Name: Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Aprende a generar anticuerpos monoclonales humanos desde linfocitos B circulantes en sangre. Este método permite discriminar antígenos estrechamente relacionados para aplicaciones en inmunoterapia.

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Agradecemos el servicio de citometría "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) asistencia técnica experta. Agradecemos también todo el personal de producción de proteína recombinante (P2R) y de plataformas de impacto (INSERM 1232 Santé SFR, Biogenouest, Nantes) por su apoyo técnico. Agradecemos Emmanuel Scotet y Richard Breathnach comentarios constructivos sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado financieramente por el proyecto IHU-Cesti financiado por el programa de gobierno francés «Investissements Avenir», administrado por la Agencia de investigación nacional de francés (ANR) (ANR-10-IBHU-005). El proyecto IHU-Cesti es apoyado también por Nantes Métropole y Région Pays de la Loire. Este trabajo fue realizado en el contexto del programa IGO LabEX apoyado por la Agencia Nacional de investigación a través de la inversión del futuro programa ANR-11-LABX-0016-01.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo propuesto es un método eficaz para la generación de mAbs humana directamente de las células B Ag específicos circulantes en la sangre. Combina tres aspectos importantes: (i) el uso de un enriquecimiento magnético asociado de tetrámero, que permite un aislamiento ex vivo incluso raras Unión Ag de células de B; (ii) una estrategia bloquea que utiliza tres tetrámeros Ag (dos relevantes y uno irrelevante) etiquetados con tres fluorocromos diferentes para aislar, mediante citometría de flujo, sólo las cé...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56508/generation-discriminative-human-monoclonal-antibodies-from-rare">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood</a>.
The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,&#160;Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1 
1Centre R&#233;gional de Recherche en Canc&#233;rologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Universit&#233; de Nantes 
2CHU Nantes
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,3,&#160;Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2&#160; 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Universit&#233; d&#39;Angers, Universit&#233; de Nantes 
2LabEx IGO, &#34;Immunotherapy, Graft, Oncology&#34; 
3CHU, Nantes, France

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Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

El método aquí descrito permite la producción rápida y versátil de anticuerpos monoclonales completamente humanos (mAbs) contra un antígeno deseado (Ag). mAbs son herramientas esenciales en muchas aplicaciones de investigación básica in vitro e in vivo: flujo cytometry, histología, experimentos de western-blotting y bloqueo, por ejemplo. Además, mAbs se utilizan más en medicina para tratar enfermedades autoinmunes, cáncer y para el control de rechazo de trasplante1. Por ejemplo, mAbs anti-CTLA-4 y anti-PD-1 (o anti-PD-L1) recientemente fueron utilizados como inhibidores de control inmune en cáncer tratamientos2.
Los mAbs primeros fueron producidos por inmunoglobulina (Ig)-secretoras de hibridomas obtienen de las células esplénicas de ratones inmunizados o ratas. Sin embargo, la fuerte respuesta inmune contra mAbs murino o rata impide su uso terapéutico en humanos, debido a su rápida separación y el probable inducción de reacciones de hipersensibilidad3. Para abordar este problema, secuencias de la proteína animal de mAbs han sido parcialmente reemplazadas por los humanos para generar anticuerpos de ratón-humano o humanizados quiméricos llamados. Sin embargo, esta estrategia sólo parcialmente disminuye la inmunogenicidad, aumentando substancialmente el costo y la escala de tiempo de producción. Hay varias estrategias para esto y una mejor solución es generar mAbs humana directamente de las células B humanas. Uno de ellos es el uso de la visualización de fagos o levadura. Se trata de mostrar los dominios variables de una biblioteca combinatoria de Ig humana al azar pesado y luz cadenas en fagos o levaduras y llevar a cabo un paso de selección utilizando el antígeno específico de interés. Un gran inconveniente de esta estrategia es que las cadenas pesadas y ligeras están aleatoriamente asociadas, llevando a un incremento muy grande en la diversidad de los anticuerpos generados. Anticuerpos obtenidos no corresponden a las que surgirían de una respuesta inmune natural contra un Ag particular. Por otra parte, plegamiento de la proteína humana y modificaciones postraduccionales no son sistemáticamente reproducidas en procariotas o en levaduras. Un segundo método de producción humana mAb es la inmortalización de células B humanas naturales, por infección del virus Epstein - Barr o expresión de los factores anti-apoptótica BCL-6 y BCL-XL4. Sin embargo, este método sólo es aplicable a las células de memoria B y es ineficiente, que requieren la proyección de numerosos mAb inmortalizado B células productoras para identificar los clones de mAb pocos (si cualquier) con la especificidad antigénica deseada. El método es costoso y desperdiciador de tiempo.
Un nuevo protocolo recientemente se ha descrito para la producción de mAbs humano aislado solo de células B5. Se basa en un optimizado unicelular revertir la transcripción-polimerasa reacción en cadena (RT-PCR) para la amplificación de ambos la pesada luz cadena y codificación de segmentos de una sola célula B ordenado. Esto es seguido por la clonación y expresión de estos segmentos en un sistema de expresión eucariotas, lo que permite la reconstrucción de un mAb plenamente humana. Este protocolo se ha utilizado con éxito a partir de las células de B de donantes vacunados. Las células se cosecharon varias semanas después de la vacunación para obtener frecuencias más altas de las células B contra el Ag deseado y así limitar el tiempo requerido para la detección del6. También se han producido otros mAbs plenamente humanas de infectados por el VIH+ (Virus de inmunodeficiencia humana) pacientes7 y melanoma pacientes8. A pesar de estos avances, todavía hay no hay procedimiento disponible que permite el aislamiento de células B Ag específica independientemente de su fenotipo de memoria o de frecuencia.
El procedimiento aquí descrito conduce a aislamiento eficiente ex vivo de las células B humanas circulantes basados en su especificidad BCR, seguido por la producción de plenamente humana mAbs específicos de antígeno en alto rendimiento y con un tiempo de proyección baja. El método no se limita a las células de memoria B o células B secretoras de anticuerpos inducidas después de una respuesta inmune, pero puede aplicarse también al repertorio de células B humanos ingenuos. Que funciona incluso a partir de las células B Ag-específica presentes en muy baja frecuencia es un buen indicador de su eficacia. El principio del método es como sigue: se tiñen las células mononucleares periféricas en sangre (PBMC) con dos tetrámeros que presentan el antígeno de interés, cada uno marcado con un fluorocromo diferente (por ejemplo, ficoeritrina (PE) y Allophycocyanin (APC)), y un tercer tetrámero que presenta un antígeno estrechamente relacionado conjugado con un fluorocromo terceros (p. ej., brillante violeta 421 (BV421)). Para enriquecer las células de antígeno-que ata, las células se incuban luego con bolas recubiertas con anti-PE y Abs anti-APC y ordenados en columnas de separación celular. La fracción de células APC PE+ + es seleccionada, manchadas con una variedad de mAbs específicos para diferentes tipos de células PBMC permitir la identificación de las células B y sometida a clasificación de celda de citometría de flujo. Las células de B PE+ y APC+, pero brillante violeta-, están aisladas. Este paso selecciona en células que no son las células de B o no se unen al antígeno tetramerized, pero unen a PE o APC (estas células serán PE+ APC– o PE– APC+) o a la parte no-antígeno de los tetrámeros usado (estos las células serán BV421+). Las células de B no altamente específicas para el epitopo de interés también se seleccionan en este paso (estas células también será BV421+). Por lo tanto, este método puede purificar células B altamente específicas expresan receptores de las células B (BCR) capaces de discriminar entre antígenos relacionados muy de cerca conexos dos. Las células B específicas se recogen en tubos y su cDNAs de la polimerización en cadena-amplificados de la Ig (los ácidos desoxirribonucleico complementarios) clonado y expresado por una línea de células humanas como mAbs IgG secretada.
Como una prueba de concepto, este estudio describe la generación eficiente de mAbs humanos, que reconoce un péptido presentado por una clase complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC-I) molécula y puede discriminar entre este péptido y otros péptidos cargados en el mismo MHC-I alelo. Aunque el nivel de complejidad de este Ag es importante, este método permite (i) recuperación de alto rendimiento de mAbs específicos de Ag; (ii) producción de mAbs capaces de discriminar entre dos estructuralmente cerca de Ags. Este enfoque puede ser extendido a pacientes infectados o vacunados sin ninguna modificación del protocolo y también ya ha sido implementado con éxito en un sistema humanizado de la rata del9. Por lo tanto, este estudio describe un enfoque versátil y eficiente para generar mAbs plenamente humana que pueden ser utilizados en la inmunoterapia y la investigación básica.

<table><tbody><tr><td>Línea celular HEK 293A</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco de life technologies</td><td>21969-035</td><td>(+) 4,5g/L D-Glucosa 0,11g/L Piruvato de sodio (-) L-Glutmina</td></tr><tr><td>RPMI medium1640 (1X)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>PAA</td><td>K45-001</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td>100X Conc</td></tr><tr><td>PBS-Solución salina tamponada con fosfato (10X) pH 7,4</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 0,5M pH = 8</td><td>Invitrogen de Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Dominique Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll - separación de linfocitos medio</td><td>EuroBio</td><td>CMSMSL01-01</td><td>densidad 1,0777+/-0,001</td></tr><tr><td>estreptavidina R-ficoeritrina conjugado</td><td>Invitrogen de Life Technologies</td><td>S21388</td><td>premiun grado 1mg/ml contiene 5mM azida sódica</td></tr><tr><td>Estreptavidina, aloficocianina conjugada</td><td>Invitrogen de thermoFisher scientific</td><td>S32362</td><td>1mg/ml 2mM azida de grado premium</td></tr><tr><td>Violeta brillante 421 estreptavidina</td><td>Biolegend</td><td>405225</td><td>conc : 0,5mg/ml</td></tr><tr><td>MicroBeads magnéticos conjugados Anti-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeads magnéticos conjugados Anti-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACs o separador QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302/130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>LS Columnas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD3 BV510 BD horizonte</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>563109</td><td>Dilución utilizada 1:20</td></tr><tr><td>CD19 FITC</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>345788</td><td>Dilución utilizada 1:20</td></tr><tr><td>CD14 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>561116</td><td>Dilución utilizada 1:50</td></tr><tr><td>CD16 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>338440</td><td>Dilución utilizada 1:50</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>51-68981E (559925)</td><td>Dilución usada 1:1000</td></tr><tr><td>Citómetro clasificador de células FACS ARIA III Tubos</td> de PCR de 8 tiras <td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td>321-10-061</td><td></td></tr><tr><td>Gradillas para 96 microtubos</td><td>Dominique Dutscher</td><td>45476</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Inhibidor de la ribonucleasa (recombinante)</td><td>Invitrogen de thermoFisher scientific</td><td>10777-019</td><td>cantidad:5000U (40U/ul)</td></tr><tr><td>Agua destilada Libre de dnasa/rnasa</td><td>Gibco</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>Oligod(T)18 mRNA Primer</td><td>New England BioLabs</td><td>S1316S</td><td>5.0 A260unit</td></tr><tr><td>Hexámeros aleatorios</td><td>Invitrogen de thermoFisher scientific</td><td>N8080127</td><td>cantidad: 50uM, 5nmoles</td></tr><tr><td>Superíndice III Transcriptasa inversa</td><td>Invitrogen de thermoFisher scientific</td><td>18080-044</td><td>cantidad : 10000U (200U/ul)</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polimerasa</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, grado de biología molecular</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td>4 * 100umol</td></tr><tr><td>5LVH1</td><td>Eurofins</td><td>ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimadores exteriores - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVH3</td><td>Eurofins</td><td>AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones exteriores - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVL4_6</td><td>Eurofins</td><td>CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones exteriores - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVH5</td><td>Eurofins</td><td>CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimadores exteriores - Forward Prmers</td></tr><tr><td>3HuIgG_const_anti</td><td>Eurofins</td><td>TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones inversas para Ig humana- Detección de bacterias por PCR</td></tr><tr><td>3CuCH1</td><td>Eurofins</td><td>GGGAATTCTCACA GGAGACGA</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones inversas para Ig humano</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_5_7</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones delanteras</td></tr><tr><td>5AgeIVH3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGGAG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones directas</td></tr><tr><td>5AgeIVH3_23</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTGTTGGAG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas -Imprimaciones directas</td></tr><tr><td>5AgeIVH4</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones delanteras</td></tr><tr><td>5AgeIVH4_34</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas -Cebadores delanteros</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_18</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Cebadores delanteros</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_24</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones directas</td></tr><tr><td>5AgeIVH3__9_30_33</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Cebadores delanteros</td></tr><tr><td>5AgeIVH6_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones delanteras</td></tr><tr><td>3SalIJH1_2_4_5</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones inversas</td></tr><tr><td>3SalIJH3</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones inversas</td></tr><tr><td>3SalIJH6</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGGACCGTG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas -Imprimaciones inversas</td></tr><tr><td>5' LVk1_2</td><td>Eurofins</td><td>ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones exteriores -Cebadores</td></tr><tr><td>delanteros 5'LVk3</td><td>Eurofins</td><td>CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones directas</td></tr><tr><td>5'LVk4</td><td>Eurofins</td><td>ATTTCTCTGTGTGC TCTGGATCTCTG</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones directas</td></tr><tr><td>3'Ck543_566</td><td>Eurofins</td><td>GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones inversas- Cribado de PCR de bacterias</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones directas</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1_9_1&ndash; 13</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Cebadores interiores -Cebadores delanteros</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1D_43_1_8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Cebadores interiores -Cebadores delanteros</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones delanteras</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2_28_2_30</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones delanteras</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_11_3D_11</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTGTGTGACACAGTC</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas - Imprimaciones directas</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_15_3D_15</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimadores internos -Imprimadores delanteros</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_20_3D_20</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTGTGACGCAGTCTCT</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones directas</td></tr><tr><td>5'AgeVk4_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones delanteras</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk1_2_4</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimadores internos -Cebadores delanteros</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk3</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Cebadores delanteros</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk5</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones delanteras</td></tr><tr><td>5'LVl1</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones directas</td></tr><tr><td>5'LVl2</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones delanteras</td></tr><tr><td>5'LVl3</td><td>Eurofins</td><td>GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Forward cebadores</td></tr><tr><td>5'LVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Cebadores delanteros</td></tr><tr><td>5'LVl6</td><td>Eurofins</td><td>GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones delanteras</td></tr><tr><td>5'LVl7</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Cebadores delanteros</td></tr><tr><td>5LVl8</td><td>Eurofins</td><td>GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones delanteras</td></tr><tr><td>3'Cl</td><td>Eurofins</td><td>CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG</td><td>Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Adelante cebadores</td></tr><tr><td>5'AgeIVl1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTGTGTGCTGACKCAG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones interiores -cebadores delanteros</td></tr><tr><td>5'AgeIVl2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -cebadores delanteros</td></tr><tr><td>5'AgeIVl3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -cebadores delanteros</td></tr><tr><td>5'AgeIVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -cebadores delanteros</td></tr><tr><td>5'AgeIVl6</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTATGCTGACTCAG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -cebadores delanteros</td></tr><tr><td>5'AgeIVl8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -cebadores delanteros</td></tr><tr><td>3'XhoICl</td><td>Eurofins</td><td>CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG</td><td>Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -Imprimaciones inversas - Detección de PCR</td></tr><tr><td>de bacterias Ab-vec-sense</td><td>Eurofins</td><td>GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC</td><td>Detección de PCR de bacterias</td></tr><tr><td>QA Agarose-TM, Grado de Biología Molecular</td><td>MP Bio</td><td>AGAH0500</td><td></td></tr><tr><td>NucleoFast 96 Placa de PCR</td><td>Macherey Nagel</td><td>743.100.100</td><td></td></tr><tr><td>Enzima Age I HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3552L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzima SalI HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3138L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzima Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzima BSIWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553L</td><td>10000U/ml</td></tr><tr><td>HCg1 (Número de acceso al Genbank FJ475055)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCk (Número de acceso del Genbank FJ475056 )</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCl (Accesión del Genbank número FJ517647)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>Invitrogen de thermoFisher scientific</td><td>15224.017</td><td>100U (1U/ul)</td></tr><tr><td>2X YT medio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1003-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma Aldrich 10835242001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB (Luria Bertani) Caldo (Lennox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospina Plásmido ADN, ARN y purificación de proteínas</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.250</td><td></td></tr><tr><td>Jet PEI Reactivo de transfección de ADN</td><td>PolyPlus</td><td>101-40</td><td></td></tr><tr><td>Fondo planoPlaca de 96 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>fondo en V Placa de 96 pocillos</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>055142</td><td></td></tr><tr><td>Nunc easy 175 cm2</td><td>Frascos Nunc/Thermofisher</td><td>12-562-000</td><td></td></tr><tr><td>ELISA/ELISPOT tampón de recubrimiento</td><td>eBiosciences</td><td>00-0044-59</td><td></td></tr><tr><td>Nunc maxisorp fondo plano 96 pocillos placas ELISA Nunc</td><td>/Thermofisher</td><td>44-2404-21</td><td>alta unión</td></tr><tr><td>a proteínas Anti-humano IgG Ab conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP)</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>55788</td><td></td></tr><tr><td>Sustrato TMB</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina</td><td>Sigma</td><td>S0677</td><td></td></tr><tr><td>1 mL-HiTrap proteína A columna HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0402-01</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Columna KTA FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>18190026</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td> GE <td>Healthcare</td><td></td> 17517501 <td></td></tr><tr><td>NGC Quest 10 Plus Sistema de cromatografía</td><td>BioRad</td><td>7880003</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células b antígeno específicas raras circulan en sangre

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Anticuerpos monoclonales (mAbs) son poderosas herramientas útiles para tanto investigación fundamental y en biomedicina. Su alta especificidad es indispensable cuando el anticuerpo tiene que distinguir entre estructuras muy relacionadas (por ejemplo, una proteína normal y su una versión mutada). La actual forma de generar estos mAbs discriminativa implica investigación extensa de múltiples células B productoras de AC, que es costosa y consume tiempo. Proponemos aquí un método rápido y rentable para la generación de discriminativo, mAbs plenamente humana a partir de linfocitos B circulantes de sangre humana. La originalidad de esta estrategia es debido a la selección de antígeno específico células de Unión B combinada con la selección contra de todas las otras células, usando disponible periféricos sanguíneos mononucleares células (PBMC). Una vez que las células B específicas aisladas, secuencias de ADNc (complementario ácido desoxirribonucleico) que codifica para el mAb correspondiente se obtienen utilizando la tecnología de reacción en cadena de la transcripción-polimerasa reversa (RT-PCR) unicelular y expresado posteriormente en humanos células. Dentro de tan poco como 1 mes, es posible producir miligramos de mAbs humano altamente discriminativo contra prácticamente cualquier antígeno deseado naturalmente detectado por el repertorio de células B.

A partir de PBMC procedentes de donantes sanos, presenta proyecto la generación de mAbs humana, que reconocen el péptido Pp65495 (Pp65, de citomegalovirus humano) presentado por la clase complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC-I) molécula (HLA - A * 0201 HLA-A2). Estos mAbs pueden discriminar entre este complejo y complejos que representan otros péptidos cargados en el mismo MHC-I molécula.
PBMC fueron manchados ...

Se describe un método para la producción de anticuerpos humanos específicos para un antígeno de interés, a partir de células B circulantes en la sangre humana. Generación de estos anticuerpos naturales es eficiente y rápido, y los anticuerpos obtenidos pueden discriminar entre antígenos muy similares.

Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

El objetivo general de este procedimiento es producir anticuerpos monoclonales completamente humanos contra un antígeno deseado a partir de los linfocitos B humanos que circulan en la sangre. Este protocolo permite la generación de anticuerpos monoclonales que pueden discriminar entre antígenos altamente relacionados. Para algunas aplicaciones, como la inmunoterapia, puede ser indispensable una orientación precisa de un antígeno.Las ventajas de esta técnica son que se puede realizar a partir de la sangre de donantes sanos o inmunizados y permite el aislamiento incluso de células B raras de unión a antígenos. Si bien este método se describe a partir de muestras humanas, también se puede aplicar a animales que pueden ser preinmunizados. La demostración visual de este método es crítica, ya que el procedimiento realmente se basa en una estrategia de activación analítica múltiple bastante compleja de linfocitos B discriminados.El procedimiento será realizado por Melinda. Es ingeniera asistente de nuestro laboratorio. Primera pipeta de 35 mililitros de suspensión celular diluida en un gradiente de densidad de 15 mililitros en un tubo cónico de 50 mililitros.A continuación, coloque el tubo cónico en un rotor de cubo oscilante con los frenos apagados y centrifuga a 1290 veces la gravedad durante 25 minutos a temperatura ambiente. A continuación, en la interfaz del medio de gradiente de densidad y la capa de plasma, aspire cuidadosamente la capa de células mononucleares y transfiérala a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Agregue la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifuga a 460 veces la gravedad durante cinco minutos.A continuación, vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de solución salina tamponada con fosfato con suero bovino fetal al 2%. Agregue tetrámeros conjugados hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro. Mezclar bien y luego incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos en la campana de flujo laminar, protegida de la luz.A continuación, añada 10 mililitros de tampón de separación de células heladas a la suspensión de células. Centrifuga la suspensión de la célula a 460 veces la gravedad durante cinco minutos. Al pellet celular obtenido, agregue 500 microlitros de tampón de separación celular frío y 50 microlitros de dos variantes de microperlas magnéticas e incube la suspensión celular durante 20 minutos.A continuación, vuelva a suspender el pellet de celda en un tampón de separación de celdas helado. Transfiera con cuidado la suspensión de la celda en la parte superior de una columna equilibrada y deje que se drene por completo. A continuación, enjuague el tubo con tres mililitros de tampón de separación celular y transfiera el tampón a la columna.Después de enjuagar la columna tres veces, retírela del imán y colóquela en un tubo colector cónico de 25 mililitros. Después de agregar cinco mililitros de tampón de separación helado en la parte superior de la columna, enjuague rápidamente las celdas de la columna con la ayuda de un émbolo. Resuspender el pellet celular con un cóctel de anticuerpos antihumanos y 7AAD en un volumen total de 100 microlitros de solución salina tamponada con fosfato con suero bovino fetal al 2%.Luego, incuba las células a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, utilice un citómetro clasificador de células para clasificar células B específicas a nivel de célula única que no supere más de 1.000 eventos por segundo. A continuación, recoja las células B individuales clasificadas en tubos de PCR de 8 tiras previamente llenos con 10 microlitros de solución salina tamponada con fosfato 1X y 10 unidades de inhibidor de ARNasa y colóquelos en una rejilla para 96 microtubos.Congele rápidamente los tubos a menos 80 grados centígrados. Calentar las muestras congeladas en un baño seco mantenido a 70 grados centígrados durante cinco minutos para lisar las células. A continuación, coloque la tira en hielo y comience a constituir la mezcla maestra de transcripción inversa.Una vez que se haya preparado la mezcla maestra de transcripción inversa, programe el termociclador. Al final de la transcripción inversa, realice PCR anidadas para amplificar los genes de inmunoglobulinas. Identifique los clones positivos visualizando en un gel de agarosa al 1,5% la migración de un producto de PCR de 500 pares de bases para segmentos de codificación y cadena pesada variable y un producto de PCR de 350 pares de bases para segmentos de codificación de cadena ligera variable.Agregue un microlitro del producto de clonación a 45 microlitros de células electrocompetentes TOP10 E. coli. Electroporado. A continuación, añada rápidamente 500 microlitros de medio 2X YT a las células e incube en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Extienda las bacterias transformadas en una placa de ampicilina 2X YT.Luego, incube las placas durante la noche a 37 grados centígrados. A continuación, configure una premezcla de reacción y agregue 25 microlitros en cada tubo de PCR de 8 tiras mantenido en hielo. Luego, use un palillo de dientes estéril para elegir colonias y rayar las colonias en la placa de ampicilina 2X YT.Luego, sumerja los palillos de dientes en el tubo de reacción de PCR. Identifique los clones positivos visualizando en un gel de agarosa al 1,5% la migración de un producto de PCR de 850 pares de bases para el vector de cadena pesada y un producto de PCR de 600 pares de bases para el vector de cadena ligera. En dos mililitros de medio LB, inocular cuatro colonias positivas.Incubar el inoculado a 37 grados centígrados durante la noche a 200 revoluciones por minuto agitando. Siembra 15.000 células embrionarias humanas de riñón en 200 microlitros de Dulbecco's Modified Eagle Medium suplementado con un 10% de suero fetal bovino en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano un día antes de la transfección. Luego incube la placa a 37 grados Celsius durante la noche con 5% de dióxido de carbono.Cotransfectar las células utilizando un reactivo de transfección derivado de polietilenimina lineal. Diluir 0,5 microlitros de reactivo de transfección de ADN con 10 microlitros de 150 milimolares de cloruro de sodio. A continuación, diluya 0,125 microgramos de cada vector expresivo de cadena pesada y ligera variable en 10 microlitros de cloruro de sodio de 150 milimolares.Agite todas las diluciones durante 10 segundos cada una. A continuación, mezcle el reactivo de transfección de ADN previamente diluido con 10 microlitros de solución de ADN. Agite rápidamente la mezcla de transfección de ADN durante 15 segundos e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.Agregue la mezcla de transfección de ADN gota a gota sobre las células y luego agite suavemente la placa. Reemplace el medio 16 horas después de la transfección y cultive las células durante cinco días en medio libre de suero a 37 grados centígrados. A continuación, utilice una pipeta multicanal para aspirar el sobrenadante y transfiéralo a la placa de 96 pocillos con fondo en V.Cubra cada pocillo con una placa de ELISA de 96 pocillos con el antígeno correspondiente a cuatro grados Celsius durante toda la noche en 100 microlitros de tampón de recubrimiento ELISA reconstituido a una concentración final de dos microgramos por mililitro. A continuación, añada 50 microlitros de un sobrenadante celular transfectado a los pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos e incube la placa durante dos horas a temperatura ambiente. A continuación, añada 100 microlitros de anticuerpo antiglobulina G antihumano conjugado con la enzima peroxidasa de rábano picante a una concentración de un microgramo por mililitro e incube el pocillo a temperatura ambiente durante una hora.Por último, añadir 50 microlitros de sustrato cromogénico al pocillo e incubar durante otros 20 minutos. Al final de la incubación, lea la densidad óptica a 450 nanómetros en un espectrofotómetro. Para aislar los linfocitos B específicos, se utilizó una estrategia de compuerta que discriminó los linfocitos B que expresan receptores frente al complejo HLA-A2/Pp65.Inicialmente, las células eran CD19 positivas y CD3 negativas. Finalmente, las células se tiñeron con HLA-A2/Pp65PE y HLA-A2/Pp65APC, pero no con tetrámeros HLA-A2/MelABV421, se comprimieron para obtener las células B altamente específicas. Con esta estrategia de compuertas, se pueden aislar células B selectivas, que pueden diferenciar entre HLA-A2/Pp65 y otros complejos peptídicos HLA-A2 relacionados.A continuación, para estudiar la presencia del anticuerpo PC1.02 frente al tetrámero HLA-A2/Pp65 se realizó un ensayo ELISA. En el gráfico de barras obtenido, el eje y corresponde a las lecturas de densidad óptimas y el eje x corresponde a los péptidos HLA-A2. A partir del ensayo, se muestra que un anticuerpo monoclonal se une al tetrámero HLA-A2/Pp65 de forma dependiente del péptido y del complejo mayor de histocompatibilidad.A continuación, se utilizó la residencia de plasmina de superficie para estudiar la afinidad de unión del anticuerpo PC1.02. A continuación, se obtuvieron datos tabulares para analizar los linfocitos B específicos HLA-A2/Pp65. Se ha demostrado el impacto de la estrategia de exclusión de linfocitos B inespecíficos, los rendimientos de la amplificación del gen de inmunoglobulinas y la producción de anticuerpos monoclonales a partir de linfocitos B específicos HLA-A2/Pp65.Una vez dominada, la técnica, que va desde el aislamiento de antígenos específicos de las células B de la sangre humana hasta la producción de anticuerpos monoclonales, se puede realizar en tan solo un mes. Al realizar este procedimiento, recuerde pasar directamente de la clasificación de células B a la RT-PCR sin pausa.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra un método de generación de anticuerpos a partir de células de mamíferos mediante la introducción de vectores plásmidos con genes de cadena pesada y ligera. Estos vectores interactúan con la polietilenimina y entran en las células formando poliplexos; Más tarde, se traducen en proteínas individuales y se ensamblan en anticuerpos completos, que se secretan en el medio extracelular.

Generación de anticuerpos monoclonales recombinantes a partir de cultivos de células de mamíferos

El video muestra una técnica para generar anticuerpos monoclonales a partir de células B específicas de antígeno. Los vectores de expresión eucariotas que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos, clonados a partir de células B aisladas específicas de antígeno, se introducen en células de mamíferos utilizando poliplexos. Una vez dentro de las células, estos vectores se traducen y los péptidos de cadena pesada y ligera resultantes se ensamblan en anticuerpos, que posteriormente son...

Una técnica para generar anticuerpos monoclonales a partir de células B específicas de antígeno

Este artículo describe un método para la generación y propagación de clones de células T humanas que responden específicamente a un aloantígeno definido. Este protocolo se puede adaptar para la clonación de células T humanas específicas para una variedad de ligandos péptidos-MHC.

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La síntesis de anticuerpos monoclonales humanos es el primer paso en estudios destinados a desentrañar los mecanismos fisiopatológicos de las respuestas inmunitarias mediadas por autoanticuerpos. Hemos desarrollado un protocolo para generar anticuerpos monoclonales de inmunoglobulina G (IgG) humana recombinante a partir de células B clasificadas por sangre, incluido el aislamiento de células B, la clonación de anticuerpos y la síntesis in vitro.

Generación de recombinante humano IgG anticuerpos monoclonales a partir de células inmortalizadas B Ordenada

La sangre periférica humana se utiliza habitualmente para la evaluación de la respuesta inmunitaria humoral. En este trabajo, se describen los métodos para aislar las células B humanas de la sangre periférica, diferenciar las células B humanas en células B secretoras de anticuerpos (Ab) en cultivo y enumerar el total de IgM- e IgG-ASC mediante un ensayo ELISpot.

El aislamiento, diferenciación y cuantificación de Human secretoras de anticuerpos células B de sangre: ELISpot como una lectura funcional de la inmunidad humoral

Se presenta un protocolo optimizado para la generación de anticuerpos monoclonales basado en la tecnología de hibridomas. Los ratones fueron inmunizados con un inmunoconjugado. Las células del bazo se fusionaron mediante PEG y un impulso eléctrico con células de mieloma inmortal. Las células de hibridoma productoras de anticuerpos se seleccionaron mediante HAT y ELISA específico de antígeno.

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Un método simple y efectivo que emplea nanopartículas magnéticas para detectar y enriquecer células B reactivas al antígeno para el análisis funcional y fenotípica se describe.

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Este artículo proporciona un protocolo detallado para la preparación y evaluación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales para su uso en inmunoensayos diferentes. Este procedimiento incluye vacunación, fusión celular, indirecta ELISA competitivo para clon positiva proyección y preparación de hibridomas monoclonal. También se proporcionan las especificaciones para la caracterización de anticuerpos mediante MALDI-TOF-MS y los análisis de ELISA.

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El método BSelex para identificar y recuperar anticuerpos específicos de antígenos individuales de células mononucleares de sangre periférica humana combina citometría de flujo con PCR de una sola célula y clonación.

Método de cribado de una sola célula para la selección y recuperación de anticuerpos con especificidades deseadas de poblaciones de células B de memoria humana enriquecidas

Describimos aquí un análisis simple de la heterogeneidad del compartimento de células B inmunes murinas en el peritoneo, el bazo y los tejidos de la médula ósea por citometría de flujo. El protocolo se puede adaptar y extender a otros tejidos de ratón.

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Aprende a generar anticuerpos monoclonales humanos desde linfocitos B circulantes en sangre. Este método permite discriminar antígenos estrechamente relacionados para aplicaciones en inmunoterapia.

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