El ensayo TUNEL

The TUNEL Assay

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Cell Biology

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JoVE Science Education Cell Biology

The TUNEL Assay

4.1: Detecting Reactive Oxygen Species

4.4: Cell-surface Biotinylation Assay

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08:12 min

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April 30, 2023

Overview

Una de las características de la apoptosis es la fragmentación del ADN nuclear por nucleasas. Estas enzimas son activadas por caspasas, la familia de proteínas que ejecutan el programa de muerte celular. Ensayo de túnel es un método que aprovecha esta característica para detectar células apoptóticas. En este ensayo, una enzima llamada terminal deoxynucleotidyl transferasa cataliza la adición de dUTP nucleótidos a los extremos 3′ libre de ADN fragmentado. Mediante el uso de dUTPs que están etiquetados con las etiquetas químicas que pueden producir color o fluorescencia, pueden identificarse específicamente células apoptóticas.

Video de Zeus en el ensayo TUNEL comienza discutiendo cómo puede utilizarse esta técnica para detectar células apoptóticas. Luego pasamos por un protocolo general para realizar ensayos TUNEL en secciones de tejidos y visualizar los resultados utilizando microscopía de fluorescencia. Por último, se tratarán varias aplicaciones del análisis a la investigación actual.

Procedure

El ensayo TUNEL se utiliza comúnmente para detectar las células que experimentan apoptosis, que es una forma de muerte celular programada. La apoptosis es un proceso biológico importante durante el desarrollo y para mantener la homeostasis del tejido. Tinción TUNEL permite visualización y cuantificación de células apoptóticas. Esto ayuda a los científicos probar la eficacia de nuevos tratamientos para trastornos en que apoptosis inhibida, como en el cáncer, o mejorado, como en la neurodegeneración.

Este video explica cómo el ensayo TUNEL se puede utilizar para identificar las células que experimentan apoptosis, un protocolo paso a paso para realizar este método en secciones del tejido, y cómo los investigadores están aplicando esta técnica para entender los mecanismos de muerte celular.

Antes de profundizar en el protocolo del ensayo TUNEL, vamos a discutir los principios detrás de esta técnica.

Una de las muchas características de la característica distintiva de la apoptosis es la fragmentación del ADN. ¿Cómo se produce la fragmentación del ADN? Apoptosis se lleva a cabo por enzimas llamadas caspasas presentes en el citosol. Su función principal es hienden las proteínas con el fin de desmantelar la célula. Además, caspasas activan una enzima llamada ADNasa activada por caspasa, o CAD, desprendiendo de su inhibidor, ICAD. Activado de la CAD es una endonucleasa que viaja al núcleo y separa el ADN cromosómico.

Clivaje de ADN en última instancia causa acumulación de fragmentos de ADN con extremos melladas, el ensayo TUNEL fluorescente etiquetas y estas Mellado extremos de ADN fragmentado, permitiendo a los científicos a detectar apoptosis. Pero ¿cómo sucede esto? Para eso tienes que entender la reacción de TUNEL. TUNEL es terminal deoxynucleotidyl transferasa-mediated dUTP nick-end etiquetado. Los dos reactivos TUNEL principal son transferasa terminal del deoxynucleotidyl, o TdT y desoxiuridina trifosfato o dUTP, que puede ser etiquetado fluorescente para facilitar su detección.

Para entender la reacción de TUNEL, volvamos a las células apoptóticas con fragmentos de ADN. Mellado fragmentos tienen grupos de hidroxilo 3 ‘ libre. Una vez agregar los reactivos TUNEL a una muestra que contenga células apoptóticas, las fluorescencia de etiquetado dUTPs colocar a estos grupos de hidroxilo 3 ‘ con la ayuda de la enzima catalizador TdT. Las células teñidas mediante este procedimiento se llaman las células positivas TUNEL, que luego pueden ser visualizadas mediante microscopía de fluorescencia.

Ahora que usted comprende los principios básicos y conceptos detrás del ensayo TUNEL, vamos a esbozar un protocolo general para la realización de esta técnica en las secciones de tejido. Los pasos principales del ensayo TUNEL incluyen fijación del tejido de interés, permeabilización del tejido, adición de reactivos TUNEL, parando la reacción del TUNEL y finalmente el análisis.

En primer lugar, el tejido de interés debe ser fijado con el fin de preservar las estructuras biológicas. Fijación trabaja por reticulación de proteínas dentro de células. Para el ensayo TUNEL, los tejidos se pueden fijar mediante la adición a una solución conteniendo paraformaldehído al 4% de 4 a 24 horas a 4° C. Después de la fijación, criosección el tejido en rodajas de 10 μm o menos.

El siguiente paso es la permeabilización, que permite para reactivos, tales como la enzima TdT para penetrar el núcleo celular. Permeabilización de las secciones de tejido se puede realizar añadiendo el tejido a la solución de proteinasa K durante 5-15 minutos a 37° C. Enjuague las secciones de tejido con tampón fosfato salino en un agitador orbital durante 15 – 30 minutos a temperatura ambiente.

Tras la permeabilización, la enzima TdT y fluorescencia etiquetada dUTPs se agregan a las secciones de tejido, junto con un tampón etiquetado que contiene cobalto que actúa como cofactor de la reacción de TUNEL. Juntos, la mezcla de reacción de TUNEL y la sección del tejido se incuban durante 1 – 3 horas a 37° C y protegidos de la luz para evitar la fluorescencia del descoloramiento.

Tras la incubación, tope se agrega a la sección del tejido a la reacción de TUNEL, y después de una corta incubación las secciones se lavaron con tampón fosfato Salinas. Finalmente, las secciones de tejido teñidas usando fluorescencia etiquetada dUTP se visualizan utilizando microscopía de fluorescencia y evaluado para la localización de las células positivas TUNEL dentro de un determinado tejido. Uno puede cuantificar muerte celular simplemente por contar el porcentaje de células positivas TUNEL en una sección de tejido dado.

Ahora que has visto cómo realizar el ensayo TUNEL para detectar las células apoptotic, vamos a discutir cómo se puede utilizar este ensayo abordar preguntas por biólogos de la célula.

Muerte celular se produce como una parte normal del desarrollo de la escultura de los tejidos y estructuras y la eliminación de células innecesarias. Por lo tanto, los científicos interesan en el estudio de este fenómeno el efecto de la exposición prenatal a sustancias diferentes en apoptosis durante el desarrollo. Aquí, los científicos estaban interesados en examinar el efecto de la exposición prenatal del alcohol sobre el desarrollo del cerebro. Los resultados de la tinción TUNEL realizan en cerebros fetales revelaron mayor apoptosis en los tejidos que fueron expuestos prenatalmente al alcohol, en comparación con los animales de control.

Los científicos también utilizan el ensayo TUNEL para investigar apoptosis en respuesta a una infección bacteriana. En este experimento, los científicos desarrollaron un modelo de neumonía inyectando ratones con Pseudomonas aeruginosa, que induce la inflamación del pulmón. Entonces, tejido pulmonar fue quitado y tinción TUNEL fue realizada para examinar la apoptosis en respuesta a la infección bacteriana. Los resultados muestran que la muerte celular apoptótica aumentó en ratones expuestos a las bacterias, en comparación con los animales de control.

Por último, tinción TUNEL puede utilizarse en muestras de tumores humanos, con el fin de determinar la capacidad de respuesta del tumor a las drogas. En este ejemplo, las muestras del tumor fueron extraídas de pacientes humanos y cultivadas ex vivo. A continuación, fueron tratados con los medicamentos y evaluar una respuesta usando el ensayo TUNEL. Datos obtenidos muestran que el tratamiento con un fármaco que inhibe la proteína de choque térmico 90 significativamente aumenta apoptosis en tejido tumoral.

Sólo has visto video de Zeus para detectar células que experimentan apoptosis, usando el ensayo TUNEL. Este vídeo repasa los principios detrás de tinción TUNEL y un protocolo paso a paso para realizar el ensayo TUNEL en secciones de tejidos. También repasamos cómo este método puede aplicarse para entender la muerte celular programada durante el desarrollo y la enfermedad. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

The TUNEL assay is most commonly used to detect cells undergoing apoptosis, which is a form of programmed cell death. Apoptosis is an important biological process during development, and for maintaining tissue homeostasis. TUNEL staining allows for visualization and quantification of apoptotic cells. This helps scientists test efficacy of new treatments for disorders in which apoptosis is either inhibited, like in cancer, or enhanced, as in neurodegeneration.

This video will explain how the TUNEL assay can be used to label cells undergoing apoptosis, a step-by-step protocol for performing this method in tissue sections, and how researchers are applying this technique to understand mechanisms of cell death.

Before delving into the protocol of the TUNEL assay, let’s discuss the principles behind this technique.

One of the many hallmark characteristics of apoptosis is DNA fragmentation. How does DNA fragmentation occur? Apoptosis is carried out by enzymes called caspases present in the cytosol. Their primary role is to cleave proteins in order to dismantle the cell. In addition, caspases activate an enzyme called caspase-activated DNase, or CAD, by detaching it from its inhibitor—ICAD. Activated CAD is an endonuclease that travels to the nucleus and cleaves chromosomal DNA.

Cleavage of DNA ultimately causes accumulation of DNA fragments with nicked ends, and the TUNEL assay fluorescently labels these nicked ends of fragmented DNA, allowing scientists to detect apoptosis. But how does this happen? For that you have to understand the TUNEL reaction. TUNEL stands for terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling. The two main TUNEL reagents are terminal deoxynucleotidyl transferase, or TdT, and deoxyuridine triphosphate, or dUTP, which may be fluorescently labeled for ease of detection.

In order to understand the TUNEL reaction, let’s go back to the apoptotic cells with DNA fragments. These nicked fragments have free 3′ hydroxyl groups. Once you add the TUNEL reagents to a sample containing apoptotic cells, the fluorescently labeled dUTPs attach to these 3′ hydroxyl groups with the help of the catalyst enzyme TdT. The cells stained using this procedure are called TUNEL positive cells, which can then be visualized using fluorescence microscopy.

Now that you understand the basic principles and concepts behind the TUNEL assay, let’s outline a general protocol for performing this technique in tissue sections. The major steps of the TUNEL assay include fixing the tissue of interest, permeabilization of the tissue, adding TUNEL reagents, stopping the TUNEL reaction, and finally the analysis.

First, the tissue of interest must be fixed in order to preserve biological structures. Fixation works by crosslinking proteins within cells. For the TUNEL assay, tissues can be fixed by adding them to a solution containing 4% paraformaldehyde for 4–24 hours at 4°C. After fixation, cryosection the tissue into thin slices of 10 µm or less.

The next step is permeabilization, which allows for reagents such as the TdT enzyme to penetrate the cell nucleus. Permeabilization of tissue sections can be performed by adding the tissue to proteinase K solution for 5–15 minutes at 37°C. Rinse tissue sections with phosphate buffered saline on an orbital shaker for 15–30 minutes at room temperature.

Following permeabilization, the TdT enzyme and fluorescently labeled dUTPs are added to the tissue sections, along with a labeling buffer containing cobalt that acts as a cofactor for the TUNEL reaction. Together, the TUNEL reaction mixture and the tissue section are incubated for 1–3 hours at 37°C, and protected from light to prevent the fluorescence from fading.

Following incubation, stop buffer is added to the tissue section to cease the TUNEL reaction, and after a short incubation the sections are washed with phosphate buffered saline. Finally, tissue sections stained using fluorescently tagged dUTP are visualized using fluorescence microscopy, and assessed for localization of TUNEL positive cells within a given tissue. One can quantify cell death simply by counting the percentage of TUNEL positive cells in a given tissue section.

Now that you’ve seen how to perform the TUNEL assay to detect apoptotic cells, let’s discuss how this assay can be used to address questions asked by cell biologists.

Cell death occurs as a normal part of development for the sculpting of tissues and structures, and for the elimination of unnecessary cells. Therefore, scientists interested in this phenomenon study the effect of prenatal exposure to different substances on apoptosis during development. Here, scientists were interested in examining the effect of prenatal alcohol exposure on brain development. The results of TUNEL staining performed on fetal brains revealed increased apoptosis in tissues that were prenatally exposed to alcohol, as compared to control animals.

Scientists also use the TUNEL assay to investigate apoptosis in response to bacterial infection. In this experiment, scientists developed a model of pneumonia by injecting mice with Pseudomonas aeruginosa, which induces lung inflammation. Then, lung tissue was removed and TUNEL staining was performed to examine apoptosis in response to the bacterial infection. Results show that apoptotic cell death increased in mice exposed to the bacteria, as compared to control animals.

Lastly, TUNEL staining can be used on human tumor samples, in order to determine tumor responsiveness to drugs. In this example, tumor samples were harvested from human patients and cultured ex vivo. Next, they were treated with pre-clinical drugs and assessed for a response using the TUNEL assay. Data obtained show that treatment with a drug that inhibits heat shock protein 90 significantly increases apoptosis in tumor tissue.

You’ve just watched JoVE’s video on using the TUNEL assay to detect cells undergoing apoptosis. This video reviewed the principles behind TUNEL staining, and a step-by-step protocol to perform the TUNEL assay on tissue sections. We also reviewed how this method could be applied to understand programmed cell death during development and disease. As always, thanks for watching!

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