Un ensayo Geotaxis negativa iterativo rápido automatizado para analizar comportamiento escalar adulto en un modelo de Drosophila de la neurodegeneración
12 de septiembre de 2017
Este protocolo paso a paso analiza el comportamiento de geotaxis negativa de Drosophila mediante un sistema automatizado de varios cilindro que aloja cientos de moscas y sincroniza su acción por un motor eléctrico. Sobre sincronización, es analizar comportamiento mosca geotaxis negativa, grabados digitalmente y analizados usando el software RflyDetection diseñado.
El objetivo general de este ensayo automatizado de geotaxis negativa rápida e iterativa es analizar los déficits de trepado en adultos de Drosophila asociados con la neurodegeneración. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como el mecanismo de los déficits locomotores asociados con la neurodegeneración. La principal ventaja de esta técnica es que la actividad de trepado de las moscas puede analizarse de manera automatizada y con alta precisión.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia y el diagnóstico de la neurodegeneración, ya que las enfermedades neurodegenerativas están frecuentemente asociadas con una pérdida progresiva de la capacidad de movimiento y una reducción de la esperanza de vida y la neurodegeneración dependiente de la edad. Primero tuvimos la idea para este método. Queríamos medir la actividad locomotora de Drosophila adulto de una manera más precisa.
Para realizar la recolección de moscas, comience manteniendo las moscas en comida estándar para moscas a 25 grados Celsius, 70% de humedad y a un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Recolecte las moscas vírgenes UAS-Dicer2 DDC-GAL4 bajo anestesia con dióxido de carbono. Cruze las vírgenes con moscas macho adultas de dos días de edad que lleven los siguientes genotipos, con una proporción macho/hembra de uno a dos.
Recolecte por separado machos y hembras recién emergidos en tres frascos para cada grupo por experimento, colocando 10 moscas en cada frasco de moscas regular con comida estándar. Luego, ajuste los frascos a 25 grados Celsius. Para realizar el ensayo RING automatizado, transfiera 10 moscas unisex por genotipo a cada frasco.
Luego, asegure el frasco con un tornillo. Analice las moscas de control y las moscas que llevan diferentes genotipos juntos para cada conjunto de experimentos. Encienda la cámara digital colocada frente al aparato y, una vez que las moscas estén cargadas y listas, comience a grabar.
La cámara debe colocarse horizontalmente y a una distancia adecuada del aparato RING para capturar las posiciones en ubicaciones relativamente precisas de todas las moscas. Después de permitir un minuto para que las moscas se asienten en los frascos, encienda el controlador de pasos que controla el controlador de pasos. Esto acciona el pequeño motor eléctrico para controlar la palanca adjunta, de modo que consecutivamente se eleva y golpea el aparato cuatro veces en dos segundos.
Después de golpear el aparato, observe que las moscas comienzan a ascender por la pared. Con la grabación aún activa, repita la sincronización como se ha demostrado, a intervalos de 60 segundos durante tres a cinco ensayos consecutivos. Repita el experimento para moscas de cinco, 15, 25 y 35 días de edad.
Realice al menos tres experimentos independientes para cada grupo para cada experimento, con al menos 30 moscas recolectadas o tres frascos. Para analizar los datos, importe el video grabado a la computadora. Para cada ensayo, tome una instantánea del video a los seis segundos después de golpear.
En el software de detección de moscas R, use el menú de archivo para importar la imagen de la instantánea. Luego, usando el icono de línea base en la barra de herramientas, configure con precisión las líneas base superior e inferior del frasco y luego use el cursor para marcar las líneas base superior e inferior en la imagen. Dentro de la barra de Configuración, en el campo Moscas en Rect, ingrese el número de moscas por frasco y, en el campo Altura del tubo, ingrese la longitud del frasco.
Las posiciones individuales de las moscas se detectan y se etiquetan con puntos en la pantalla para cada frasco. Observe que en una tabla en el panel derecho, el software determina automáticamente la distancia de trepado para cada mosca y muestra los valores promediados de 10 moscas en cada frasco. Presente los datos como el promedio más o menos SEM.
Calcule los valores P de significación utilizando un ANOVA de una vía con una prueba de comparación múltiple de Bonferroni. El análisis de las moscas designadas Dicer2 utilizando el ensayo RING automatizado presentado en este video mostró una disminución dependiente de la edad en la distancia de trepado en un período de seis segundos para moscas macho y hembra, lo que sugiere que la expresión aux en neuronas dopaminérgicas o DA es crucial para la actividad locomotora de las moscas. La capacidad de trepado no parece verse afectada por la sobreexpresión de auxGFP en neuronas DA y la coexpresión de auxR y auxGFP en neuronas DA rescatadas del fenotipo RNAi.
Una vez dominado, esto se puede hacer en dos o tres horas si se realiza correctamente. Tener este desarrollo es ahora una forma para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploren la neurodegeneración en Drosophila melanogaster. No olvide que trabajar con el aparato RING eléctrico puede ser extremadamente peligroso y cada confirmación debe estar apretada firmemente y revisada cuidadosamente antes de realizar este procedimiento.
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Resumen
Este protocolo describe un método automatizado para analizar el comportamiento de geotaxis negativa en Drosophila, centrándose en los déficits de escalada en adultos relacionados con la neurodegeneración. La técnica utiliza un sistema de múltiples cilindros para sincronizar y registrar los movimientos de las moscas, proporcionando información sobre los déficits locomotores.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Análisis del comportamiento
- Neurodegeneración
Antecedentes
- Drosophila sirve como organismo modelo para estudiar enfermedades neurodegenerativas.
- El comportamiento de geotaxis negativa es una medida de la capacidad locomotriz en moscas.
- La neurodegeneración con frecuencia conduce a una pérdida progresiva del movimiento y de la longevidad.
- Los sistemas automatizados mejoran la precisión de los ensayos conductuales.
Objetivo del estudio
- Analizar los déficits de escalada en Drosophila asociados con neurodegeneración.
- Explorar los mecanismos subyacentes a los déficits locomotores.
- Mejorar la precisión de la medición de la actividad locomotora de las moscas.
Métodos Utilizados
- Sistema automatizado de múltiples cilindros para el movimiento sincronizado de moscas.
- Grabación digital del comportamiento de geotaxis negativa.
- Análisis mediante el software de diseño propio RflyDetection.
- Ensayo rápido iterativo para la recopilación de datos de alto rendimiento.
Resultados principales
- Sincronización exitosa de los movimientos de las moscas para un análisis preciso.
- Identificación de déficits en la escalada asociados a neurodegeneración.
- El análisis automatizado demostró ser eficiente y confiable.
- Implicaciones potenciales para la terapia y el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas.
Conclusiones
- El ensayo automatizado proporciona un método robusto para estudiar el comportamiento locomotor en Drosophila.
- Los conocimientos obtenidos podrían orientar enfoques terapéuticos para la neurodegeneración.
- Esta técnica mejora la comprensión de la relación entre el movimiento y las afecciones neurodegenerativas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este ensayo automatizado de alto rendimiento permite la cuantificación rápida de déficits locomotores en modelos de Drosophila de neurodegeneración, apoyando la validación temprana de dianas al proporcionar lecturas conductuales objetivas y reproducibles. El método mejora la confianza predictiva en el cribado preclínico al permitir el análisis simultáneo de cientos de moscas de múltiples genotipos y grupos de edad, facilitando la evaluación eficiente de compuestos o modificadores genéticos. Su integración en flujos de trabajo de descubrimiento ayuda al desacoplamiento mecanicista de dianas neurodegenerativas mediante la fenotipificación estandarizada y escalable.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de déficits de trepado dependientes de la edad, asociados a neurodegeneración en modelos genéticos.
- Valor operativo: Facilita la validación funcional de objetivos terapéuticos mediante la medición de alta capacidad de la actividad locomotora como un indicador de la integridad neuronal.
- Valor predictivo: Genera datos conductuales cuantitativos que apoyan la selección de carteras al identificar genotipos con deterioro motor significativo.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Produce métricas estandarizadas y reproducibles de geotaxis negativa adecuadas para la validación de ensayos en campañas de cribado enfocadas en neurodegeneración.
- Valor operativo: Permite el cribado rápido de modificadores genéticos o farmacológicos mediante captura de video automatizada y análisis con el software RflyDetection.
- Escalabilidad: Procesa datos de cientos de moscas por corrida, aumentando el rendimiento y reduciendo la variabilidad en comparación con ensayos manuales.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia Translacional: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad que permite evaluar fenotipos locomotores que paralelan los déficits motores clínicos en trastornos neurodegenerativos.
- Continuidad Preclínica: Permite la evaluación longitudinal a lo largo de las edades de la mosca (5, 15, 25, 35 días) para modelar la neurodegeneración progresiva.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Posibilita la evaluación de experimentos de rescate genético (por ejemplo, coexpresión de auxR/auxGFP) para validar la especificidad del blanco y la participación de la vía.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, ofreciendo un punto final conductual cuantitativo que conecta la manipulación genética con el resultado fenotípico en modelos de neurodegeneración.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la vinculación de la expresión génica (por ejemplo, aux en neuronas dopaminérgicas) con la función locomotriz a través de mediciones iterativas de geotaxis negativa.
- Selección: Proporciona resultados estandarizados y listos para ensayos (distancia de escalada en 6 segundos) que permiten comparaciones fiables entre distintas condiciones experimentales.
- Análisis: Genera datos de media ± EE con rigor estadístico (ANOVA de un factor, corrección de Bonferroni) para facilitar comparaciones entre grupos y pruebas de significancia.
- Investigación Traducional: Conecta las mediciones conductuales con mecanismos neurodegenerativos, apoyando evaluaciones fenotípicas alineadas con biomarcadores en modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el cribado conductual longitudinal en múltiples genotipos, edades y grupos de tratamiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la fenotipificación conductual cuantificable y de alta resolución.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante la sincronización automatizada, la grabación digital y el análisis basado en software.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia en las decisiones de avance o interrupción al permitir una evaluación rápida de los déficits locomotores en grandes tamaños de muestra.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en datos robustos sobre la progresión fenotípica dependiente de la edad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de Drosophila, mantenimiento de cruces genéticos y configuración de ensayos conductuales.
- Depende de instrumentación especializada, incluyendo el aparato RING automatizado, controlador de pasos, cámara digital e iluminación compatible.
- Necesita infraestructura computacional para la importación de videos, extracción de imágenes fijas y funcionamiento del software RflyDetection.
- Implica la estandarización de condiciones ambientales (25°C, 70% humedad, ciclo de 12 h luz/12 h oscuridad) y protocolos de preparación de viales.
- Incluye consideraciones de seguridad debido a los componentes eléctricos; el aparato debe asegurarse y verificarse antes de su operación.
