, aumente el aumento hasta 100x.A continuación, capture imágenes de regiones señaladas que tengan una monocapa consistente de núcleos. Configure las pilas z superior e inferior para asegurarse de que se capture toda la luz enfocada. El número óptimo de pilas z generalmente es designado por el software de adquisición de imágenes y es diferente para cada objetivo.A partir de las imágenes, compile una imagen de profundidad extendida utilizando un software de procesamiento. El software combinará la luz enfocada de cada pila z, lo cual es esencial para obtener imágenes óptimas de las preparaciones de túbulos de calabaza. Utilizando el método de aplastamiento de túbulos descrito, se visualizaron poblaciones celulares transitorias que experimentan la transición de profase a metafase uno.Las poblaciones enriquecidas de espermatocitos de la metafase uno se visualizaron utilizando los anticuerpos contra la alfa tubulina. Para visualizar las células en la profase uno, las preparaciones de túbulos de calabaza se inmunomarcaron con un anticuerpo contra la proteína 3 del complejo sinaptonémico. Se identificaron espermatocitos con estadios de leptoteno, cigoto y paquiteno.Se utilizaron anticuerpos contra la quinasa del ciclo celular Aurora B para visualizar los eventos posteriores de la meiosis uno. Esta quinasa se localiza en el centrómero interno durante la metafase, luego se relocaliza en la zona media del huso durante la anafase y, finalmente, en el surco de escisión durante la citocinesis. Al mantener la integridad celular, la técnica de aplastamiento de túbulos permite la visualización de la organización subcelular en estructuras asociadas con la profase uno.La dinámica del ramillete cromosómico se puede seguir a través de la profase uno. También se puede visualizar la duplicación de los centriolos en la disyunción del centrosoma. En la etapa temprana de diploteno, se visualizaron espermatocitos sometidos a disyunción del centrosoma después de la duplicación del centriolo con anticuerpos contra pericentrina, un componente proteico de la matriz pericentriolar, y anticuerpos contra Centrin-3 para marcar centriolos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar rápidamente las características citológicas de los espermatocitos de ratón en desarrollo mientras se preserva la integridad celular. Una vez dominado, la disección a través del aplastamiento se puede lograr en menos de una hora por ratón. Al intentar este procedimiento, es importante recordar aplicar suficiente fuerza para dispersar los espermatocitos de los túbulos seminíferos.Además, la concentración del fijador y el tiempo de incubación se pueden optimizar en función de la estructura celular a estudiar. Con esta técnica se pueden implementar fácilmente estrategias de visualización alternativas, como los enfoques de peces de ADN y ARN. Al complementar las calabazas de los túbulos con ensayos bioquímicos posteriores, es posible evaluar los determinantes mecanicistas de una progresión meiótica exitosa.

a-seminiferous-tubule-squash-technique-for-cytological-analysis

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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