Name: Análisis de la respiración en tiempo real mediante el uso de ionización secundaria Nanoelectrospray acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprende a caracterizar la composición química del aire exhalado mediante nanoESI secundaria acoplada a espectrometría de masas de alta resolución. Este método no invasivo permite el diagnóstico temprano del cáncer de pulmón.

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Este trabajo ha sido apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Nº 91543117).

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1. establecer la fuente Sec nanoESI
<ol><li>Configurar una fuente Sec nanoESI según el proceso SESI, es decir, el gas de respiración se introduce para intersecar un penacho de electrospray e ionizado por las gotitas cargadas (figura 1). Las fuentes que construyó en los laboratorios individuales dependen de la interfaz del espectrómetro de masas utilizada24,25. Aquí, establecer la fuente Sec nanoESI basada en una fuente de nanoESI comercial (figura 2) e implementar a un espectrómetro de masas orbitrap con cuadrupolo benchtop. Nota: El cuerpo principal de la fuente es una cámara de acero inoxidable cúbica (longitud 25 mm, diámetro interior 13 mm) (figura 2b) con una entrada (ID 4 mm) para introducir el capilar nanoESI en la cámara. Así, la cámara no es completamente sellada (figura 2b).</li>
	<li>Instalar dos tubos de acero inoxidable (longitud 8 mm, diámetro exterior 5 mm, diámetro interior 3 mm) a cada lado de la cámara de suministro de gas.</li>
	<li>Equipar dos ventanas de cuarzo (diámetro interior 14 mm) en la parte superior e inferior de la cámara para comprobar la posición de la punta del capilar de nanoESI y nanoESI spray ya sea ojos o un microscopio digital.</li>
	<li>Soldar la cámara en el cono de barrido del espectrómetro de masas. Nota: El diseño puede cambiar dependiendo de la particular geometría de la interfaz de la presión atmosférica del espectrómetro de masas utilizado en los laboratorios individuales.</li>
</ol>2. optimización del instrumento
<ol><li>Calibrar el espectrómetro de masas en ambos modos de detección de iones positivos y negativos según las instrucciones del fabricante. Mediante la aplicación de calibración, parámetros de espectrómetro de masas, como objetivo potenciales y condiciones de detección, se optimizan para dar buena sensibilidad y forma de pico en un valor de resolución especificada. Aquí se utiliza la resolución total de 70000.<ol>
<li>Realizar calibraciones Q Exactive completadas mediante la fuente comercial de ESI; sin embargo, calibración de masas se puede realizar con cualquier fuente compatible, incluso personalizados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajustar la temperatura del tubo de transferencia de iones (ITT) de la espectrómetro de masa > 100 ° C. Aunque la temperatura más alta se puede fijar a 350 ° C, puede causar la descomposición de algunos compuestos. Así, 150° C se utiliza en este experimento. Nota: Para los espectrómetros de masas con un orificio de toma de muestras en lugar de ITT, del orificio de muestreo se ajusta la temperatura > 100 ° C.</li>
	<li>Para el tipo de solvente y flujo ESI, seleccione el disolvente ESI apropiado sobre la base de propiedades de solvente (por ejemplo, la polaridad y volatilidad) y compuestos específicos (e.g., afinidad protónica). Una mezcla de agua y metanol en diferentes proporciones se ha utilizado comúnmente como solvente ESI25. En este experimento, utilizan el agua que contiene el ácido fórmico 0,1% (v/v), eficiencia de ionización alta ha reportado este solvente13,19,23. Fijar el caudal de disolvente de la ESI en el rango de 0-1.5 μL/min y 200 nL/min. Nota: Degas ESI solventes por 30 min antes de su uso.</li>
	<li>Optimizar parámetros de fuente Sec nanoESI, principalmente nanoESI voltaje y posición de la punta capilar de nanoESI. La tensión habitualmente oscila entre 2.0 y 4.5 kV. Uso 2.5 kV aquí. Nota: Se aplica un voltaje más alto ESI como los aumentos de la tasa de flujo. La distancia entre la punta y el orificio del espectrómetro de masas puede ajustarse de 1 a 5 mm. Después de la optimización, el nivel de intensidad normalizada (NL) en un espectro de masas debe ser > 1 x 106 y la variación del cromatograma de iones totales (TIC) deben ser < 10% en ambos modos de detección de iones positivos y negativos. El espectro de masas y TIC se obtienen en el rango de masas de m/z 50-750.</li>
	<li>Aplique gas puro a la fuente. Este es un paso opcional, con el objetivo de reducir la influencia de compuestos orgánicos volátiles del aire interior. Gas nitrógeno de alta pureza (N2, 99.99%) o aire puro puede ser utilizado. Con la presencia de gas puro, el NL observada en un espectro de masas debe ser > 1 x 105 y la variación de las TIC deben ser < 10% en ambos modos de detección de iones positivos y negativos. Alta pureza N2 se usa aquí y entregado en 0,8 L/min. Nota: El caudal total de gas puro y aliento debe ser superior a la tasa de flujo a través del orificio del espectrómetro de masas.</li>
</ol>3. medición de aire espirado
<ol><li>Inhalar el aire interior y realizar una espiración normal que exhale todo el aire de los pulmones con un caudal constante. Monitorear la tasa de flujo de exhalación por un manómetro o un medidor de flujo visible al sujeto. Use tubería de teflón (PTFE) para entregar el gas de respiración23.<ol>
<li>Para evitar la condensación del vapor de agua dentro de la tubería, calentar el tubo a una temperatura de 80-100 oC7,23,27 o utilizar un Nafion secador28,29. En este experimento, el sujeto exhala en 0,4 L/min controlado por un medidor de flujo.</li>
		<li>Conecte la entrada del metro de flujo en una tubería de Nafion (longitud 60 cm) para remover el vapor de agua en el aire espirado y conectar la salida del metro de flujo en una tubería de PTFE (longitud 13 cm, diámetro interior 4 mm). Toma < 30 s para una medición de la exhalación.</li>
		<li>Realizar las mediciones replicadas de 4-628,29.</li>
		<li>Para minimizar los efectos de confusión, que los participantes de comer, beber y cepillarse sus dientes por lo menos 30 min antes de las mediciones23. Nota: Para minimizar la influencia de compuestos orgánicos volátiles del aire interior, se ha divulgado para inhalar gas puro en lugar de aire interior26. Cuando se utiliza una tubería de Nafion, se pueden perder algunos compuestos polares.</li>
		<li>Durante la medición, seguir comprobando si la intensidad de iones supera el límite de detección lineal del instrumento o no. La saturación de la señal puede conducir a un pico de artefacto que no resultan prácticamente de compuesto en la muestra. Inhalando por la nariz, se eliminaría parte del ambiente COV y partículas; sin embargo, cabe destacar que también se pueden detectar compuestos en los pasos nasales.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. obtener una huella de aliento y un rastro de tiempo de un compuesto
<ol><li>Obtener los cromatogramas y espectros de masas. Utilizar el software (por ejemplo, Xcalibur) registro cromatogramas y espectros de masas. Porque este es el análisis directo de MS y no separación cromatográfica se realiza, el cromatograma de iones totales (TIC) indica realmente la huella del tiempo de todas las señales detectadas en los espectros de masas y el cromatograma de iones extraídos (EIC) muestra la huella del tiempo de un compuesto especificada. Nota: Para otros espectrómetros de masas comerciales, los cromatogramas y espectros de masas pueden obtenerse el correspondiente software de adquisición de datos.</li>
	<li>Obtener una huella de respiración exhalada seleccionando una serie de exploraciones en las TIC cuando se mide la respiración exhalada. Obtener un espectro de masas que representa un promedio de estas exploraciones por el software.<ol>
<li>Para eliminar picos de fondo de la huella digital de la respiración, utilice la herramienta de fondo de restar en el software. Por favor consulte la guía del usuario suministrada por el fabricante. En Resumen, seleccione el mismo número de análisis cuando no se introduce muestra de aliento y restar el espectro de masas de fondo de la huella digital de la respiración. Nota: En este método, el umbral para identificar las características de la huella digital de la respiración se define como tres veces la desviación estándar de la señal de fondo. Otros espectrómetros de masa comerciales, de fondo se puede realizar por el software de adquisición de datos correspondiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Obtener un seguimiento de tiempo de un determinado compuesto. Seleccionar el pico de un objetivo compuesto en la huella de la respiración y el tiempo de rastro del compuesto es adquirida posteriormente por el software.</li>
</ol>

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<li>Garcia-Gomez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+amino+acids+in+the+exhalome+by+secondary+electrospray+ionization-mass+spectrometry%3A+A+proof-of-principle+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of amino acids in the exhalome by secondary electrospray ionization-mass spectrometry: A proof-of-principle Study.</a> Clin. Chem. 62 (9), 1230-1237 (2016).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Construcción de la fuente Sec nanoESI basada en una fuente de nanoESI comercial, la eficiencia de ionización es mayor que la de usar una fuente ESI30. Además, la eficacia de la ionización es mejorada en una cámara cerrada, como aislantes el proceso desde el aire ambiente de fondo y al mismo tiempo facilita la mezcla entre la muestra de gas y la nube de aerosol. Mediante el uso de un Sec-nanoESI, menos parámetros deben optimizarse en comparación con una fuente ESI, haciéndolo más fácil para la inst...

Con rápido desarrollo de técnicas analíticas modernas, se han identificado cientos de compuestos orgánicos volátiles (COV) en aire espirado humana1. Estos VOCs resultan sobre todo de aire alveolar (~ 350 mL en un adulto sano) y el espacio muerto anatómico del aire (~ 150 mL)2, que son afectadas por cuerpo metabolismo3,4,5,6,7 ,8 y9de la contaminación ambiental, respectivamente. Como resultado, si, estos VOCs son prometedores para utilizarse como biomarcadores para diagnóstico de enfermedades y la exposición ambiental de una manera no invasiva.
Cromatografía de gases espectrometría de masas (GC-MS) es la técnica más ampliamente utilizada para el análisis cualitativo y cuantitativo de exhalado COV2, técnicas directas de MS, que se han desarrollado para el análisis en tiempo real de la respiración, tienen las ventajas de hora de resolución y preparación previa de muestra simple. Técnicas directas de MS, como la reacción de transferencia de protones MS (PTR-MS)10, seleccionan tubo de flujo de iones MS (SIFT-MS)11, secundaria electrospray ionización MS (SESI-MS)12,13 (también nombrado como extractiva electrospray ionización, MS, MS EESI14,15), trace gas atmosférico analizador (TAGA)16 y plasma ionización MS (PI-EM)17 han sido investigados en años recientes.
Entre todas las técnicas de MS directas, SESI es conocido como una ionización suave universal técnica19,20,21; y la fuente es fácil de personalizar y junto a diferentes tipos de espectrómetros de masas, por ejemplo, el tiempo de vuelo espectrómetro de masas8,15, trampa de iones masa espectrómetro14 y orbitrap espectrómetro de masas12 ,18. Hasta ahora, SESI-MS ha utilizado con éxito en el diagnóstico de las enfermedades respiratorias22, medir el ritmo circadiano3,6,23, farmacocinética7,8, y revela caminos metabólicos4, etcetera. Más recientemente, se ha convertido una fuente comercial de SESI en disponible.
En este estudio, una fuente de ionización fácil y compacto nanoelectrospray secundaria (Sec-nanoESI) fue establecida y acoplada a un espectrómetro de masas de alta resolución. Se presentaron las mediciones en tiempo real de COVs exhalados en la respiración.

<table><tbody><tr><td>Agua ultrapura</td><td>Merck Millipore, EE. UU.</td><td>MPGP04001</td><td>Resistencia >18.2 M&Omega; &punto medio; cm</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>F0507</td><td>Corrosivo para las vías respiratorias.</td></tr><tr><td>Gas nitrógeno</td><td>Guangzhou Shiyuan Gas Co. Ltd., China</td><td>N.A.a</td><td>Pureza >99.99%</td></tr><tr><td>Q Espectrómetro de masas Exactivo híbrido cuadrupolo-orbitrap</td><td>Thermo Scientific, EE. UU</td>. <td>02634L (S / N)</td> <td>Tenga cuidado con la fuente NanoESI de alto voltaje y alta temperatura</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific, EE. UU</td><td>. ES002373 (S / N); ES071(P/N)</td><td>Tenga cuidado con la bomba Nano LC de alto voltaje y alta temperatura</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific, EE. UU.</td><td>5041.0010A(P/N)/</td><td></td></tr><tr><td>Software Xcalibur (versión 3.0)</td><td>Thermo Scientific, EE. UU.</td><td>BRE0008596</td><td>/</td></tr><tr><td>Dino-Lite Digital Microscope</td><td>Tech Video System (SuZhou) Co.Ltd., China</td><td>CQ401833R(S/N)</td><td>/</td></tr><tr><td>Tubería de Nafion</td><td>Perma Pure LLC, EE. UU.</td><td>ME60</td><td>/ </td></tr><tr><td>Tubo de PTFE (diámetro interno 4 mm)</td><td>Dongguan Hongfu Insulating Material Co. Ltd., China</td><td>N.A.</td><td>Cuidado con la posible pérdida de compuestos polares</td></tr><tr><td>Controlador de flujo másico</td><td>Line-Tech, Corea</td><td>M15122007 (S / N)</td><td>/</td></tr><tr><td>Medidor de flujo</td><td>Yuyao Industrial Automation Meter Factory, China</td><td>40784</td><td>/</td></tr><tr><td>aN.A.: no disponible.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de la respiración en tiempo real mediante el uso de ionización secundaria nanoelectrospray acoplada a espectrometría de masas de alta resolución

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhalado compuestos orgánicos volátiles (COV) han despertado un gran interés, ya que pueden servir como biomarcadores para el diagnóstico de la enfermedad y la exposición ambiental de una manera no invasiva. En este trabajo, presentamos un protocolo para caracterizar los COVs exhalados en tiempo real mediante el uso de ionización secundaria nanoelectrospray acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (s-nanoESI-HRMS). La fuente Sec nanoESI casera fácilmente nace basada en una fuente de nanoESI comercial. Se observaron cientos de picos en los espectros de masa fondo resta de aire espirado, y los valores de exactitud total son-4.0-13,5 ppm y-20.3-1,3 ppm en los modos de detección de iones positivos y negativos, respectivamente. Las cumbres fueron asignadas con la composición elemental exacta según la masa exacta y el patrón isotópico. Menos de 30 s se utiliza para la medición de una exhalación, y tarda aproximadamente 7 minutos para seis mediciones replicadas.

La figura 3 muestra las huellas de la respiración en el rango de masas de m/z 50-750 registrados en ambos modos de detección de iones positivos y negativos. picos de 291 (intensidad máxima &gt; 5.0x104) y 173 (intensidad máxima &gt; 3.0x104) se han observado en las huellas de respiración resta de fondo en los modos de detección de iones positivos y negativos, respectivamente. Para identificar picos en los espectros de masas, con...

Un protocolo para la caracterización de la composición química de la respiración exhalada en tiempo real mediante el uso de ionización secundaria nanoelectrospray junto a alta resolución, espectrometría de masas se demuestra.

Análisis de la respiración en tiempo real mediante el uso de ionización secundaria Nanoelectrospray acoplada a espectrometría de masas de alta resolución

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

El objetivo general de este experimento es caracterizar la composición química del aliento exhalado utilizando ionización secundaria por nanoelectrospray acoplada a espectrometría de masas de alta resolución. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina, como el diagnóstico temprano de enfermedades, el seguimiento terapéutico y la exposición ambiental. La principal ventaja de la técnica es que la medición se puede realizar en tiempo real.La técnica también es de mayor rendimiento, sensible, específica y fácil de usar. Las implicaciones de esta técnica se han extendido al diagnóstico del cáncer de pulmón. Debido a que se han encontrado posibilidades de candidatos a biomarcadores en el aliento exhalado de pacientes con caner pulmonar en diferentes etapas.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la fuente de ionización suele ser de fabricación conjunta. La demostración visual es fundamental, ya que aún no existe un protocolo estándar para este método. Para comenzar, configure una fuente secundaria de nano ESI de acuerdo con el proceso de ionización de electrospary secundario en el que se introduce gas de aliento

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Investigación

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Chemistry

Química

La ablación con láser de ionización electrospray (LAESI) es una fuente de iones a presión atmosférica para la espectrometría de masas. En el modo de imagen, una sonda láser en el infrarrojo medio de la distribución de moléculas a través de una sección de tejido o biofilm uno. Esta técnica presenta un nuevo enfoque para los diversos estudios bioanalíticos realizado bajo condiciones experimentales nativos.

Presión atmosférica de Imagen Molecular de los tejidos biológicos y biopelículas por LAESI Espectrometría de Masas

Análisis de las células individuales se realiza por espectrometría de masas en las células animales y vegetales a la presión atmosférica mediante el uso de una fibra óptica para afilado de la muestra de las células de ionización electrospray ablación con láser (LAESI) espectrometría de masas.

El análisis directo de las células individuales mediante espectrometría de masas a presión atmosférica

Secundaria ionización electrospray espectrometría de masas (SESI-MS) permite la detección de compuestos orgánicos volátiles (COV), sin necesidad de ningún tratamiento previo de la muestra. Este protocolo proporciona instrucciones para la rápida (en minutos) caracterización de compuestos orgánicos volátiles bacteriana con el SESI-MS.

La caracterización de compuestos volátiles bacteriana secundaria con ionización electrospray espectrometría de masas (SESI-MS)

Teniendo en cuenta las muestras de saliva para la aplicación clínica futura, una piruleta-como ultrafiltración (LLUF) de la sonda fue fabricado para encajar en la cavidad oral humana. El análisis directo de la saliva no digerida por nanoLC LTQ-espectrometría de masas ha demostrado la capacidad de las sondas LLUF para eliminar las proteínas grandes y proteínas de alta abundancia, y hacer poco abundantes péptidos más detectable.

Toma de muestras de saliva humana Peptidome indígenas que utilizan una sonda de ultrafiltración Lollipop-térmica: Simplificar y mejorar la detección de péptidos de Espectrometría de Masas clínica

El amoníaco es un metabolito fisiológico importante relevante para diversas enfermedades y estados de bienestar. También es una molécula difícil de medir en el aliento, lo que exige que se tomen precauciones particulares para obtener resultados precisos. No se conocen todos los factores que influyen en el amoníaco, pero el progreso puede ser difícil si no se tienen en cuenta estos factores.

Rápido y preciso exhalado Amoníaco Medición

Proton Transfer Reaction Time of Flight permite el análisis de compuestos orgánicos volátiles, rápido y no invasivo. Para demostrar su potencial, ponemos tres ejemplos: la fermentación láctica del yogur (monitorización on-line de bioprocesos), diferentes genotipos de manzana (cribado a gran escala) y el espacio retronasal tras beber café (análisis del espacio nasal).

PTR-ToF-MS combinado con un sistema automatizado de muestreo y análisis de datos a medida para estudios alimentarios: monitoreo de bioprocesos, tamizaje y análisis de la nariz y el espacio

Se presenta un método para la identificación de especies de material botánico mediante el análisis directo en bienes espectrometría de masas de alta resolución en tiempo y análisis estadístico multivariado.

Rápida de alto rendimiento Identificación de Especies de material botánico Uso del análisis directo en tiempo real de alta resolución Espectrometría de Masas

Espectrometría de masas en aerosol foliar es una técnica de análisis químico directo que reduce al mínimo la preparación de la muestra y elimina la cromatografía, permitiendo la detección rápida de pequeñas moléculas de los tejidos vegetales.

Espectrometría de masa de hoja aerosol: Una técnica rápida ionización ambiental evaluar directamente los metabolitos de los tejidos vegetales

Este protocolo describe un método simple para la adquisición de muestras de aliento de los niños. Brevemente, las muestras de aire mezclado previamente se concentran en tubos absorbentes antes del análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas. Biomarcadores de la respiración de las enfermedades infecciosas y no infecciosas pueden identificarse mediante este método de colección de la respiración.

Colección de aliento de los niños para el descubrimiento de biomarcadores de la enfermedad

En este artículo se presentan métodos de preparación de muestras para un método analítico único en tiempo real basado en la espectrometría de masas ambientales. Este método nos permite realizar análisis en tiempo real de las moléculas biológicas in vivo sin ningún pretratamiento especial.

Preparación de muestras para espectrometría de masas de ionización por electrospray de sonda

Aprende a caracterizar la composición química del aire exhalado mediante nanoESI secundaria acoplada a espectrometría de masas de alta resolución. Este método no invasivo permite el diagnóstico temprano del cáncer de pulmón.

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Análisis de la respiración en tiempo real mediante el uso de ionización secundaria Nanoelectrospray acoplada a espectrometría de masas de alta resolución

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