Name: El nematodo Caenorhabditis Elegans - un modelo versátil en Vivo para el estudio de las interacciones huésped-microbio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Aprende a estudiar infecciones fúngicas en Caenorhabditis elegans como modelo huésped versátil. Este método permite investigar factores de virulencia, respuestas inmunes y descubrimiento de fármacos de forma rápida y económica.

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Este trabajo fue realizado en y apoyado por el Instituto Politécnico de Worcester.

1. preparación de medio de crecimiento nematodo (NGM) <ol><li>para 1 L de medios de comunicación combinan agar 20 g, 2,5 g fuente de nitrógeno orgánico (e.g., bacto-peptona) y 3 g de cloruro de sodio en un matraz de 2 L. Añadir 975 mL de agua estéril.
	<ol><li>Agregar en una barra de agitación estéril. Si se utiliza un dispensador automático de medios de comunicación, tubería de autoclave y media durante 15 min; los medios de comunicación deben ser esterilizado para ya si es un volumen más alto.</li>
	</ol></li> <li>Establecer los medios de comunicación en remover la placa y deje para enfriar.
	<ol><li>Una vez que los medios de comunicación está caliente al tacto (aproximadamente 60 ° C) asépticamente añada 1 mL de 1 M MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 mL de 1 M de CaCl 2, 25 mL de KPO 4 y 1 mL de colesterol de 0,5% en etanol.</li>
		<li>Vierta media (manualmente o por bomba automática) bajo flujo laminar en 35 x 10 mm placas de petri estériles. Deje que se seque bajo campana por 1-2 días antes de su uso. 
		Nota: Las placas deben guardarse a 4 ° C para evitar la contaminación.</li>
	</ol></li></ol> 2. Hacer un gusano Pick <ol><li>corte un pedazo de 1,5 cm de alambre de aluminio. Cuidadosamente Inserte la punta de una pipeta Pasteur aproximadamente 0,5 cm de esta longitud.
	<ol><li>Usando un quemador de Bunsen o lámpara de alcohol, fundir la punta de la pipeta de cristal girando lentamente en la llama hasta que el alambre se adhiere firmemente a la pipeta, sin comprometer la forma original de la punta de la pipeta.</li>
	</ol></li></ol> 3. Preparación de la cultura de e. coli <ol><li>utilizando un asa estéril, inocular una colonia de e. coli cepa OP50 en 200 mL de caldo Luria. Incubar durante una noche con agitación a 37 ° C.</li>
	<li>El cultivo líquido está listo para usar al día siguiente y pueden ser almacenada a 4 ° C cuando no esté en uso. 
	Nota: La cepa de e. coli, OP50, se utiliza como fuente de alimento para C. elegans. Este cultivo puede ser utilizado por hasta varios meses si se almacena a 4 ° C.</li>
</ol> 4. Esencial C. elegans mantenimiento <ol><li>semilla preparada las placas de agar NGM con e. coli por manchas aproximadamente 50-100 μl de preparados OP50 cultivo líquido en el centro de la placa de.</li>
	<li>Placas y déjelos secar a temperatura ambiente durante 24 h. Una vez seco, colocar las placas a 37 ° C durante la noche para un rápido crecimiento o mantener a temperatura ambiente, si se desea un crecimiento más lento.</li>
	<li>Añada gusanos a la placa o &#34; trozos, &#34; (ver protocolo paso 5 &#34; Chunking y recogiendo gusanos &#34;), recogiendo gusanos individualmente o colocar huevos de gusano directamente sobre la placa (ver protocolo paso 6 &#34; huevo preparación &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking y recogiendo gusanos Nota: &#34; trozos, &#34; se refiere a una práctica que es común en el mantenimiento de C. elegans. Se trata de cortar una sección de la placa de agar NGM que contiene gusanos y así también transferir esta pieza en un plato nuevo, transferir un gran número de gusanos en el proceso. La contaminación también puede cortar de la placa de esta manera. Cuando recogiendo gusanos, es importante mantener la integridad del agar porque gusanos pueden ser perdidos en los agujeros en el agar. Además, es importante permitir que la hoja se enfríe antes de tocar la placa para evitar fundir el agar o quema los gusanos.
<ol><li>Para transferir rápidamente grandes cantidades de gusanos en las nuevas placas, cortar un trozo de agar NGM que contiene las lombrices seleccionadas con una espátula. Retirar la pieza cortada y poner cara abajo en el borde del césped de OP50 en un plato nuevo.</li>
	<li>Transferencia de gusanos individualmente como se describe a continuación en el paso de protocolo 8.2, &#34; Análisis de la supervivencia, &#34; utilizando un gusano pick. La llama el alambre en la recogida del gusano hasta que esté rojo. Retire del fuego y deje que se enfríe durante unos segundos.</li>
	<li>Con el cable en la selección, raspar suavemente el césped de la cultura OP50 crecido en la placa de nuevo, cubriendo el hilo en el pico.</li>
	<li>La cultura viscosa que cubre la punta del alambre hace gusanos se pegan a la punta de la ganzúa, así suavemente recoger gusanos seleccionados con un movimiento de swiping.</li>
	<li>Una vez que las lombrices se reúnen, colocarlos en un plato nuevo deslizando suavemente la cultura en el agar. Coloque el alambre en la llama para eliminar la cultura restantes en la selección.</li>
</ol> 6. Preparación del huevo <ol><li>colocar aproximadamente 20 animales adultos (aproximadamente 2-3 días después de la eclosión, cuando se cultiva a 20 ° C) por cosecha o por trozos como se describe en el paso 5, de protocolo &#34; Chunking y recogiendo gusanos, &#34; en una placa sembrada con 50 Μl de cepa de e. coli, OP50.</li>
	<li>a recoger los huevos, inundar la placa con 10 mL de buffer M9 después de 1-2 días. Utilizando una pipeta serológica de vidrio, agitar y agitar suavemente el contenido sobre la placa de agar para lanzar huevos atascados OP50 o animales adultos. Recoger todo el líquido que contiene los huevos y adultos.</li>
	Tubo de <li>solución de transferencia M9 y OP50 en un cónico de 15 mL. Centrifugar el tubo cónico de 15 mL a 2.100 x g durante 2 min</li>
	<li>Aspirar aproximadamente 9 mL del sobrenadante sin perturbar el pellet OP50.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 2 mL de agua estéril, 1 mL de blanqueador y 1 mL de NaOH M 0.25.</li>
	<li>Mezclar suavemente por inversión hasta que la mayoría (aproximadamente el 70 por ciento) de los animales adultos aparece sometidas a lisis, por lo general, huevos permanecen intactos durante este tratamiento blanqueador corto debido a su cáscara. Centrifugar el tubo cónico a 990 x g durante 2 min</li>
	<li>Aspirar sobrenadante sin perturbar el pellet. Resuspenda el sedimento en 10 mL de buffer M9.</li>
	<li>Centrifugar el tubo cónico en 990 x g para 2 min aspirar sobrenadante sin pellets inquietante. Vuelva a suspender los pellets con 200 μL de buffer M9. 
	Nota: La preparación de huevo puede requerir múltiples ensayos. Huevos pueden ser destruidos si se exponen para blanquear demasiado. Si no salen de los huevos, disminuir la concentración de cloro en solución o disminuir la duración de la exposición a bleach.</li>
</ol> 7. Instalación de placa de infección <ol><li>distribuir 3-5 mL de YPD en un tubo de ensayo estéril y sembrar con una sola Colonia de Candida albicans utilizando un asa estéril.
	<ol><li>Coloque el tubo en un tambor rotatorio para aproximadamente 16-18 h a 30 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Etiqueta un 1,5 mL tubo de microcentrífuga para contener C. albicans y otro para contener OP50. Registrar el peso de cada tubo de vacío.
	<ol><li>Lugar 500 μl de la noche a la mañana cultura de C. albicans en el tubo con la etiqueta C. albicans y 1.500 μl de la noche a la mañana OP50 cultura (paso 3.1) en el tubo etiquetado OP50.</li>
		<li>Centrifugar 10 min a 16.100 x sobrenadante de aspirado g. sin pellets inquietante.</li>
		<li>Resuspender cada pellet con 500 μl de agua estéril. Centrifugar durante 5 min a 16.100 x g.</li>
		<li>Aspirar sobrenadante sin perturbar el pellet. Registrar el peso final de los tubos del microfuge.</li>
		<li>Determinar el peso de cada pellet restando el peso inicial de los tubos de microcentrífuga del peso final.</li>
	</ol></li> <li>Con agua estéril, Resuspender el pellet de C. albicans a 10 mg/mL y el sedimento OP50 a 200 mg/mL. Hacer una infección principal mezcla combinando 10 μl de una solución de 50 mg/mL de estreptomicina, 2.5 μl de cultivo OP50, 0,5 μl del cultivo de C. albicans y 7 μl de agua estéril.
	<ol><li>Para las placas de control, crear una mezcla principal reemplazando el volumen de la cultura de C. albicans con agua estéril. De semilla de 20 μl de mezcla de infección o solución de control OP50 sobre las placas del centro de NGM utilizando una micropipeta. 
		Nota: Se necesitan aproximadamente 100 gusanos para determinar significación estadística durante el análisis. Este ensayo se ejecuta normalmente por triplicado. Por lo tanto, se hace un 3.2 x mezcla de infección, así como a 3.2 x solución de control. Estas mezclas se hacen para ser un poco sobre 3 x el original para asegurarse de que se siembra un total de 20 μl en cada plato, permitiendo espacio para error. Esta mezcla principal se crea porque la faringe del gusano es insuficiente durante las primeras etapas larvales (L1-L3) consumir C. albicans. La exposición a agentes farmacológicos como el fluconazol ( figura 3B), el agente se introduce en la mezcla de la infección. Empíricamente se determina la concentración del agente. Por ejemplo, en la figura 3B, 50 μm fluconazol está representado, sin embargo 0, 12,5, 25, 50 y 100 μm fluconazol también fueron probados usando el mismo protocolo de.</li>
	</ol></li></ol> 8. Análisis del fenotipo de deforma la región Anal (Dar) y análisis de supervivencia <ol><li>Visualize el fenotipo de Dar Nota: Dar mejor se visualiza en la fase L3 y más allá. Dar se presenta como una pequeña protuberancia en la región anal post del gusano ( figura 2A), que llega a ser más prominente con el tiempo.
	<ol><li>Confirmar si un animal tiene Dar rápidamente tocando la placa en la etapa del microscopio de disección, animales sin Dar voluntad mover hacia atrás inmediatamente, mientras que animales con Dar cualquier necesidad repetidas rondas de tapping para invertir su dirección, o no lo hará en todo.</li>
	</ol></li> <li>Análisis de supervivencia <ol><li>preparación de huevo completo, como se describió anteriormente en el paso del Protocolo 6, &#34; huevo preparación &#34;. Contar los huevos bajo el alcance de la disección y diluir la solución de huevo con M9 hasta alcanza una concentración de aproximadamente 5-6 huevos sanos por μl. Utilizando una pipeta, dispensar 20 μl de muestra que contenga aproximadamente 30 huevos en plato NGM preparado, en el área entre el cultivo bacteriano y el lado de la placa (huevos y comida de gusano, OP50, están en dos lugares distintos).</li>
		<li>Incubar las placas a 20 ° C durante 48 h. Debajo de un microscopio de disección, cuenta el número de gusanos vivos y muertos adultos en cada plato, así como el número de gusanos con Dar. Registrar el porcentaje con Dar.</li>
		<li>Considerar un animal muerto si no responde al ser golpeada en la cabeza por un alambre de aluminio o golpear ligeramente en la plancha.</li>
		<li>Día, transferencia gusanos adultos restantes por selección como se describe en el paso 5, de protocolo &#34; Chunking y recogiendo gusanos, &#34; en un plato nuevo de infección o control. En este punto, si es necesario, realizar un análisis de supervivencia mediante el seguimiento del número de gusanos vivos, muertos y desaparecidos cada día. 
		Nota: Este ensayo puede funcionar durante dos semanas, comenzando con la preparación de huevo. Además, la solución de huevo debe no distribuirá en el cultivo bacteriano, como la solución puede contener trazas de cloro que puede matar el OP50. La solución también debe ser despachado aproximadamente 0,5 cm del borde de la placa, como huevos pueden atorarse entre los lados de la placa y el agar. Además, debido a la rápida proliferación de gusanos adultos en nuevas placas de transferencia es fundamental para separarlos de su progenie.</li>
	</ol></li> <li>Analizar la supervivencia <ol><li>analizar los resultados utilizando el software de análisis de curva de supervivencia (véase lista de materiales).</li>
		Curvas de <li>compara la supervivencia mediante el método de Breslow-Grehan-Wilcoxon (suponiendo que los datos de los primeros tiempos de supervivencia son más precisos que tiempos posteriores, los datos de peso por consiguiente) así como herramientas estadísticas de rango logarítmico 45. 
		Nota: Por ejemplo, en la Figura 4B -C, la supervivencia de gusanos tratados con mutantes de C. albicans es comparada con aquellos tratados con controles de tipo salvaje isogénicas o complementarystrains.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos de ensayo de infección de C. elegans y supervivencia sobre exposición de por vida a C. albicans que hemos descrito pueden ser modificados para probar otro patógeno. Cultivos líquidos de otra bacteria u hongo pueden hechos y alimenta a C. elegans de manera similar. Además, pueden ensayarse la serie infecciones exponer primero la larva a un patógeno como se describe, y luego transferir los animales en un nuevo plato que contiene un patógeno independiente después de alcanzar la edad ad...

C. elegans se ha utilizado como organismo modelo de gran alcance para más de 50 años. En la década de 1960, biólogo sudafricano Sydney Brenner pionero en el uso de C. elegans a estudiar desarrollo neuronal, allanando el camino para un largo linaje de científicos para estudiar diversos aspectos de la biología celular y animal de nematodos. Este linaje incluye a galardonados con el Premio Nobel Craig Mello y Andrew Fire para su trabajo de ARNi1, Robert Horvitz y John Sulston por su trabajo en el desarrollo de órganos y apoptosis2,3,4, Martin Chalfie por sus trabajos sobre la proteína fluorescente verde5. Aunque este organismo modelo se ha utilizado tradicionalmente para el estudio de biología molecular y del desarrollo, en los últimos 15 años, los investigadores han comenzado a utilizar C. elegans para investigar la biología de los patógenos humanos diversos incluyendo Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericay Serratia marcescens6,7,8,9,10. Estos estudios revelaron que muchos de los mecanismos implicados en la interacción de patógenos humanos se conservan en nemátodos, pero también que hay algunos mecanismos de inmunidad que son exclusivos de este organismo modelo11,12. En la naturaleza, C. elegans se encuentra con una variedad de amenazas de los agentes patógenos presentes en el suelo y esto ha proporcionado una fuerte presión selectiva para evolucionar y mantener un sistema inmune innato sofisticado en su lumen intestinal. Muchos de los genes y mecanismos involucrados en la protección de la luz intestinal están orquestados por elementos altamente conservadas que también existen en los mamíferos superiores11,13. C. elegans , por tanto, representa un gran modelo para el estudio de patógenos gastrointestinales como Salmonella enterica14, Shigella boydii15o16de cólera del vibrión.
Aquí destacamos la notable versatilidad de C. elegans como anfitrión modelo para el estudio de agentes infecciosos tales como C. albicans. C. elegans como anfitrión modelo permite la detección de alto rendimiento de virulencia que es menos costoso y desperdiciador de tiempo que un modelo de ratón, que se utiliza comúnmente para el estudio de la candidiasis42.
En este estudio, mostramos que este modelo y el análisis de supervivencia assosiated pueden ser confiablemente utilizados para estudiar efectores inmune innata del huésped importantes para contrarrestar infecciones, determinantes patógenos que virulencia, y compuestos farmacológicos que pueden intervienen en la patogénesis. Diferentes ensayos anteriormente descritos, este método proporciona un medio de estudiar la exposición a un patógeno durante la vida del animal, desde el estado larvario a la edad adulta, en lugar de sólo la edad adulta a muerte43,44. En Resumen, nuestro C. elegans - modelo de C. albicans es una herramienta versátil y poderosa que puede utilizarse no sólo para estudiar las bases genéticas que conducen a la infección y la inmunidad, sino para identificar nuevos compuestos para la intervención terapéutica.

<table><tbody><tr><td>Agar (granulado, grado bacteriológico)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de aluminio (95% Pt, calibre 32)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido Axiovision Zeiss</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans cepa Bli-3</td><td>Caenorhabditis Centro de Genética</td><td>Bli-3(e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol, grado Sigma, mínimo 99%</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo desechables (20 x 150 mm)</td>Microscopio de disección <td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>(Iluminador de alta intensidad NI-150)</td><td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Caenorhabditis Centro de Genética</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Prisma GraphPad (Software de análisis de curvas de supervivencia)</td><td>Software GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caldo LB (Miller's)</td><td>Productos Apex BioResearch</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri medianas (35 x 10 mm)</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353001</tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. albicans SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

el nematodo caenorhabditis elegans - un modelo versátil en vivo para el estudio de las interacciones huésped-microbio

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Demostrar un método usando Caenorhabditis elegans como anfitrión modelo para estudiar la interacción microbiana. Microbios se introducen a través de la dieta haciendo que el intestino la ubicación primaria de la enfermedad. El intestino nemátodo estructural y funcionalmente imita los intestinos mamíferos y es transparente lo que es susceptible de estudio microscópico de la colonización. Aquí mostramos que el patógeno pueden causar enfermedad y muerte. Somos capaces de identificar a mutantes microbianos que muestran alteración de la virulencia. Su respuesta innata conservado a estreses bióticos hace C. elegans un excelente sistema para sondear facetas de interacción inmune innata de host. Mostramos que hosts con mutaciones en el gen de la oxidasa dual no pueden producir especies reactivas de oxígeno y son incapaces de resistir el insulto microbiano. Además demostramos la versatilidad del ensayo de supervivencia presentado mostrando que puede ser utilizado para estudiar los efectos de los inhibidores del crecimiento microbiano. Este ensayo también puede ser usado para descubrir factores de virulencia de hongos como dianas para el desarrollo de nuevos antifúngicos, así como proporcionar una oportunidad para descubrir otras interacciones host-microbio. El diseño de este ensayo presta bien a alto rendimiento pantallas de todo el genoma, mientras que la capacidad de gusanos de crio-conservar para uso futuro, es un modelo rentable y atractivo todo animal para el estudio.

Un análisis de la patogenia (figura 1) con C. albicans y C. elegans se ha descrito previamente por nuestro laboratorio17,18 y otros laboratorios19,20. Demostramos la receptividad del uso de C. elegans para el estudio de virulencia de C. albicans que demuestran que las células de C. albicans son inge...

Aquí, presentamos el nematodo Caenorhabditis elegans como modelo para estudiar la interacción microbiana host versátil.

El nematodo Caenorhabditis Elegans - un modelo versátil en Vivo para el estudio de las interacciones huésped-microbio

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

El objetivo general de este ensayo es observar el efecto de la infección fúngica en el organismo modelo C. Elegans. Este método puede ayudar a responder preguntas mecanicistas clave en el campo de las enfermedades infecciosas, como los factores de virulencia de los patógenos, los efectores inmunitarios del huésped, así como el descubrimiento de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un sistema manejable experimentalmente para estudiar las interacciones huésped-patógeno desde ambos puntos de vista.Es un sistema rápido, fácil y rentable. Aunque este método en particular puede proporcionar información sobre los patógenos fúngicos, también se puede aplicar a otros agentes infecciosos, como bacterias o incluso múltiples organismos para estudiar las interacciones microbianas en un huésped vivo. Para hacer un pico de gusano, corte un trozo de alambre de aluminio de 1,5 centímetros y luego inserte con cuidado aproximadamente 0,5 centímetros del alambre en la punta de una pipeta pasteur.Con un mechero Bunsen o una lámpara de alcohol, derrita la punta de la pipeta de vidrio girándola lentamente en la llama hasta que el alambre se adhiera firmemente a la pipeta sin comprometer la forma original de la punta de la pipeta. Finalmente, con pinzas, dobla con cuidado el extremo del alambre para crear un pequeño bucle. Para transferir rápidamente grandes cantidades de gusanos a nuevas placas, use una espátula para cortar un trozo de agar NGM que contenga los gusanos seleccionados.A continuación, retire la pieza cortada y colóquela boca abajo en el borde del parche de OP50 en una placa nueva. Para transferir gusanos individualmente, flamee el alambre en el pico de gusanos hasta que esté rojo, luego retírelo de la llama y deje que se enfríe durante unos segundos. Con el alambre de la púa, raspe suavemente el parche del cultivo OP50 cultivado en la nueva placa, cubriendo el alambre de la púa.El cultivo viscoso que cubre la punta del alambre hace que los gusanos se adhieran a la punta del pozo. Por lo tanto, use un movimiento de deslizamiento para recoger suavemente los gusanos seleccionados. Una vez que se hayan reunido los gusanos seleccionados, colóquelos en un plato nuevo deslizando suavemente el cultivo por el agar.A continuación, coloque el alambre en la llama para eliminar los restos de cultivo de la púa. Coloque aproximadamente 20 animales adultos recogiéndolos o troceándolos en un plato con 50 microlitros de E. coli cepa OP50. Para recoger los huevos después de uno o dos días, inunde la placa con 10 mililitros de tampón M9.Luego, con una pipeta serológica de vidrio, agite y agite suavemente el contenido en la placa de agar para liberar animales adultos o huevos adheridos a OP50. Recoja todo el líquido que contenga los huevos y los adultos. Transfiera la solución M9 y OP50 a un tubo cónico de 15 mililitros.Centrifugar el tubo a 2,100 x g durante dos minutos. A continuación, aspire aproximadamente nueve mililitros de sobrenadante sin alterar el pellet. A continuación, utilice dos mililitros de agua estéril, un mililitro de lejía y un mililitro de hidróxido de sodio 0,25 molar para resuspender el pellet.Mezclar suavemente por inversión hasta que aproximadamente el 70% de los animales adultos parezcan lisados. Por lo general, los huevos permanecen intactos durante este breve tratamiento de blanqueo debido a su cáscara. Es fundamental que se limite la cantidad de exposición a la lejía en este paso.La exposición prolongada a la lejía destruirá los huevos. Si la preparación del huevo falla, limite la duración de la exposición a la lejía o diluya la solución. Centrifugar el tubo cónico a 990 x g durante dos minutos.Aspire el sobrenadante sin alterar el pellet. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de tampón M9. Después de volver a girar y eliminar el sobrenadante sin alterar el pellet, use 200 microlitros de tampón M9 para volver a suspender el pellet.Dispense de tres a cinco mililitros de YPD en un tubo de ensayo estéril y use un asa estéril para inocularlo con una sola colonia de Candida albicans. Coloque el tubo en un tambor giratorio a 30 grados centígrados durante aproximadamente 16 a 18 horas. Etiquete un tubo de microfuga de 1,5 mililitros para que contenga C. albicans y otro para que contenga OP50, luego registre el peso de cada tubo vacío.Transfiera 500 microlitros del cultivo de C. albicans durante la noche al tubo etiquetado como C. Albicans. Y 1500 microlitros del cultivo OP50 durante la noche en el tubo etiquetado como OP50. Centrifugar los tubos durante 10 minutos a 16, 100 x g, luego aspirar el sobrenadante sin alterar los gránulos.Utilice 500 microlitros de agua estéril para resuspender cada pellet. A continuación, centrifugar los tubos a 16,100 x g durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante sin alterar los pellets.A continuación, registre el peso final de los tubos de microfuga. Determine el peso de cada pellet restando el peso inicial de los tubos de microfuga del peso final. Con agua estéril, vuelva a suspender el pellet de C.albicans a 10 miligramos por mililitro y el pellet OP50 a 20 miligramos por mililitro.A continuación, haga una mezcla maestra de infección combinando 10 microlitros de una solución de 50 miligramos por mililitro de estreptomicina. 2,5 microlitros de cultivo de OP50. 0,5 microlitros de cultivo de C.Albicans y 7 microlitros de agua estéril.Para las placas de control, cree una mezcla maestra reemplazando el volumen de cultivo de C. albicans con agua estéril. A continuación, utilice una micropipeta para sembrar 20 microlitros de mezcla de infección o solución de control OP50 en el centro de las placas NGM. Después de preparar los huevos como se demostró anteriormente en este video, cuente los huevos bajo el endoscopio de disección.Y use M9 para diluir la solución de huevo hasta lograr una concentración de aproximadamente cinco a seis huevos sanos por microlitro. Con una pipeta, dispense una muestra de 20 microlitros que contenga aproximadamente 30 huevos en una placa NGM preparada en el área entre el cultivo bacteriano y el costado de la placa. Incubar las placas a 20 grados centígrados durante 48 horas.Luego, bajo un microscopio de disección, cuente el número de gusanos adultos vivos y muertos en cada placa, considerando al animal muerto si no responde a ser golpeado en la cabeza por un alambre de aluminio o golpea la placa. También cuente el número de gusanos con Dar y confirme si un animal tiene Dar golpeando rápidamente la placa en la etapa del microscopio de disección.Los animales sin Dar se moverán hacia atrás inmediatamente, mientras que los animales con Dar necesitarán rondas repetidas de golpecitos para revertir su dirección o no lo harán en absoluto. Cada dos días, transfiera los gusanos adultos restantes recogiendo los gusanos en una nueva placa de infección o control. En este punto, si es necesario, realice un ensayo de supervivencia mediante el seguimiento de la cantidad de gusanos vivos, muertos y faltantes cada día.Es importante transferir los gusanos cada dos días como mínimo. Esto asegura que los gusanos adultos que se están puntuando en este ensayo no se confundan con su progenie. Los C. elegans fueron expuestos a C. albicans durante un período de seis días y se observaron signos de infección, progresión de la enfermedad y muerte.El fenotipo Dar es más visible en el cuarto día del ensayo de supervivencia, como se observa por una región anal protuberante que no es visible en el animal no infectado. También se sabe que los gusanos infectados por C. albicans presentan hinchazón en la región de la vulva. En ambos casos, el gusano es incapaz de eliminar la infección después de alcanzar esta etapa.Con el fin de visualizar la colonización de C. Albicans en el lumen intestinal, se alimentó con gusanos C. albicans de tipo salvaje marcados con RFP que hacen que las áreas de colonización emitan fluorescencia roja. C. albicans coloniza la luz intestinal al tercer día del ensayo. Como se muestra aquí, los gusanos infectados mostraron una distensión intestinal más severa que la observada en el control no infectado.En este experimento, se probó la capacidad de los gusanos para sobrevivir a la infección causada por el doble mutante virulento C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1. Los gusanos infectados con el doble mutante viven estadísticamente significativamente más tiempo que los controles. Lo que sugiere que estos dos genes son necesarios para la virulencia de C. albicans contra C. Elegans.Una vez dominada, cada parte de esta técnica se puede hacer en una o dos horas cada día de la vida útil del gusano. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que uno podría estar usando agentes infecciosos. Por lo tanto, se deben practicar las precauciones de bioseguridad adecuadas.Se pueden hacer modificaciones menores a este procedimiento básico, como la introducción de agentes microbianos adicionales para estudiar las interacciones microbianas en el contexto de un huésped vivo. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades infecciosas exploraran la virulencia microbiana, los mecanismos de las respuestas inmunitarias innatas del huésped, así como el descubrimiento de nuevos agentes antimicrobianos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo mantener y manipular C. Elegans y usar el organismo para estudiar las interacciones entre los microbios del huésped a nivel molecular.No olvide que trabajar con patógenos microbianos y reactivos químicos, como la azida de sodio, puede ser peligroso y se deben emplear precauciones de seguridad adecuadas, como EPP y métodos de eliminación de desechos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

La facilidad de mantenimiento y propagación del...

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Los nematodos de Caenorhabditis silvestre están asociados con muchos microbios, a menudo en la luz intestinal o infectando el intestino. Este protocolo detalla un método para enriquecer microbios inculturables que colonizan el intestino, aprovechando la resistencia de la cutícula dauer.

Limpieza selectiva de nematodos silvestres de Caenorhabditis para enriquecer las bacterias del microbioma intestinal

La infección de Caenorhabditis elegans por el parásito microsporidio Nematocida parisii permite a los gusanos producir descendencia que es altamente resistente al mismo patógeno. Este es un ejemplo de inmunidad hereditaria, un fenómeno epigenético poco conocido. El presente protocolo describe el estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de gusano genéticamente tratable.

Estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de Caenorhabditis elegans de infección por microsporidios

Los microbios intestinales, incluidas las bacterias extracelulares y los patógenos intracelulares como el virus de Orsay y los microsporidios (hongos), a menudo se asocian con nematodos Caenorhabditis silvestres. Este artículo presenta un protocolo para detectar y cuantificar microbios que colonizan y/o infectan nematodos de C. elegans , y para medir la carga de patógenos después de infecciones controladas en el laboratorio.

Hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) para visualizar la colonización microbiana y la infección en los intestinos de Caenorhabditis elegans

Este protocolo describe una interrupción de 96 pocillos de Caenorhabditis elegans colonizada bacterianamente después de la parálisis por frío y el blanqueamiento de la superficie para eliminar las bacterias externas. La suspensión resultante está chapada en placas de agar para permitir una cuantificación precisa y de rendimiento medio de la carga bacteriana en un gran número de gusanos individuales.

Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones caenorhabditis elegans-bacterianas

Caenorhabditis elegans es una de las principales especies modelo en biología, sin embargo, casi todas las investigaciones se realizan en ausencia de sus microbios naturalmente asociados. Los métodos descritos aquí ayudarán a mejorar nuestra comprensión de la diversidad de microbios asociados como base para futuras investigaciones funcionales de C. elegans.

Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo Caenorhabditis elegans

Los microcosmos de compost llevan la diversidad microbiana que se encuentra en la naturaleza al laboratorio para facilitar la investigación del microbioma en Caenorhabditis elegans. Aquí se proporcionan protocolos para establecer experimentos de microcosmos, y los experimentos demuestran la capacidad de modular la diversidad microbiana ambiental para explorar las relaciones entre la diversidad microbiana ambiental y la composición del microbioma intestinal del gusano.

Microcosmos de compost como entornos microbianamente diversos y naturales para la investigación del microbioma en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans es un modelo poderoso para examinar los determinantes moleculares que impulsan las interacciones entre el huésped y el microbioma. Presentamos una línea de alto rendimiento que perfila los niveles de colonización del microbioma intestinal de un solo animal junto con aspectos clave de la fisiología de C. elegans.

Aplicación de la vermimetría de flujo para la cuantificación y el análisis del microbioma intestinal de Caenorhabditis elegans

Aquí proporcionamos instrucciones sobre cómo utilizar eficazmente SegElegans, un sistema de aprendizaje profundo que desarrollamos para la segmentación automatizada de gusanos individuales en imágenes de microscopía de campo amplio, para su uso posterior en software de análisis de imágenes como ImageJ. Proporcionamos formas de utilizar el sistema tanto en línea como fuera de línea.

Análisis automatizado de imágenes de fluorescencia de C. elegans usando SegElegans

Se describe una sólida estrategia de sustitución de genes para manipular genéticamente el hongo Ustilago maydis carbón. Este protocolo explica cómo generar mutantes de deleción para investigar fenotipos de infección. Se puede extender para modificar genes de cualquier manera deseada, por ejemplo, mediante la adición de una secuencia que codifica un marcador de proteína fluorescente.

La manipulación genética del patógeno de la planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudiar biología de hongos y plantas Microbe Interactions

Aprende a estudiar infecciones fúngicas en Caenorhabditis elegans como modelo huésped versátil. Este método permite investigar factores de virulencia, respuestas inmunes y descubrimiento de fármacos de forma rápida y económica.

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