Name: Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprende a registrar corrientes sinápticas focales en la unión neuromuscular de larvas de Drosophila mediante macropatch. Esta técnica permite estudiar la transmisión sináptica y el efecto de mutaciones en proteínas específicas.

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El apoyo de la beca del NIH R01 MH 099557

1. fabricación de electrodos de grabación <ol><li>tira de los electrodos de vidrio <ol><li>uso el siguiente protocolo para el tirador de microelectrodo (véase Tabla de materiales): <ol><li>línea 1: calor Tire de 510 - velocidad 30 tiempo 250; Línea 2: Calor tire 490 - velocidad 30 tiempo 250. 
			Nota: Unidades de tiempo corresponden a 0,5 m por unidad; las otras unidades son relativas. El valor del calor debe ajustarse para cada filamento, después de realiza la prueba de rampa.</li>
		</ol></li> <li>Uso de un microscopio (35 aumentos) para que el diámetro interior del electrodo tirado está en la gama de 7-10 μm ( figura 1A). Almacenar los tubos capilares en recipientes herméticamente cerrados para evitar la acumulación de polvo.</li>
	</ol></li> <li>Fuego pulido <ol><li>tubos capilares fuego polaco (80-90% del valor máximo de calor para 1-2 s) usando una micro-forja (véase Tabla de materiales). El diámetro interior final del electrodo pulido esté 5 μm ( figura 1A) 27.</li>
	</ol></li> <li>Flexión Nota: se hacen dos curvas para colocar el electrodo en la parte superior del músculo bajo un objetivo de gran aumento.
	<ol><li>Uso el aparato mostrado en la figura 1B. Fijar el electrodo en el manipulador y coloque la punta sobre el filamento, no tocar lo</li>
		<li>Conjunto valor a 60-70% del máximo del calor y apriete el pedal de la fragua de micro de 1-2 s (véase Tabla de materiales) para calentar el filamento. Utilice una aguja en forma de L para suavemente tire hacia abajo la punta del electrodo ( figura 1B ampliada). Realizar la curva en aproximadamente 90 o ( figura 1).</li>
		<li>Sostener el electrodo sobre la llama de la antorcha a mano usando pinzas y hacer la segunda curva a una distancia de 7-10 mm de la primera curva y en un ángulo de aproximadamente 120 o ( figura 1).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig1.jpg"> figura 1. Pasos finales de la fabricación de una micropipeta. (A) electrodo consejos después de tirar y fuego pulido. (B.1) la configuración para el doblez de la punta. (B.2) el área de caja se muestra ampliada a la derecha. El electrodo y el filamento se fijan para que la punta del electrodo está situado un poco por encima el cable y no tocar. (C.1) el electrodo de la grabación. (C.2) el área de caja se muestra ampliada a la derecha. La primera curva tiene un ángulo de aproximadamente 90° y la distancia entre la primera curva y la punta del electrodo es de aproximadamente 1 mm. escala de la barra = 3 mm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig1large.jpg" target="_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
 2. pasos preparatorios adicionales <ol><li>Prepare la solución de heamolymph-like (HL3) (en mM): NaCl 70, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trehalosa, sacarosa 115, 5 HEPES y 1 mM CaCl 2; ajustar el pH a 7.3 - 7.4. mantener la solución en la nevera y hacer fresco cada semana.</li>
	<li>Hacer pipetas de estimulación la misma manera como grabación de vidrio pipetas, excepto que no es necesario doblarlas. 
	Nota: La preparación de los electrodos de estímulo se describe detalladamente en 28 y 27. El diámetro final después de pulir de fuego debe estar en el rango de 5-7 μm.</li>
	<li>Insertar una pipeta de estimulación en un soporte de microelectrodo conectada a una jeringa de.</li>
	<li>Placas de disección fabricación de pequeños platos de petri (35 x 10 mm) recubiertos con epoxi de caucho de silicona (véase Tabla de materiales) como se describe en 28. 
	Nota: El caucho de silicón debe ser completamente endurecido antes de uso.</li>
	<li>Elegir un errante larvas de tercer estadio y diseccionar como se describe en 27 , 28 , 29 , 30. 
	Nota: Para visualizar los botones, usar la cepa mosca CD8-GFP (véase Tabla de materiales) <ol><li>usar fórceps (véase Tabla de materiales), recoger las larvas de estadio 3 rd de un frasco de.</li>
		<li>Clavija las larvas, colocando el primer pasador posterior y la otra clavija anterior (cierre a ganchos de la boca).</li>
		<li>HL3 Agregar solución.</li>
		<li>Hacer un corte con tijeras de primavera (véase Tabla de materiales) desde el pasador superior a la inferior en el lado dorsal de las larvas de.</li>
		<li>Pin el filete de larvas, colocando 2 clavijas adicionales en los lados izquierdo y derecho de las larvas de.</li>
		<li>Quitar las tripas y traquear usando fórceps.</li>
		<li>Cortar los nervios a las afueras de la cuerda ventral del nervio con unas tijeras de muelle.</li>
	</ol></li></ol> 3. Grabaciones eléctricas de EJCs <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig2.jpg"> figura 2. La configuración de grabación. La muestra cubrió para el silicio recubierto de Petri (flecha) se coloca sobre el escenario móvil del microscopio compuesto vertical equipado con epifluorescencia, un objetivo de gran aumento y dos micromanipuladores NMJ. Se coloca el microscopio en una mesa antivibración. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig2large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol><li>Grabación <ol><li>lugar el plato petri con la preparación sobre la platina del microscopio ( figura 2). Colocar el electrodo de referencia en el baño.</li>
		<li>Rellenar el electrodo de la grabación con solución de HL3. Bajo el objetivo de 10 x (véase Tabla de materiales), sumergir el electrodo en el baño y coloque sobre los músculos 6 y 7 de los segmentos abdominales 2, 3 o 4 con el micromanipulador () (véase Tabla de materiales) figura 3 A.1 y A.2).</li>
		<li>Cambiar el objetivo a x 60 (véase Tabla de materiales). Se centran en el área de interés usando epi-fluorescencia u óptica CID. Coloque la punta del electrodo en la parte superior bouton sináptico ( figura 3 B.1-3).</li>
		<li>Presionar el electrodo muy suavemente en el músculo. La presión excesiva puede dañar el NMJ o inducir un aumento en la actividad sináptica espontánea. Asegúrese de que la punta del electrodo no es obstruido - si es, reemplazar it</li>
		<li>Encender el amplificador, Junta de A/D y el equipo.</li>
		<li>Elegir el modo de pinza de voltaje del amplificador de.</li>
		<li>Iniciar el software de adquisición y elegir la ' boquete-libre ' modo de.</li>
		<li>Observar la aparición de mEJCs en la pantalla del ordenador.</li>
		<li>Asegurarse de que la amplitud de la mEJCs está en el rango de 0.2 - 0.7 na 
		Nota: EJCs más pequeño indican que el electrodo de la grabación tiene defectos o que no esté posicionado correctamente.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig3.jpg"> figura 3. Visualización de los botones sinápticos. (A) A brightfield imagen de un hemi-segmento bajo 10 aumentos (A.1) y el área ampliada en caja mostrando los músculos 6 y 7 (A.2, la flecha marca el electrodo de la grabación). Barra de escala = 50 μm. (B) botones sinápticos se visualizan en una línea de Drosophila con un marcador neuronal genéticamente codificado (CD8-GFP) usando proyección de imagen de epi-fluorescencia (B.1) o DIC óptica (B.2). Imágenes son tomadas con el 60 x objetivo y el cubo de filtro para la proyección de imagen de GFP (véase Tabla de materiales). Synaptic botones están marcados con flechas, y B.3 muestra una superposición de imágenes DIC y fluorescentes. Barra de escala = 10 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig3large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="2"> <li>estimulación <ol><li>utilizando un micromanipulador, bajo un control visual, coloque el electrodo de estimulación cerca el axón inervan segmentos abdominales 2-4.</li>
		<li>Aplicar presión negativa tirando el émbolo de la jeringa conectada al cable porta electrodo, por lo que el axón se tira dentro del electrodo ( figura 2).</li>
		<li>Activar el estimulador. Gire el mando de la unidad de aislamiento (véase Tabla de materiales) para establecer una corriente de cero y luego irá aumentando progresivamente, hasta que aparezcan EJCs (o hasta que se alcanza el umbral).</li>
		<li>Realizar la estimulación en un régimen del suprathreshold, con la estimulación actual aumenta aproximadamente dos veces, en comparación con el umbral para la observación de los EJCs. 
		Nota: En nuestra experiencia, tal intensidad de estímulo es óptimo para evitar fallos de potencial de acción y potencial de acción de la leña. Por ejemplo, si EJCs aparecen en la corriente de estimulación de 0,2 mA, utilice una corriente de 0,4 mA durante todo el experimento.</li>
	</ol></li> <li>Resistencia <ol><li>Mida la resistencia del sello del electrodo de macropatch grabación girando el interruptor de la resistencia de electrodo del amplificador a " prueba del sello " posición. Observar que se mostrará el valor de la resistencia del sello en GΩ en el " actual " ventana.</li>
		<li>Asegúrese de que la resistencia del sello está en el rango de 0.5 - 2 M Ω. Valores fuera de este rango indican que el electrodo es no bien pulido o no debidamente colocado.</li>
		<li>Controlar la resistencia del sello a lo largo de la grabación, asegurándose de que permanece constante durante todo el experimento.</li>
	</ol></li></ol> 4. Análisis <ol><li>analizar grabaciones empleando personalizado software para el análisis (véase Tabla de materiales). 
	Nota: Nuestro laboratorio utiliza software interno turísticos 31, que está modificado para requisitos particulares para la detección de los EJCs y mEJCs grabados focal ( figura 4). Este software incluye un filtro digital gaussiano y permite la detección de picos cuántico de superposición cuántico múltiples eventos ( Figura 4A). Otros enfoques se describen en 17.</li>
</ol> <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig4.jpg"> figura 4. Análisis cuántico. Detección de mEJCs (A) y (B) EJCs por software turísticos. La zona de eventos está marcada en verde y picos están marcados por las puntas de flecha rojos. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig4large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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<li>Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+evoked+release+are+independently+regulated+at+individual+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones.</a> J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Drosophila representa un organismo modelo ventajoso para el estudio de la transmisión sináptica. Varias configuraciones de grabación se han utilizado en el NMJ larvas, incluyendo grabaciones intracelulares de potenciales sinápticos, grabaciones de corrientes sinápticas y voltaje de dos electrodos abrazadera33,34, macropatch focal grabaciones de corrientes sinápticas que se describe aquí. La última técnica permite la cuantificación precisa de la transmisi...

Drosophila es un sistema modelo excelente para estudiar los mecanismos moleculares de control de la transmisión sináptica. El sistema neuromuscular de Drosophila es glutamatérgica, y por lo tanto, la Unión neuromuscular de Drosophila (NMJ) puede utilizarse para estudiar las características conservadas de liberación glutamatérgica. Desde Jan y de Jan estudio1, las larvas de tercer estadio se ha utilizado ampliamente para estudiar la transmisión sináptica espontánea y evocada mediante el control de los potenciales excitatorios cruce (EJPs) o corrientes (EJCs). EJPs comúnmente se registran intracelular con un micro-electrodo de vidrio afilado, y reflejan la actividad de la NMJ entera, incluyendo todos los botones haciendo sinapsis en la fibra muscular determinada.
Por el contrario, puede registrar la actividad de un número limitado de los sitios de liberación focal colocando una punta de micropipeta cerca terminales neuronales o varicosidades sinápticas. Esta técnica fue empleada originalmente por Katz y Miledi2y grabaciones extracelulares focal han sido empleadas con éxito en varias preparaciones de NMJ, incluyendo rana3,4,5, ratón6 , 7 , 8, crustáceos9,10,11,12,13,14,15,16y Drosophila17,18,19,20,21,22,23. Este enfoque fue desarrollado por Dudel, que había optimizado macropatch recodificación electrodos24,25. En la implementación de Dudel, esta técnica muy igualados con el método de la abrazadera del remiendo flojo26.
La NMJ de Drosophila larvas ha definido claramente los botones sinápticos, y líneas transgénicas con las etiquetas fluorescentes neuronales genéticamente codificados (véase Tabla de materiales) están disponibles. Estas ventajas nos permitieron grabar EJCs y mEJCs de un bouton sináptico seleccionado20,21,22. Aquí, describimos esta técnica en detalle.

<table><tbody><tr><td>Sutter P-97</td><td>Instrumento Sutter</td><td>P-97</td><td>Extractor de microelectrodos</td></tr><tr><td>Narishige MF-830</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>WPI MF200</td><td>WPI</td><td>MF200</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio</td><td>WPI</td><td>B150-86-10</td><td>Capilares de vidrio</td></tr><tr><td>Microtorch 1WG61</td><td>Grainer</td><td>1WG61</td><td></td></tr><tr><td>Microtorch Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td>Silicona para la preparación de placas de disección</td></tr><tr><td>Clavijas de disección</td><td>Amazon</td><td>B00J5PMPJA</td><td>Pines para el posicionamiento de larvas</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>WPIINC</td><td>500342</td><td>Pinzas para colocar alfileres, quitar las tripas y las tráqueas.</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>WPIINC</td><td>501778</td><td>Tijeras para cortar la cutícula de las larvas y los nervios.</td></tr><tr><td>Olympus BX61WI</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td>Microscopio vertical</td></tr><tr><td>Olympus Lumplan FL N 60x</td><td>Olympus</td><td>UPLFLN 60X</td><td>Objetivo de microscopio 60X</td></tr><tr><td>Olympus UPlan FL N 10x</td><td>Olympus</td><td>Uplanfl N 10X</td><td>Objetivo de microscopio 10X</td></tr><tr><td>Narishige Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MHW-3</td><td>Micromanipulador hidráulico de agua de tres ejes</td></tr><tr><td>npi Electronic GmbH ELC-03XS</td><td>npi Electronic GmbH</td><td>ELC-03XS</td><td>Amplificador electrofisiológico</td></tr><tr><td>A.M.P.I Master 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master 8</td><td>Estimulador eléctrico</td></tr><tr><td>A.M.P.I Iso-Flex</td><td>A.M.P.I.</td><td>Iso-Flex</td><td>Estimulador Aislador</td></tr><tr><td>TMC mesa antivibratoria</td><td>TMC</td><td>63-9090</td><td>Mesa antivibratoria</td></tr><tr><td>TMC Jaula de Faraday</td><td>TMC</td><td>81-333-90 Jaula de</td><td>Faraday</td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td> Computadora <td>Digidata</td></tr><tr><td></td><td>Dell</td><td>Dell Dimension 5150</td><td>Computadora con sistema operativo Win XP</td></tr><tr><td>Portaelectrodos</td><td>WPI</td><td>MEH3SW</td><td>Portaelectrodos</td></tr><tr><td>Filtro óptico</td><td>Omega optical</td><td>XF 115-2</td><td>Cubo de filtro para la detección de proteínas fluorescentes verdes (GFP)</td></tr><tr><td>pCLAMP 8</td><td>Axon Instruments</td><td>8.0.0.81</td><td>Software para el registro de señales</td></tr><tr><td>Quantan</td><td>Software</td> <td>interno-Software</td> <td>para el procesamiento de señales</td></tr><tr><td>Canton-S (Wildtype)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64349</td><td>Línea de mosca de control</td></tr><tr><td>cpx SH1</td><td>Generoso regalo de J.T. Littleton-Complexin</td> línea <td></td><td>de moscas knock-out con aumento de la exocitosis espontánea</td></tr><tr><td>CD8-GFP</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>5137</td><td>Línea de mosca con fluorescente neuronal (GFP) Tag</td></tr></tbody></table>

grabaciones de macropatch focal de corrientes sinápticas de la unión neuromuscular larvaria de drosophila

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Unión neuromuscular de Drosophila (NMJ) es un sistema modelo excelente para estudiar la transmisión sináptica glutamatérgica. Describimos la técnica de las grabaciones de macropatch focal de corrientes sinápticas de botones visualizados en la NMJ de Drosophila larvas. Esta técnica requiere fabricación modificada para requisitos particulares de grabación micropipetas, así como un microscopio compuesto equipado con un gran aumento, objetivo de inmersión de agua de larga distancia, óptica de interferencia diferencial (DIC) de contraste y un fluorescente accesorio. El electrodo de registro se coloca en la parte superior de un seleccionado bouton sináptico visualizado con DIC óptica, epi-fluorescencia o ambos. La ventaja de esta técnica es que permite seguimiento de la actividad sináptica de un número limitado de sitios de liberación. El electrodo de la grabación tiene un diámetro de varias micras, y los sitios de liberación colocados fuera del borde del electrodo no afectar significativamente las corrientes registradas. Las corrientes sinápticas grabadas tienen cinética rápida y pueden ser fácilmente resuelto. Estas ventajas son especialmente importantes para los estudios de líneas de mosca mutantes con mayor actividad sináptica espontánea o asincrónica.

Grabaciones de macropatch focal permiten monitoreo actividad sináptica de las botones sinápticos (figura 5). Cuando el electrodo se coloca en la parte superior un bouton sináptico (figura 5A, sitio 1), el grabado mEJCs (figura 5, Página 1) tienen una amplitud significativamente superior al nivel de ruido y sostenido aumento de las fases (en un rango de los milisegundos). Cuando el electrodo de la gra...

Las corrientes sinápticas pueden grabarse focal de visualizadas botones sinápticos en la Drosophila tercer instar larvas Unión neuromuscular. Esta técnica permite la monitorización de la actividad de una sola bouton sináptico.

Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

El objetivo general de esta técnica es monitorizar la actividad sináptica de los botones sinápticos visualizados en la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila. Un excelente sistema modelo fácilmente modificable a las manipulaciones genéticas. Esta técnica puede abordar preguntas clave en su ciencia.Por ejemplo, cómo las mutaciones de las proteínas sinápticas regulan la transmisión sináptica. La principal ventaja de esta técnica es que la actividad de un número limitado de sitios de liberación puede ser monitoreada y registrada corrientes de cinética rápida y puede ser fácilmente resuelta. Para comenzar el experimento: prepare el extractor de microelectrodos.Utilice un microscopio con un aumento de 35X para asegurarse de que el diámetro interior del electrodo extraído esté en el rango de siete a diez micrómetros. Almacene los capilares en recipientes herméticamente cerrados para evitar la acumulación de polvo. A continuación, cocine los capilares pulidos con una micro forja.Asegúrese de que el diámetro interior final del electrodo pulido sea de cinco micrómetros. Luego, pasa a doblar. Fije el electrodo en el manipulador y coloque la punta sobre el filamento sin tocarlo.Ajuste el valor de calor al 60-70% del máximo y presione el pedal de la micro forja durante uno o dos segundos para calentar el filamento. Use una aguja en forma de L para tirar suavemente hacia abajo de la punta del electrodo y hacer la curva a aproximadamente 90 grados. Sostenga el electrodo sobre la llama de la antorcha con la mano y haga la segunda curva a siete o diez milímetros de la primera curva y en un ángulo de aproximadamente 120 grados.Prepare una solución similar a la hemolinfa o HL3. Mantenga la solución en el refrigerador y hágala fresca cada semana. Prepare las pipetas de estimulación de la misma manera que las pipetas de vidrio de grabación, sin doblarlas.A continuación, inserte una pipeta de estimulación en un soporte de microelectrodos conectado a una jeringa. Fabricación de placas de disección a partir de pequeñas placas de Petri recubiertas con epoxi de caucho de silicona. Luego, con fórceps, elija una larva errante del tercer estadio de un vial.Sujetar las larvas colocando el primer alfiler en la parte posterior y otro alfiler anterior cerca de los ganchos bucales. Agregue la solución HL3. En el lado dorsal de las larvas, haga un corte con unas tijeras de resorte desde el alfiler superior hasta el alfiler inferior.Sujete el filete de larva colocando dos alfileres adicionales en los lados izquierdo y derecho de las larvas. Retire las tripas y la tráquea con pinzas. Corta los nervios justo fuera del cordón nervioso ventral con unas tijeras de resorte.Coloque la placa de Petri con la preparación en la platina del microscopio. Inserte el electrodo de referencia en el baño. Llene el electrodo de registro con solución HL3.Bajo el objetivo 10X, sumerja el electrodo en el baño y colóquelo sobre los músculos seis y siete de los segmentos abdominales de dos, tres o cuatro usando el micro manipulador. A continuación, cambie el objetivo a 60X y concéntrese en el área de interés utilizando la epiflorescencia o la óptica DIC. Coloque la punta del electrodo en la parte superior del botón sináptico, luego presione el electrodo muy suavemente sobre el músculo, ya que una presión excesiva puede dañar la NMJ o inducir un aumento en la actividad sináptica espontánea.A continuación, encienda el amplificador, la placa AD y la computadora. Luego, elija el modo de pinza de voltaje en el amplificador. Inicie el software de adquisición y elija el modo sin interrupciones y observe la apariencia de los MEJC en la pantalla de la computadora.Asegúrese de que la amplitud de los MEJC esté en el rango de 0,2 a 0,7 nanoamperios. Usando un micro manipulador bajo un control visual, coloque el electrodo de estimulación cerca del axón que inerva los segmentos abdominales dos a cuatro. Aplique presión negativa tirando del pistón de la jeringa conectada al portaelectrodos para que el axón quede dentro del electrodo.A continuación, encienda el estimulador. Gire la perilla de la unidad de aislamiento para establecer una corriente cero y luego auméntela suavemente hasta que aparezcan los EJC o hasta que se alcance el umbral. Realizar la estimulación en un régimen de superumbral.Con la estimulación, la corriente aumenta aproximadamente el doble en comparación con el umbral para la observación de EJC. Mida la resistencia de sellado del electrodo de macroparche de registro girando el interruptor de resistencia del electrodo del amplificador a la posición de prueba de sellado. Observe el valor de la resistencia del sello en giga ohmios que se mostrará en la ventana actual.Las grabaciones de parches de macros focales permiten monitorear la actividad sináptica de los botones sinápticos seleccionados. Cuando el electrodo se coloca en la parte superior de un botón sináptico, los MEJC registrados tienen amplitudes que superan significativamente el nivel de ruido y fases ascendentes bruscas en un rango de menos de milisegundos. Cuando el electrodo registrador se aleja del botón sináptico varias micras, las amplitudes de los MEJC del registrador disminuyen casi hasta el nivel de ruido.Los EJC registrados apenas se pueden distinguir del ruido y tienen fases ascendentes prolongadas. Las grabaciones focales permiten una detección precisa de MEJC en el mutante complejo y gnomo. Mientras que las grabaciones intercelulares de este mutante exhiben eventos de liberación que se superponen y no se pueden detectar de manera confiable.El ajuste de los ángulos del electrochip es fundamental para el posicionamiento del electrodo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la comprobación de imágenes de eventos de lanzamiento individuales, para responder a preguntas adicionales, como la integración de la actividad de zonas activas individuales.

focal-macropatch-recordings-synaptic-currents-from-drosophila-larval

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

A continuación se describen los métodos electrofisiológicos para la medición de la transmisión sináptica en la unión neuromuscular de larvas de Drosophila. Liberación evocada se inicia artificialmente mediante la estimulación de los axones de la neurona motora, y la transmisión a través de la UNM se puede medir por la respuesta postsináptica evocado en el músculo.

Los métodos electrofisiológicos para la grabación de los potenciales sinápticos de la UNM de larvas de Drosophila

Aplicación de la electrofisiología de las sinapsis accesibles proporciona una medida cuantificable de la actividad sináptica, útil en el análisis de mutantes sinápticos. Este artículo describe un método de disección utilizado para exponer la uniones neuromusculares (UNM)...

Disección y de grabación de la unión neuromuscular C. Elegans

Registro electrofisiológico en el Drosophila Embrión

Las larvas de pez cebra representan el sistema de vertebrados primer modelo que permite la grabación simultánea de patch clamp de una neurona motora espinal y el objetivo del músculo esquelético. Este video muestra los métodos microscópicos para identificar un CaP segmentaria neurona motora y las células diana muscular, así como las metodologías para la grabación de cada tipo de célula.

Emparejados grabaciones patch clamp de neurona motora y el músculo esquelético de destino en el pez cebra

La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

En el parche situ clamp grabaciones se utilizan para la caracterización electrofisiológica de las neuronas en los circuitos intactos. En el modelo genético de Drosophila sujeción parche es difícil porque el SNC es pequeño y rodeado por una vaina robusta. En este artículo se describe el procedimiento para retirar las neuronas vaina y limpia para posteriores grabaciones de patch clamp.

Preparación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas centrales para<em&gt; In situ</em&gt; Parche de sujeción

La unión neuromuscular de Drosophila (NMJ) se utiliza como modelo para estudiar la morfología y función de las sinapsis. Este video describe características importantes que los investigadores cuantifican para caracterizar el NMJ. El protocolo de ejemplo muestra un software capaz de realizar la cuantificación automáticamente.

Drosophila Cuantificación de la unión neuromuscular (NMJ): un método para evaluar la morfología y la función sináptica

Este video muestra la técnica para registrar las corrientes sinápticas de un botón sináptico en la unión neuromuscular de la larva de Drosophila. Esta técnica permite monitorizar la actividad de un único botón sináptico, lo que es importante para el estudio de líneas de moscas mutantes con una mayor actividad sináptica espontánea o asíncrona.

Registro de corrientes sinápticas en la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila

Hemos desarrollado una preparación espinal cerebral espinal intacta para registrar y monitorear la actividad eléctrica a través de la grabación de patch clamp de las neuronas y otras células de Mauthner reticulospinal en embriones de pez cebra. Por lo tanto, somos capaces de registrar las corrientes sinápticas excitatorias e inhibitorias, la actividad del canal dependiente de voltaje y los potenciales de acción de las neuronas clave en un embrión en desarrollo.

Patch Clamp Las grabaciones de las células embrionarias de pez cebra Mauthner

El registro de las corrientes de Ca2+ en la membrana frontal de liberación presináptica es clave para una comprensión precisa de la entrada de Ca2+ y la liberación de neurotransmisores. Presentamos una disociación aguda de la médula espinal de la lamprea que produce axones reticuloespinales aislados funcionales, lo que permite el registro directo desde la membrana de la cara de liberación de las terminales presinápticas individuales.

Agudo Disociación de lamprea reticuloespinal axones para permitir la grabación del estreno de la cara de la membrana de individuales Terminales presinápticos funcionales

La unión neuromuscular de las larvas de pez cebra es un modelo atractivo para el estudio de la fisiología sináptica. Es susceptible de muchas técnicas experimentales, como la electrofisiología y las imágenes ópticas. Aquí, describimos un protocolo para la transmisión sináptica de imágenes utilizando una sonda basada en pHluorin bajo un microscopio de epifluorescencia vertical.

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Aprende a registrar corrientes sinápticas focales en la unión neuromuscular de larvas de Drosophila mediante macropatch. Esta técnica permite estudiar la transmisión sináptica y el efecto de mutaciones en proteínas específicas.

Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila

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