El nematodo Caenorhabditis Elegans - un modelo versátil en Vivo para el estudio de las interacciones huésped-microbio
18 de octubre de 2017
Aquí, presentamos el nematodo Caenorhabditis elegans como modelo para estudiar la interacción microbiana host versátil.
El objetivo general de este ensayo es observar el efecto de la infección fúngica en el organismo modelo C. Elegans. Este método puede ayudar a responder preguntas mecanicistas clave en el campo de las enfermedades infecciosas, como los factores de virulencia de los patógenos, los efectores inmunitarios del huésped, así como el descubrimiento de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un sistema manejable experimentalmente para estudiar las interacciones huésped-patógeno desde ambos puntos de vista.
Es un sistema rápido, fácil y rentable. Aunque este método en particular puede proporcionar información sobre los patógenos fúngicos, también se puede aplicar a otros agentes infecciosos, como bacterias o incluso múltiples organismos para estudiar las interacciones microbianas en un huésped vivo. Para hacer un pico de gusano, corte un trozo de alambre de aluminio de 1,5 centímetros y luego inserte con cuidado aproximadamente 0,5 centímetros del alambre en la punta de una pipeta pasteur.
Con un mechero Bunsen o una lámpara de alcohol, derrita la punta de la pipeta de vidrio girándola lentamente en la llama hasta que el alambre se adhiera firmemente a la pipeta sin comprometer la forma original de la punta de la pipeta. Finalmente, con pinzas, dobla con cuidado el extremo del alambre para crear un pequeño bucle. Para transferir rápidamente grandes cantidades de gusanos a nuevas placas, use una espátula para cortar un trozo de agar NGM que contenga los gusanos seleccionados.
A continuación, retire la pieza cortada y colóquela boca abajo en el borde del parche de OP50 en una placa nueva. Para transferir gusanos individualmente, flamee el alambre en el pico de gusanos hasta que esté rojo, luego retírelo de la llama y deje que se enfríe durante unos segundos. Con el alambre de la púa, raspe suavemente el parche del cultivo OP50 cultivado en la nueva placa, cubriendo el alambre de la púa.
El cultivo viscoso que cubre la punta del alambre hace que los gusanos se adhieran a la punta del pozo. Por lo tanto, use un movimiento de deslizamiento para recoger suavemente los gusanos seleccionados. Una vez que se hayan reunido los gusanos seleccionados, colóquelos en un plato nuevo deslizando suavemente el cultivo por el agar.
A continuación, coloque el alambre en la llama para eliminar los restos de cultivo de la púa. Coloque aproximadamente 20 animales adultos recogiéndolos o troceándolos en un plato con 50 microlitros de E. coli cepa OP50. Para recoger los huevos después de uno o dos días, inunde la placa con 10 mililitros de tampón M9.
Luego, con una pipeta serológica de vidrio, agite y agite suavemente el contenido en la placa de agar para liberar animales adultos o huevos adheridos a OP50. Recoja todo el líquido que contenga los huevos y los adultos. Transfiera la solución M9 y OP50 a un tubo cónico de 15 mililitros.
Centrifugar el tubo a 2,100 x g durante dos minutos. A continuación, aspire aproximadamente nueve mililitros de sobrenadante sin alterar el pellet. A continuación, utilice dos mililitros de agua estéril, un mililitro de lejía y un mililitro de hidróxido de sodio 0,25 molar para resuspender el pellet.
Mezclar suavemente por inversión hasta que aproximadamente el 70% de los animales adultos parezcan lisados. Por lo general, los huevos permanecen intactos durante este breve tratamiento de blanqueo debido a su cáscara. Es fundamental que se limite la cantidad de exposición a la lejía en este paso.
La exposición prolongada a la lejía destruirá los huevos. Si la preparación del huevo falla, limite la duración de la exposición a la lejía o diluya la solución. Centrifugar el tubo cónico a 990 x g durante dos minutos.
Aspire el sobrenadante sin alterar el pellet. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de tampón M9. Después de volver a girar y eliminar el sobrenadante sin alterar el pellet, use 200 microlitros de tampón M9 para volver a suspender el pellet.
Dispense de tres a cinco mililitros de YPD en un tubo de ensayo estéril y use un asa estéril para inocularlo con una sola colonia de Candida albicans. Coloque el tubo en un tambor giratorio a 30 grados centígrados durante aproximadamente 16 a 18 horas. Etiquete un tubo de microfuga de 1,5 mililitros para que contenga C. albicans y otro para que contenga OP50, luego registre el peso de cada tubo vacío.
Transfiera 500 microlitros del cultivo de C. albicans durante la noche al tubo etiquetado como C. Albicans. Y 1500 microlitros del cultivo OP50 durante la noche en el tubo etiquetado como OP50. Centrifugar los tubos durante 10 minutos a 16, 100 x g, luego aspirar el sobrenadante sin alterar los gránulos.
Utilice 500 microlitros de agua estéril para resuspender cada pellet. A continuación, centrifugar los tubos a 16,100 x g durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante sin alterar los pellets.
A continuación, registre el peso final de los tubos de microfuga. Determine el peso de cada pellet restando el peso inicial de los tubos de microfuga del peso final. Con agua estéril, vuelva a suspender el pellet de C.albicans a 10 miligramos por mililitro y el pellet OP50 a 20 miligramos por mililitro.
A continuación, haga una mezcla maestra de infección combinando 10 microlitros de una solución de 50 miligramos por mililitro de estreptomicina. 2,5 microlitros de cultivo de OP50. 0,5 microlitros de cultivo de C.Albicans y 7 microlitros de agua estéril.
Para las placas de control, cree una mezcla maestra reemplazando el volumen de cultivo de C. albicans con agua estéril. A continuación, utilice una micropipeta para sembrar 20 microlitros de mezcla de infección o solución de control OP50 en el centro de las placas NGM. Después de preparar los huevos como se demostró anteriormente en este video, cuente los huevos bajo el endoscopio de disección.
Y use M9 para diluir la solución de huevo hasta lograr una concentración de aproximadamente cinco a seis huevos sanos por microlitro. Con una pipeta, dispense una muestra de 20 microlitros que contenga aproximadamente 30 huevos en una placa NGM preparada en el área entre el cultivo bacteriano y el costado de la placa. Incubar las placas a 20 grados centígrados durante 48 horas.
Luego, bajo un microscopio de disección, cuente el número de gusanos adultos vivos y muertos en cada placa, considerando al animal muerto si no responde a ser golpeado en la cabeza por un alambre de aluminio o golpea la placa. También cuente el número de gusanos con Dar y confirme si un animal tiene Dar golpeando rápidamente la placa en la etapa del microscopio de disección.
Los animales sin Dar se moverán hacia atrás inmediatamente, mientras que los animales con Dar necesitarán rondas repetidas de golpecitos para revertir su dirección o no lo harán en absoluto. Cada dos días, transfiera los gusanos adultos restantes recogiendo los gusanos en una nueva placa de infección o control. En este punto, si es necesario, realice un ensayo de supervivencia mediante el seguimiento de la cantidad de gusanos vivos, muertos y faltantes cada día.
Es importante transferir los gusanos cada dos días como mínimo. Esto asegura que los gusanos adultos que se están puntuando en este ensayo no se confundan con su progenie. Los C. elegans fueron expuestos a C. albicans durante un período de seis días y se observaron signos de infección, progresión de la enfermedad y muerte.
El fenotipo Dar es más visible en el cuarto día del ensayo de supervivencia, como se observa por una región anal protuberante que no es visible en el animal no infectado. También se sabe que los gusanos infectados por C. albicans presentan hinchazón en la región de la vulva. En ambos casos, el gusano es incapaz de eliminar la infección después de alcanzar esta etapa.
Con el fin de visualizar la colonización de C. Albicans en el lumen intestinal, se alimentó con gusanos C. albicans de tipo salvaje marcados con RFP que hacen que las áreas de colonización emitan fluorescencia roja. C. albicans coloniza la luz intestinal al tercer día del ensayo. Como se muestra aquí, los gusanos infectados mostraron una distensión intestinal más severa que la observada en el control no infectado.
En este experimento, se probó la capacidad de los gusanos para sobrevivir a la infección causada por el doble mutante virulento C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1. Los gusanos infectados con el doble mutante viven estadísticamente significativamente más tiempo que los controles. Lo que sugiere que estos dos genes son necesarios para la virulencia de C. albicans contra C. Elegans.
Una vez dominada, cada parte de esta técnica se puede hacer en una o dos horas cada día de la vida útil del gusano. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que uno podría estar usando agentes infecciosos. Por lo tanto, se deben practicar las precauciones de bioseguridad adecuadas.
Se pueden hacer modificaciones menores a este procedimiento básico, como la introducción de agentes microbianos adicionales para estudiar las interacciones microbianas en el contexto de un huésped vivo. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades infecciosas exploraran la virulencia microbiana, los mecanismos de las respuestas inmunitarias innatas del huésped, así como el descubrimiento de nuevos agentes antimicrobianos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo mantener y manipular C. Elegans y usar el organismo para estudiar las interacciones entre los microbios del huésped a nivel molecular.
No olvide que trabajar con patógenos microbianos y reactivos químicos, como la azida de sodio, puede ser peligroso y se deben emplear precauciones de seguridad adecuadas, como EPP y métodos de eliminación de desechos.
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Descripción general
Este estudio presenta al nematodo Caenorhabditis elegans como un modelo de huésped versátil para investigar interacciones microbianas, centrándose especialmente en infecciones fúngicas. El método permite a los investigadores explorar preguntas mecanicistas clave en enfermedades infecciosas, incluyendo la virulencia del patógeno y las respuestas inmunitarias del huésped.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Interacciones microbianas
- Investigación sobre enfermedades infecciosas
- Dinámicas huésped-patógeno
Antecedentes
- Caenorhabditis elegans sirve como un organismo modelo eficaz.
- El estudio tiene como objetivo comprender los efectos de las infecciones fúngicas.
- Este modelo también puede adaptarse para otros agentes infecciosos.
- Proporciona un sistema rentable y manejable para la experimentación.
Objetivo del estudio
- Observar los efectos de la infección fúngica en C. elegans.
- Investigar los factores de virulencia del patógeno.
- Explorar los efectores inmunitarios del huésped y el descubrimiento de fármacos.
Métodos Utilizados
- Ensayo para observar los efectos de la infección fúngica.
- Uso de C. elegans como modelo de huésped.
- Configuración experimental para estudiar las interacciones entre huésped y patógeno.
- Técnica de selección de gusanos utilizando alambre de aluminio y pipeta.
Resultados principales
- Conocimientos sobre patógenos fúngicos y sus interacciones con los huéspedes.
- Comprensión de las respuestas inmunitarias del huésped frente a infecciones.
- Aplicaciones potenciales en el descubrimiento de fármacos.
- Marco para el estudio de diversos agentes infecciosos.
Conclusiones
- C. elegans es un modelo valioso para la investigación de enfermedades infecciosas.
- El método es adaptable para estudiar múltiples patógenos.
- Este enfoque mejora la comprensión de la dinámica huésped-patógeno.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Caenorhabditis elegans proporciona un modelo in vivo escalable y rentable para reducir riesgos en estudios de interacciones huésped-microbio durante las fases iniciales del descubrimiento. Su anatomía transparente y su inmunidad innata conservada permiten la investigación mecanicista de factores de virulencia y vías de defensa del huésped, lo que respalda la confianza predictiva en la validación de dianas. Este sistema sirve de puente entre el cribado fenotípico y el descubrimiento de biomarcadores traslacionales para la identificación de compuestos activos antifúngicos y antibacterianos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de genes de virulencia microbiana como EFG1 y CPH1 en Candida albicans mediante ensayos de supervivencia.
- Valor operativo: Facilita cribados de genoma completo de alto rendimiento para identificar mutantes del huésped o del patógeno con virulencia alterada.
- Valor estratégico: Facilita la reducción del riesgo de dianas al vincular perturbaciones genéticas con fenotipos de supervivencia medibles en un contexto de organismo completo.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Permite la cuantificación de la colonización por patógenos mediante etiquetado fluorescente (por ejemplo, C. albicans marcada con RFP) en la luz intestinal.
- Valor operativo: Utiliza lecturas estandarizadas de supervivencia (puntuación de vida/muerte, fenotipo Dar) para la ejecución reproducible del ensayo en intervalos de 48 horas.
- Valor estratégico: Permite el cribado de inhibidores químicos o bibliotecas genéticas para descubrir compuestos antifúngicos o factores de virulencia.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Modela respuestas conservadas de la inmunidad innata del huésped, incluida la producción de especies reactivas de oxígeno dependiente de la doble oxidasas, relevantes para la defensa mucosal en mamíferos.
- Valor operativo: La capacidad de criopreservación garantiza la disponibilidad prolongada de cepas, reduce la variabilidad y permite diseños de estudios longitudinales.
- Valor estratégico: Apoya decisiones de avance con ajuste de riesgo al validar la esencialidad del blanco en la virulencia del patógeno antes de invertir en modelos mamíferos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir la validación fenotípica de dianas identificadas mediante cribado genómico o químico, con aplicabilidad directa a campañas de identificación de compuestos líderes.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre interacciones huésped-patógeno mediante resultados medibles, como la cinética de supervivencia y la obtención de imágenes de colonización.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles, incluyendo curvas de supervivencia e intensidad de fluorescencia, para la comparación de compuestos o genotipos.
- Análisis: Genera puntos finales estadísticos (por ejemplo, supervivencia mediana, % de gusanos positivos para Dar) que permiten la priorización de resultados positivos y la modelización de relaciones estructura-actividad.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos mediante vías inmunitarias conservadas (por ejemplo, generación de ERO) que reflejan los mecanismos de defensa epitelial de los mamíferos.
- Reutilización Empresarial: La adaptabilidad de la plataforma a infecciones bacterianas, fúngicas y polimicrobianas favorece su reutilización en múltiples programas de enfermedades infecciosas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en estudios de virulencia e inmunidad mediante la visualización directa de la colonización intestinal y el seguimiento en tiempo real de la supervivencia.
- Valor operativo: El bajo costo, el corto tiempo de generación y la aptitud para la automatización aumentan el rendimiento y reducen el gasto de recursos por ensayo.
- Valor estratégico: Mejora la confianza en las decisiones de avance o descarte al proporcionar una validación ortogonal de dianas en un contexto de huésped fisiológicamente relevante.
- Impacto en la cartera: Permite la selección temprana de candidatos antimicrobianos al filtrar compuestos que carecen de eficacia en un modelo de infección en huésped completo.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en el manejo de C. elegans, cultivo microbiano y microscopía de fluorescencia para la preparación y evaluación del ensayo.
- La preparación estandarizada de placas de NGM, la siembra del césped bacteriano y la sincronización de los gusanos garantizan la reproducibilidad entre los experimentos.
- Es necesaria una contención de bioseguridad (BSL-2) al trabajar con microorganismos patógenos como C. albicans.
- La sensibilidad del ensayo puede verse limitada por la etapa de desarrollo del gusano y la variabilidad de la fuente alimenticia bacteriana, lo que requiere protocolos estrictos de sincronización.
- Aunque es aplicable a múltiples patógenos, se necesita optimizar las condiciones de infección (por ejemplo, inóculo, temperatura) para agentes no fúngicos.
