Un enfoque Simple para inducir Neuritis Autoinmune Experimental en ratones C57BL/6 para las evaluaciones funcionales y Neuropathological

Este informe describe un enfoque simple para inducir con éxito neuritis autoinmune experimental (EAN) utilizando la mielina proteína cero (P0)_180-199 péptido en combinación con adyuvante completo de Freund y toxina del pertussis. Presentamos un paradigma sofisticado capaz de evaluar con precisión la magnitud de los déficits funcionales y neuropatología que ocurren en este EAN.

El objetivo general de este procedimiento es inducir con éxito la neuritis autoinmune experimental o EAN en un modelo de ratón para el análisis funcional y patológico del proceso de la enfermedad. El modelo EAN se puede utilizar para abordar preguntas clave relacionadas con la neuropatía periférica. También es un modelo maravilloso para investigar potencialmente la eficacia de nuevos agentes terapéuticos.

La principal ventaja de este enfoque es que proporciona un paradigma de pruebas funcionales simple y objetivo que se puede aplicar cuando se utiliza el modelo EAN en el mouse. Haciendo una demostración del procedimiento conmigo hoy está Sang Won Yoo, quien es un estudiante de pregrado en el laboratorio de biología de neurotrofina y mielina de la Universidad de Melbourne. Tres días antes de la inducción de la enfermedad, encienda el aparato de evaluación de la función motora y encienda el botón de luz.

Levanta el ratón y bájalo sobre un recipiente de colorante alimentario rojo. Coloque el mouse en el compartimento para caminar y ajuste la velocidad de la cinta de correr a 15 centímetros por segundo. Encienda la cinta de correr y haga clic en grabar para usar el sistema de imágenes de la función de marcha para capturar el movimiento de carrera del mouse durante 36 segundos.

Después de 36 segundos, detenga la grabación y la cinta de correr y guarde el archivo de video de la carrera de práctica en la carpeta designada. Un día antes de la primera inmunización, utilice una jeringa de 0,5 mililitros equipada con una aguja de calibre 30-1/2 para administrar 1,6 microgramos por mililitro de toxina pertussis en 250 microlitros de PBS IP isotónico de ratón a ratones machos C57BL/6 anestesiados de seis a ocho semanas de edad. A continuación, puntúe a los ratones para determinar los signos clínicos de EAN en una escala de cero a cuatro de acuerdo con la tabla y realice una evaluación de la función motora como se acaba de demostrar.

Al día siguiente, combine volúmenes iguales de soluciones de péptido recién preparadas en solución salina al 0,9% y 20 miligramos por mililitro de Mycobacterium tuberculosis en un adyuvante completo de Freund en un abalorio y mezcle las soluciones a la velocidad máxima durante un minuto a temperatura ambiente. Cargue una jeringa equipada con una aguja de calibre 23 con el inóculo e invierta y agite la jeringa antes de evacuar el aire dentro del eje de la jeringa. Antes de aplicar el inóculo, retire el vello justo lateral a la línea media entre las escápulas y desinfecte la piel expuesta con etanol al 70%.

A continuación, utilice un par de pinzas de Adson para agarrar la piel y administrar 50 microlitros de la solución al ratón inyectado con toxina para la tos ferina mediante inyección subcutánea. A la mañana siguiente, administre 1,2 microgramos por mililitro de toxina de tos ferina en 250 microlitros de PBS IP, como se acaba de demostrar, seguido de otra inyección de 1,2 microgramos por mililitro de toxina de tos ferina IP 48 horas después. Tres días después de la tercera inyección de tos ferina, administrar otros 50 microlitros de inóculo recién preparado en el mismo lugar de inyección que antes y monitorizar la puntuación clínica y la función motora de los animales dos veces por semana hasta el final del experimento.

La EAN inducida por el péptido P0 180-199 en ratones C57BL/6 conduce a una enfermedad monofásica con un inicio de la puntuación clínica a partir de los seis días después de la primera inmunización y una gravedad máxima de la puntuación a los 25 días después de la primera inmunización, seguida de una cierta mejora de la puntuación clínica a los 40 días después de la primera inmunización. Los ratones comienzan a fallar en una tarea simple de correr tan pronto como seis días después de la primera inmunización, con poca capacidad para completar una tarea simple de correr en cinta a los 35 días después de la inmunización que no mejora en la capacidad de correr a los 55 días después de la primera inmunización. El examen de secciones semidelgadas de los nervios ciáticos de ratones EAN inducidos por péptidos revela áreas de desmielinización en comparación con los nervios ciáticos de controles sanos de la misma edad.

Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de alta potencia permiten la identificación de características neuropatológicas específicas, como la desmielinización, el daño a la lámina de mielina y los signos de estrés axonal, como la hinchazón mitocondrial. Estos animales también muestran daño axonal agudo, como lo demuestra la expresión de la proteína precursora de beta-amiloide traumáticamente elevada en los nervios ciáticos que no se observa en los tejidos de control sanos de la misma edad. También se observa un ensanchamiento de los nodos y una interrupción de los paranodos.

Una vez dominadas, las inyecciones subcutáneas se pueden realizar en unos cinco a 10 minutos por ratón con una probabilidad mínima de cualquier error de inyección. Al intentar este procedimiento, es muy importante que observe el lugar de la inyección para asegurarse de que todo el inóculo permanezca dentro del lugar de la inyección y que no se filtre nada. La captura de vídeo de la marcha en cinta rodante es estupenda porque permite calcular otros parámetros, como la fase de balanceo o la longitud de la zancada, y estas medidas pueden ser importantes a la hora de probar la eficacia de nuevas terapias.

Después de ver este video, debería tener una muy buena comprensión de cómo inducir EAN en ratones machos C57BL/6. Además, debe tener una muy buena comprensión de cómo colocar las inyecciones subcutáneas de forma segura y con mucha precisión, asegurándose de que no haya ningún error de inyección. No olvide que al trabajar con agujas e inóculo, existe la posibilidad de lesiones, especialmente cuando se usan objetos punzantes.

Por lo tanto, para evitar cualquier posibilidad de lesión, es una muy buena idea usar siempre las pinzas y nunca agarrar la piel o el tejido con la mano y también usar jeringas de un solo uso, nunca taponar en el proceso.