Métodos para analizar los efectos del uranio Natural en In Vitro la osteoclastogénesis

El objetivo general de este procedimiento es investigar los efectos de la exposición natural al uranio en la viabilidad, diferenciación y función de los osteoclastos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la toxicidad ambiental sobre el impacto de la exposición al uranio en la fisiología ósea y el metabolismo. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una nueva e interesante herramienta para el cribado de originadores de uranio.

Cuando el cultivo celular RAW 264.7 haya alcanzado una confluencia del 85 al 90%, utilice un raspador de células para levantar mecánicamente las células del fondo del matraz de cultivo celular y transferir las células a un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Pipetee la solución celular varias veces para romper los grumos y contar la suspensión unicelular resultante. Diluir las células a una concentración de 10 a la cuarta células por mililitro en un Medio Esencial Mínimo Alfa modificado, suplementado con L-glutamina y 5% de suero bovino fetal y agregar un mililitro de células por pocillo a una placa de cultivo celular de 24 pocillos para una incubación de seis horas a 37 grados Celsius.

Un parámetro importante para la reproducibilidad del ensayo de diferenciación y reabsorción de osteoclastos es la densidad de siembra celular. Preste especial atención al recuento de células, la preparación de la suspensión celular y su homogeneidad antes de sembrar las células. Para preparar la solución salina urinaria, a partir de una solución acuosa acuosa de bicarbonato de sodio al 7,5% probada en cultivo de células estériles, primero prepare y enfríe 100 milimolares de bicarbonato en agua con hielo y agregue un volumen de solución de acetato de urinario de 100 milimolares, gota a gota, en nueve volúmenes de la solución de bicarbonato helada con una agitación suave.

Deje que la solución se equilibre a temperatura ambiente. Después de tres horas, diluir el volumen apropiado de solución urinaria, gota a gota, en un medio de diferenciación que contenga 50 nanogramos por mililitro de RANKL hasta alcanzar la concentración de trabajo urinaria deseada y permitir otras tres horas de equilibrio a temperatura ambiente. Los largos pasos de incubación después de cada dilución de la sal urinaria son esenciales para la estabilización de los complejos urinarios en las soluciones.

Al final del segundo período de equilibrio, reemplace suavemente el medio en cada pocillo con un mililitro de medio tratado con urinario o de control, según corresponda, y devuelva las células a la incubadora. Los osteoclastos multinucleados deben aparecer entre los días tres y cuatro del cultivo. Para evaluar el tamaño y la morfología de los osteoclastos recién diferenciados, tiña las células con fosfatasa ácida resistente al tartrato, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, e imagenifica toda la superficie de cada pocillo con una resolución suficiente para distinguir los núcleos celulares.

Cuando se hayan obtenido imágenes de todos los pocillos, abra una imagen de un pozo con el software ImageJ de código abierto y verifique las unidades de escala. A continuación, marque la casilla Global en la ventana emergente para aplicar las nuevas unidades de escala a todas las imágenes posteriores. En el menú Analizar, seleccione Establecer medidas y active las casillas Área y Mostrar etiqueta.

Desmarque todas las demás casillas. En el menú Analizar, abra Herramientas, luego el Administrador de regiones de interés y seleccione la herramienta de selección rectangular en la ventana principal de ImageJ. Delinee una región de interés de aproximadamente 1.000 por 1.000 micrómetros y haga clic en el botón Agregar para agregar la selección al Administrador de regiones de interés.

A continuación, haga clic en Más, Guardar para guardar la región. Para crear una copia de una de las cinco regiones que se van a analizar, seleccione la región de interés en el Administrador de regiones de interés y haga clic con el botón derecho dentro del área seleccionada para duplicar la región. Marque las casillas Mostrar todo y Etiquetas y seleccione la herramienta de selección de polígonos para delinear manualmente uno de los osteoclastos en la región de interés duplicada.

Para agregar este esquema al Administrador de regiones de interés, haga clic en Agregar en la ventana Administrador de regiones de interés. Cuando se hayan agregado todos los osteoclastos, seleccione todos los contornos y haga clic en Medir para medir sus superficies. A continuación, transfiera las mediciones que aparecen en la ventana de resultados a una hoja de cálculo.

Para evaluar la función de los osteoclastos tratados con urinario, un día antes de añadir el medio de diferenciación, se colocan células RAW de un cultivo de células confluentes con un 85 a un 90% en una placa de ensayo osteo de 24 pocillos en un medio de crecimiento, como se acaba de demostrar. Al día siguiente, reemplace suavemente el sobrenadante con un urinario de diferenciación que contenga medio y permita que las células RAW se diferencien en osteoclastos, como se acaba de demostrar. En el quinto día de osteoclastogénesis, reemplace el medio que contiene urinario con una solución de lejía al 10% para eliminar las células de la superficie mimética ósea.

Después de cinco minutos a temperatura ambiente, lave los pocillos dos veces con agua desionizada y déjelos secar al aire. A continuación, tiñe las sales de calcio en las áreas no reabsorbidas de cada pocillo con una solución de sal de sodio S rojo S al 1%. Después de 10 a 15 segundos, retire la solución de alizarina y lave suavemente los pocillos tres o cuatro veces con agua.

Para convertir una imagen RGB de los pocillos teñidos de alizarina a un formato de 8 bits en escala de grises, en el menú Imagen, seleccione Tipo y 8 bits. A continuación, utilizando la herramienta de selección ovalada, delinee toda la superficie del pozo que se va a analizar para la reabsorción y guarde la región de interés, como se acaba de demostrar. Para facilitar la selección del umbral, seleccione Editar y Borrar fuera para borrar todas las entidades fuera de la región de interés definida.

Duplique la región de interés como se acaba de demostrar y seleccione Ajustar umbral en el menú Imagen, ajustando la barra deslizante para seleccionar un umbral apropiado. Todas las áreas reabsorbidas deben estar por encima del umbral y aparecer en blanco, mientras que todas las áreas no reabsorbidas deben estar por debajo del umbral y aparecer en rojo. Para finalizar la selección del umbral, haga clic en Aplicar en la ventana Umbral y guarde la imagen binaria final en el formato adecuado que le interese.

Para definir las mediciones que se tomarán dentro de la región de interés, en el menú Analizar, seleccione Establecer mediciones y marque las casillas Área, Fracción de área y Límite hasta el umbral y desmarque todas las demás casillas. Luego, para obtener la fracción de área reabsorbida directamente dentro de la ventana de resultados, invierta la imagen binaria duplicada seleccionando Invertir en el menú Editar y teniendo cuidado de que la región principal de interés esté seleccionada en la imagen binaria final y mida la fracción de área reabsorbida. Los cambios en el número y tamaño de los osteoclastos recién diferenciados en respuesta al uranio son fácilmente visibles en imágenes compuestas de pozos completos, así como en imágenes ampliadas de regiones seleccionadas de interés.

El tamaño de los osteoclastos cultivados en diferentes condiciones de cultivo se puede analizar, como se acaba de demostrar, delineando todos los osteoclastos dentro de cada región y midiendo el área de cada célula delineada. Para investigar el impacto del uranio en la actividad de resorción de osteoclastos, las células RAW 264.7 se siembran y diferencian en placas de superficie osteomiméticas. Al final del ensayo, se retiran los osteoclastos y se tiñen las áreas no reabsorbidas y se obtienen imágenes como se demuestra.

A continuación, las imágenes se convierten a escala de grises de 8 bits y se umbralizan para facilitar el cálculo de las áreas reabsorbidas. Este procedimiento también se puede aplicar al estudio del impacto de otros metales pesados en la osteoclastogénesis.