Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila

El objetivo general de esta técnica es monitorizar la actividad sináptica de los botones sinápticos visualizados en la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila. Un excelente sistema modelo fácilmente modificable a las manipulaciones genéticas. Esta técnica puede abordar preguntas clave en su ciencia.

Por ejemplo, cómo las mutaciones de las proteínas sinápticas regulan la transmisión sináptica. La principal ventaja de esta técnica es que la actividad de un número limitado de sitios de liberación puede ser monitoreada y registrada corrientes de cinética rápida y puede ser fácilmente resuelta. Para comenzar el experimento: prepare el extractor de microelectrodos.

Utilice un microscopio con un aumento de 35X para asegurarse de que el diámetro interior del electrodo extraído esté en el rango de siete a diez micrómetros. Almacene los capilares en recipientes herméticamente cerrados para evitar la acumulación de polvo. A continuación, cocine los capilares pulidos con una micro forja.

Asegúrese de que el diámetro interior final del electrodo pulido sea de cinco micrómetros. Luego, pasa a doblar. Fije el electrodo en el manipulador y coloque la punta sobre el filamento sin tocarlo.

Ajuste el valor de calor al 60-70% del máximo y presione el pedal de la micro forja durante uno o dos segundos para calentar el filamento. Use una aguja en forma de L para tirar suavemente hacia abajo de la punta del electrodo y hacer la curva a aproximadamente 90 grados. Sostenga el electrodo sobre la llama de la antorcha con la mano y haga la segunda curva a siete o diez milímetros de la primera curva y en un ángulo de aproximadamente 120 grados.

Prepare una solución similar a la hemolinfa o HL3. Mantenga la solución en el refrigerador y hágala fresca cada semana. Prepare las pipetas de estimulación de la misma manera que las pipetas de vidrio de grabación, sin doblarlas.

A continuación, inserte una pipeta de estimulación en un soporte de microelectrodos conectado a una jeringa. Fabricación de placas de disección a partir de pequeñas placas de Petri recubiertas con epoxi de caucho de silicona. Luego, con fórceps, elija una larva errante del tercer estadio de un vial.

Sujetar las larvas colocando el primer alfiler en la parte posterior y otro alfiler anterior cerca de los ganchos bucales. Agregue la solución HL3. En el lado dorsal de las larvas, haga un corte con unas tijeras de resorte desde el alfiler superior hasta el alfiler inferior.

Sujete el filete de larva colocando dos alfileres adicionales en los lados izquierdo y derecho de las larvas. Retire las tripas y la tráquea con pinzas. Corta los nervios justo fuera del cordón nervioso ventral con unas tijeras de resorte.

Coloque la placa de Petri con la preparación en la platina del microscopio. Inserte el electrodo de referencia en el baño. Llene el electrodo de registro con solución HL3.

Bajo el objetivo 10X, sumerja el electrodo en el baño y colóquelo sobre los músculos seis y siete de los segmentos abdominales de dos, tres o cuatro usando el micro manipulador. A continuación, cambie el objetivo a 60X y concéntrese en el área de interés utilizando la epiflorescencia o la óptica DIC. Coloque la punta del electrodo en la parte superior del botón sináptico, luego presione el electrodo muy suavemente sobre el músculo, ya que una presión excesiva puede dañar la NMJ o inducir un aumento en la actividad sináptica espontánea.

A continuación, encienda el amplificador, la placa AD y la computadora. Luego, elija el modo de pinza de voltaje en el amplificador. Inicie el software de adquisición y elija el modo sin interrupciones y observe la apariencia de los MEJC en la pantalla de la computadora.

Asegúrese de que la amplitud de los MEJC esté en el rango de 0,2 a 0,7 nanoamperios. Usando un micro manipulador bajo un control visual, coloque el electrodo de estimulación cerca del axón que inerva los segmentos abdominales dos a cuatro. Aplique presión negativa tirando del pistón de la jeringa conectada al portaelectrodos para que el axón quede dentro del electrodo.

A continuación, encienda el estimulador. Gire la perilla de la unidad de aislamiento para establecer una corriente cero y luego auméntela suavemente hasta que aparezcan los EJC o hasta que se alcance el umbral. Realizar la estimulación en un régimen de superumbral.

Con la estimulación, la corriente aumenta aproximadamente el doble en comparación con el umbral para la observación de EJC. Mida la resistencia de sellado del electrodo de macroparche de registro girando el interruptor de resistencia del electrodo del amplificador a la posición de prueba de sellado. Observe el valor de la resistencia del sello en giga ohmios que se mostrará en la ventana actual.

Las grabaciones de parches de macros focales permiten monitorear la actividad sináptica de los botones sinápticos seleccionados. Cuando el electrodo se coloca en la parte superior de un botón sináptico, los MEJC registrados tienen amplitudes que superan significativamente el nivel de ruido y fases ascendentes bruscas en un rango de menos de milisegundos. Cuando el electrodo registrador se aleja del botón sináptico varias micras, las amplitudes de los MEJC del registrador disminuyen casi hasta el nivel de ruido.

Los EJC registrados apenas se pueden distinguir del ruido y tienen fases ascendentes prolongadas. Las grabaciones focales permiten una detección precisa de MEJC en el mutante complejo y gnomo. Mientras que las grabaciones intercelulares de este mutante exhiben eventos de liberación que se superponen y no se pueden detectar de manera confiable.

El ajuste de los ángulos del electrochip es fundamental para el posicionamiento del electrodo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la comprobación de imágenes de eventos de lanzamiento individuales, para responder a preguntas adicionales, como la integración de la actividad de zonas activas individuales.