Name: Aislamiento de las glándulas mamarias del ratón intacto, todo para el análisis de expresión de la matriz extracelular y la morfología de la glándula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Aprenda a aislar glándulas mamarias intactas de ratón para analizar la expresión de proteínas de matriz extracelular y la arquitectura ductal mediante histología e inmunohistoquímica. Este método facilita estudios de biología del desarrollo y cáncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean reconocer engaños abril y Dr. Roger Broderson de asistencia con animal necropsia y aislamiento de la glándula, respectivamente. Fondos para este trabajo fue apoyado por los centros de la Philadelphia College of Osteopathic Medicine para trastornos crónicos del envejecimiento.

con sujetos animales en este protocolo los procedimientos fueron revisados y aprobados por la institucional Animal cuidado y uso de la Facultad de medicina osteopática de Filadelfia y todas las técnicas se llevaron a cabo bajo estrictas directrices éticas.
 1. obtención de muestra y procesamiento <ol><li>seleccionar tema animal apropiado y el lugar en una cámara de CO 2. Para este experimento, usar 8-10 semanas viejo mujer B6 nulíparas. CG-Cav1tmMIs J y C57BI/6J.</li>
	<li>Vuelta en el flujo de gas a 30-40%. Una vez que el animal está visiblemente inconsciente después de unos 2 minutos, abra la válvula de gas a la presión total para un adicional 5 min 
	Nota: Confirman muerte de animales mediante la observación de signos visibles de la respiración (e.g. movimiento del pecho) por un período de 10 minutos después de la cesación de la entrega de CO 2. Si el animal todavía está vivo, se puede colocar en la cámara de CO 2. Dislocación cervical también puede utilizarse aunque no se recomienda como la sangre se puede acumular alrededor de las glándulas mamarias, interfiriendo con la disección y los resultados.</li>
	<li>Después de sacrificio, perno canal en una posición supina y sature con etanol al 70%.</li>
	<li>Pellizcar la piel justo sobre el pubis con pinzas y nick con pequeñas tijeras quirúrgicas. Girando las tijeras, cortar la piel a lo largo de la línea media ventral en movimiento caudal a craneal.</li>
	<li>Con tijeras grandes o una pinza hemostática, sin rodeos disecar la fascia subcutánea bilateral, con precaución de no para perforar el peritoneo. Corte a lo largo de los márgenes horizontales en ambos extremos distales de la incisión.</li>
	Las aletas <li>pin la piel abrir y rociar nuevamente con etanol al 70%. 
	Nota: Aunque mejor distinción visual entre la glándula y el tejido subcutáneo circundante permite el uso de etanol al 70%, tenga cuidado para evitar la sequedad de los tejidos como resultado de uso de esta solución. Para evitar que se sequen, extirpar la glándula en un marco de tiempo no debe exceder los 4 minutos. Como alternativa a etanol al 70%, el investigador también puede sustituir un búfer de aislamiento general, tales como PBS 1 x, para evitar la desecación del tejido.</li>
	<li>Localización de las glándulas mamarias de interés, deslice una hoja de bisturí #4 a lo largo de la parte interior de las aletas de la piel, cortar la glándula mamaria y asociado adiposo cutáneo de la dermis. 
	Nota: 3.5 x lupas quirúrgicas micro puede ayudar en la mejor visualización de las glándulas.</li>
	<li>Inmediatamente sumerja la glándula recientemente aislada en tubo cónico que contiene el volumen de la solución del 10:1-tejido de formalina tamponada neutra 10% por 24-48 h. 
	Nota: Dependiendo de la intención del estudio, muchos fijadores alternativos pueden utilizarse como paraformaldehido, etanol para estudios de genómica y ARN comercialmente disponible preservar reservas.</li>
	<li>Seguir protocolos institucionales para la inclusión en parafina, enviar muestras a un proveedor para el procesamiento, inclusión y rebanar/montaje de la diapositiva. Sección de los tejidos de 5 μm. 
	Nota: Debido al exceso de la glándula circundante adiposa, considerar retirar 100-200 μm del tejido antes de corte y coloración.</li>
</ol> 2. Tinción de tejidos <ol><li>inmunohistoquímica <ol><li>Coloque los portaobjetos teñido en el bloque de calor situado a 58 ° c por 1 h derretir parafina. 
		PRECAUCIÓN: Derretir la cera de parafina puede funcionar apagado. Vigilar de cerca o lugar para limpiar bajo diapositiva capturar cera escurrimiento. 
		Nota: Este paso no es esencial y puede omitirse. Si los resultados no son como esperaba, añadiendo este paso atrás puede mejorar los resultados.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos en una diapositiva de la jarra que contiene xileno 100% durante 30 minutos asegura la inmersión completa. Repetir una vez. 
		Nota: en este punto, la inspección visual debe realizarse para asegurar que las secciones de tejido libres de tejido adiposo y parafina. Si el tejido adiposo adicional o cera es evidente, la diapositiva debe volver a sumergir en xileno. Tenga cuidado para minimizar la exposición agregada a xileno como esto puede causar la contracción del tejido.</li>
		<li>Rehidratar los tejidos en un tarro de la diapositiva que contiene etanol al 100% durante 10 minutos repetición una vez.</li>
		<li>Mover diapositivas a un frasco de la diapositiva que contiene etanol al 95% durante 10 minutos repetición una vez.</li>
		<li>Mover diapositivas una diapositiva tarro que contiene 75% de etanol por 5 min</li>
		<li>Mover diapositivas una diapositiva tarro contiene 50% de etanol por 5 min</li>
		<li>Solución de citrato de sodio 10 mM (pH 6.0) en una placa caliente o un microondas y verter en la jarra de Coplin. 
		PRECAUCIÓN: Cuidadosamente monitorear la solución mientras que calefacción y evite hervir sobre. Recipiente estará muy caliente. Use protección para evitar quemaduras.</li>
		<li>Lentamente Coloque las muestras en recipiente jar, asegurar la inmersión completa e incuban a 100 ° C durante 10 minutos recuperar epitopos. Retire y seque cuidadosamente diapositivas.</li>
		<li>Dibujar una barrera alrededor de tejido con un marcador hidrofóbico. Añadir suficiente bloqueador de la enzima endógena (peróxido de hidrógeno y de azida de sodio, disponible comercialmente) para cubrir el tejido e incubar durante 10 minutos</li>
		<li>Sumerja los portaobjetos en fosfato x 1 tampón salino (PBS) durante 10 minutos</li>
		<li>Añadir suficiente suero de burro de 10% en PBS 1 x para cubrir el tejido e incubar 1 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada. 
		Nota: El experimento puede hacer una pausa aquí por guardar las diapositivas en la cámara humidificada a 4 ° C durante la noche. Mientras que burro suero fue encontrado para obtener óptimos resultados de tinción, el investigador puede desear probar diferentes sueros como albúmina de suero bovino (BSA), suero de cabra o caballo suero para determinar resultados óptimos. Si utiliza BSA, el investigador debe preparar esta fresca antes del uso.</li>
		<li>Decantar el exceso bloqueador de diapositivas y añadir anticuerpo primario correctamente diluido en 1% de suero directamente a asegurar que el tejido está cubierto uniformemente en la solución de las diapositivas. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara humidificada. 
		Nota: Este paso puede continuarse durante períodos de tiempo más largo con cámara húmeda almacenada a 4 ° C. Asegúrese de incluir diapositivas de adecuado control negativo (p. ej. una diapositiva con ningún anticuerpo primario conocido tejido antígeno negativo, etc.) en este paso.</li>
		<li>Cuidadosamente lavar portaobjetos por fluir aproximadamente 1 mL de diH 2 O sobre tejido e incubar en 1 cambio de 1 x PBS por 5 min</li>
		<li>PBS exceso de decantar y añadir suficiente etiqueta de peroxidasa de rábano picante para cubrir el tejido e incubar por 30 min en una cámara humidificada. 
		Nota: En este paso, el investigador puede proceder a la tinción utilizando anticuerpos secundarios conjugados fluorescencia fluorescente. Si esto se desea, los siguientes pasos se describe deben modificarse en consecuencia.</li>
		<li>Cuidadosamente lavar portaobjetos por fluir aproximadamente 1 mL de diH 2 O sobre tejido e incubar en 1 cambio de 1 x PBS por 5 min</li>
		<li>Diaminobenzidina (DAB) más solución de cromógeno según la proporción sugerida del fabricante y mezclar por vortex. 
		Nota: Muchos kits preparados están comercialmente disponibles aparte de la que se utiliza en el presente Protocolo.</li>
		<li>Decantar exceso de búfer de diapositivas y añadir 2-3 gotas (10-50 μL) de cromógeno mancha directamente a los tejidos y Incubar por 5 min en cámara húmeda. Lavar cuidadosamente las diapositivas por que fluye alrededor de 1 mL diH 2 O sobre tejido. 
		PRECAUCIÓN: Cromógeno DAB es altamente tóxico. Evitar el contacto directo de mancha con piel y recoge el flujo apagado en residuos peligrosos.</li>
	</ol></li> <li>Hematoxilina y eosina (H &#38; E) <ol><li>después de enjuague final después de la incubación del cromógeno, sumerja los portaobjetos en hematoxilina de Harris para diapositivas de 2-2.5 minutos enjuague suavemente con agua del grifo durante 1-2 minutos 
		Nota: tenga cuidado para evitar el chorro directo de agua en los tejidos.</li>
		<li>Sumerja las diapositivas para 2-3 s en diferenciación solución 0,25 mL de ácido clorhídrico en 100 mL de etanol al 70%. Enjuague los portaobjetos suavemente con agua del grifo durante unos 1-2 minutos</li>
		<li>Sumergir diapositivas en agente azul (4.5 mg carbonato de calcio en 100 mL de agua, pH ajustado a 9.4) para 60 portaobjetos enjuague s. en etanol al 95% para 30 s.</li>
		<li>Sumerja los portaobjetos en eosina alcohólica Y para 2-3 min.</li>
		<li>Deshidratar el tejido en 2 cambios de etanol al 95% durante 1 minuto.</li>
		<li>Tejido de deshidratar en 1 cambio de etanol al 100% durante 1 minuto</li>
		<li>Diapositivas secas cuidadosamente con una toallita libre de pelusas. Aplicar 1 gota (aproximadamente 100-200 μL) sintéticas, no-acuosas, medios y aplicar cubreobjetos de montaje a base de resina. 
		Nota: Si se eligió un método de tinción diferente, un medio de montaje diferentes puede ser necesario. Por ejemplo, si el investigador eligió un anticuerpo secundario conjugado fluorescente, un montaje acuoso sería lo más ideal.</li>
		<li>Permite diapositivas fijar un día para otro a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Rojo Picrosirio (PSR) tinción <ol><li>seleccionar las diapositivas a mancharse y seguir protocolo de inmunohistoquímica hasta el paso 6 (baño de etanol al 50%).</li>
		<li>Sumerja los portaobjetos en PSR manchan por 1 h.</li>
		<li>Sumergir las muestras en ácido acético al 0.5% para 1-2 s, dos veces para diferenciar mancha.</li>
		<li>Deshidratar los tejidos en 2 cambios de etanol al 95% durante 1 minuto.</li>
		<li>Deshidratar los tejidos en 1 cambio de etanol al 100% durante 1 minuto</li>
		<li>Claro diapositivas sumergiendo brevemente en xileno 100% de sobre 3-4 s.</li>
		<li>Diapositivas secas cuidadosamente con una toallita libre de pelusas. Aplicar 1 gota (aproximadamente 100-200 μL) sintéticas, no-acuosas, medios y aplicar cubreobjetos de montaje a base de resina.</li>
	</ol></li></ol> 3. Análisis de la muestra <ol><li>Análisis Ductal <ol><li>seleccionar diapositivas mancharon para α-SMA. Utilizando un microscopio de luz con un objetivo montado en cámara, recoger imágenes representativas con 20 aumentos.</li>
		<li>Utilizar ImageJ (NIH), distinguir y contar los conductos en cada imagen. Estos se pueden enumerar manualmente o se puede asignar una puntuación numérica a conductos individuales. Para asignar una calificación numérica, abra ImageJ y seleccione Plugins. A continuación seleccione Analyze y elija celda contador en el menú desplegable. Haga clic en inicializar luego resalte tipo 1 para conductos de etiquetado. Cuando haya terminado, seleccione resultados para ver la cuenta ductal. 
		Nota: tenga cuidado para verificar las estructuras ductales y vascular no.</li>
		<li>En &#39; medida establecer &#39; opciones, compruebe &#39; perímetro &#39; y &#39; área de &#34;.</li>
		<li>Usando la herramienta de polígono a mano alzada, dibujar una línea alrededor de cada tubo en el compartimento mioepiteliales (visibilidad ayudado por la mancha de α-SMA). Seleccione &#39; medida &#39; y registrar el perímetro y área.</li>
		<li>Otra vez con la herramienta de polígono a mano alzada, dibujar una línea a lo largo de la parte apical del epitelio ductal en el interior del lumen. Seleccione &#39; medida &#39; y registrar el perímetro y área.</li>
		<li>Restar del perímetro del compartimiento luminal del perímetro del compartimiento mioepiteliales para obtener la circunferencia del epitelio ductal. Restar el área del compartimiento luminal de la zona del compartimiento del mioepiteliales para obtener el área del epitelio ductal de.</li>
	</ol></li> <li>Análisis de inmunohistoquímica <ol><li>subir imágenes trasmitida a un software de análisis, como el ImageJ o FIJI Suite. 
		Nota: Este protocolo describe los pasos para la tinción de análisis con ImageJ y el plugin de herramientas de IHC.</li>
		<li>Abrir la caja de herramientas de la IHC en el menú del Plugin. En el &#34; seleccionar modelo &#34; desplegable que se abre, seleccione mancha apropiada (es decir, H-DAB, PSR, etc.). Seleccione la &#34; Color &#34; opción para aislar la mancha. Se abrirá una ventana de resultados. 
		Nota: Este método es apropiado si una proteína de interés se encuentra en los espacios extracelulares o citosólicas, o está ligada a la membrana plasmática. Si la proteína de interés es nuclear, seleccionar &#34; núcleos &#34; pedirá el plugin para analizar la imagen de núcleos teñidos positivamente.</li>
		<li>Utilizar el deslice el selector de Color para asegurar el aislamiento adecuado de la mancha sin fondo inclusión o exclusión de tinción excesiva. 
		Nota: Si el modo automático es incapaz de detectar el tinte o no produce imágenes aceptables, dibujar un cuadrado de región de interés (ROI) más identificada manchado región. En la ventana Toolbox de IHC, seleccione &#34; tren &#34; para dirigir el plugin en el destino correspondiente.</li>
		<li>Convertir la imagen a 16 bits. Ir a imagen &#8594; tipo &#8594; 16 bit.</li>
		<li>Umbral de la imagen. Ir a imagen &#8594; ajuste &#8594; Auto umbral.</li>
		<li>Establecer la escala de medición de la imagen dibujando una línea de retorno de la inversión directamente sobre la barra de escala en la imagen entonces asignar la longitud. Para establecer la barra de escala, vaya a análisis &#8594; escala conjunto. El número de píxeles por la unidad de longitud (por ejemplo 120 píxeles por 50 μm) deseada de entrada.</li>
		<li>Medir el área resultante y valor de gris medio. Ir a la analizar &#8594; establecer medidas y recoger la medición haciendo clic en analizar &#8594; medida.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gao-Feng Xiong, R. X. <a target="_blank" href="http://jcmtjournal.com/article/view/1713">Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression.</a> J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).</li>
<li>Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironment+in+breast+cancer+progression%3A+biology+and+implications+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 227(2011).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4 (1), 38(2006).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11(2008).</li>
<li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix%3A+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).</li>
<li>Ioachim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+expression+of+extracellular+matrix+components+tenascin%2C+fibronectin%2C+collagen+type+IV+and+laminin+in+breast+cancer%3A+their+prognostic+value+and+role+in+tumour+invasion+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression.</a> Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).</li>
<li>Barkan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Wang, J. P., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin%3A+How+Its+Aberrant+Expression+in+Tumors+May+Improve+Therapeutic+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting.</a> J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).</li>
<li>Qian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+tumor%2Fstromal+caveolin-1+expression+in+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients.</a> Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).</li>
<li>Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+functional+significance+of+loss+of+caveolin-1+expression+in+breast+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts.</a> J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).</li>
<li>Witkiewicz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absence+of+stromal+caveolin-1+expression+predicts+early+tumor+recurrence+and+poor+clinical+outcome+in+human+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers.</a> Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).</li>
<li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammary gland development.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).</li>
<li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+reproductive+status%2Fstages+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Curr Protoc Neurosci. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).</li>
<li>Cannata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+circulating+IGF-I+promotes+mammary+gland+development+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation.</a> Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).</li>
<li>Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+caveolin-1+alters+extracellular+matrix+protein+expression+and+ductal+architecture+in+murine+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands.</a> PLoS One. 12 (2), 0172067(2017).</li>
<li>Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+expression+modulates+mammary+epithelial+cell+proliferation+during+acinar+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation.</a> Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).</li>
<li>Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraductal+injection+for+localized+drug+delivery+to+the+mouse+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En el papel, hemos descrito una técnica para aislar las glándulas mamarias de ratón intacto para análisis histológicos aguas abajo de ECM expresión y morfología ductal. Con respecto al análisis de la morfología ductal, esta metodología permite la rápida investigación de arquitectura ductal con sede fuera de las secciones histológicas teñidas. Otros métodos de análisis ductales dependen de inyecciones de colorantes para permitir la visualización del árbol ductal, métodos que pueden ser técnicamente difícil y desperdiciado...

El cáncer de mama se caracteriza por un grado considerable de tejido fibrosis1,2,3,4. Conocido como ECM, esta entidad no celular se encuentra en diferentes grados en todos los tejidos y se compone principalmente de una compleja red de colágenos fibrilares y no fibrilares, elastina y glicoproteínas además varias moléculas de señalización que son secuestrado en esta matriz. En condiciones homeostáticas, la deposición y la degradación de la ECM se controla bien. 5 durante la tumorogénesis de mama, se perturba el equilibrio de la deposición del ECM y la degradación. Así, tumores de mama se han divulgado para expresar proteínas ECM abundantes tales como colágenos, fibronectina y Tenascina-C entre otros. 6 la expresión anormal de estas proteínas además de más patrones de entrecruzamiento de la matriz se ha documentado para promover mama tumor metástasis, terapia y evolución resistencia1,3, 4,7,8,9.
Evaluar la composición del ECM y la morfología ductal, se realizó aislamiento de glándulas mamarias intactas. Aquí hemos utilizado mujeres nulíparas ratones deficientes de caveolina-1, una proteína integral de membrana que se ha ligado a una agresiva mama tumor firma10,11,12, controlar mujeres nulíparas B6 ratones. Procesamiento histológico y la coloración de estos tejidos permiten la identificación de varias proteínas de la ECM junto con la caracterización de la morfología ductal.
En general, el aislamiento de las glándulas mamarias enteros, intactos da a investigadores la oportunidad de investigar todo el tejido celulares o morfológicos cambios que ocurren en respuesta a factores exógenos o endógenos. Inconvenientes de la técnica están relacionadas con el análisis de secciones de tejido de 2 dimensiones (2D) en contraposición a una perspectiva 3D, que daría una imagen más completa de la morfología compleja del árbol ductal. Dada la complejidad de las interacciones célula-célula y célula-ECM que se producen en la glándula mamaria, el aislamiento de glándulas enteras, intactas es ventajoso para analizar eficientemente ductal expresión morfología y de la proteína en varias regiones de la mamario murino glándula.

<table><tbody><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>Cámara microscópica</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes</td><td>Olympus</td><td>cellSens Software</td><td></td></tr><tr><td></td> de entrada <td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>3.5x-R Micro lupas quirúrgicas</td><td>Rose Micro Solutions</td><td></td><td>Aumento a elección del investigador</td></tr><tr><td>Mayo Tijeras</td><td>Medline</td><td>DYND04035</td><td></td></tr><tr><td>Estante de tinción</td><td>Fisher Scientific</td><td>121</td><td></td></tr><tr><td>Plato de tinción</td><td>Fisher Scientific</td><td>112</td><td></td></tr><tr><td>Frascos Coplin</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Tamaño apropiado para el tejido</td></tr><tr><td>IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+)</td><td>Dako</td><td>K400611-2</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red Kit</td><td>Abcam</td><td>AB150681</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y, alcohólico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro</td><td>EMD Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina tamponada neutra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Xilenos, grado reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>etanol, 200 grados</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td>adecuado para biología molecular</td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato, 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202932</td><td></td></tr><tr><td>permanente Medio de montaje</td><td>Dako</td><td>S1964</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt Medio de montaje</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de fibronectina</td><td>Abcam</td><td>AB23750</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de tenascina-C</td><td>Abcam AB108930</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Músculo liso Anticuerpo de actina</td><td>Abcam AB124964</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dako Envision Sistema de doble enlace HRP</td><td>Dako</td><td>K4065</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de las glándulas mamarias del ratón intacto, todo para el análisis de expresión de la matriz extracelular y la morfología de la glándula

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

El objetivo de este procedimiento era el #4 abdominal las glándulas mamarias de ratones femeninos nulíparas la cosecha con el fin de evaluar la expresión de ECM y arquitectura ductal. Aquí, un pequeño bolsillo debajo de la piel fue creado usando las tijeras de Mayo, permitiendo la separación de las glándulas en el tejido subcutáneo desde el peritoneo subyacente. Visualización de las glándulas fue ayudado por el uso de 3.5 lupas micro quirúrgicas x-R. La piel fue invertida y cubrió atrás que permite identificación de las almohadillas de grasa mamarias intactas. Cada una de las glándulas abdominales #4 fue disecada sin rodeos deslizando lateralmente la hoja de bisturí entre las glándulas y la capa subcutánea. Inmediatamente después de la cosecha, las glándulas se colocaron en 10% formalina tamponada neutra para el procesamiento posterior del tejido. Supresión de la glándula entera es ventajosa ya que sobre todo elimina el riesgo de excluir interacciones importantes de todo el tejido entre las células epiteliales ductales y otras poblaciones celulares microambiental que podrían perderse en una biopsia parcial. Uno de los inconvenientes de la metodología es el uso de secciones seriadas de tejidos fijadas que limita el análisis de expresión proteína y morfogénesis ductal a lugares discretos dentro de la glándula. Como tal, cambios en la expresión de proteína y arquitectura ductal en 3 dimensiones (3D) no es fácilmente obtenible. En general, la técnica es aplicable a los estudios que requiere todo intactas glándulas mamarias murinas para investigaciones posteriores tales como desarrollo cáncer ductal de morfogénesis o mama.

Ratones hembras tienen 5 pares de glándulas mamarias. En concreto, hay un par de glándulas cervicales (#1), dos pares de glándulas torácicas (#2 y #3), un par de glándulas abdominales (#4) y 1 par de glándulas inguinales (#5) (figura 1A). Aquí, se aislaron las glándulas #4 ya que son fácilmente identificables. En algunas circunstancias, las glándulas #4 y #5 se aislaron juntos como distinción entre los dos fue difícil. Para aislar intacto #4 ...

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de entero, intacto el ratón glándulas mamarias para investigar la expresión de matriz extracelular (ECM) y morfología ductal. Las glándulas abdominales de ratón #4 se extrajeron de ratones femeninos nulíparas del 8-10 semanas de edad fijado en formalina tamponada neutra, seccionadas y teñido mediante inmunohistoquímica para las proteínas de la ECM.

Aislamiento de las glándulas mamarias del ratón intacto, todo para el análisis de expresión de la matriz extracelular y la morfología de la glándula

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

El objetivo general de esta técnica de recolección de glándula mamaria completa es facilitar el análisis de la presentación histológica del tejido mamario a partir de una glándula intacta ex vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología tumoral, como cómo se remodela el tejido estromal en los tumores o cómo la expresión aberrante de genes o proteínas altera la arquitectura ductal mamaria. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores la capacidad de caracterizar y cuantificar la expresión de proteínas y la arquitectura ductal en glándulas mamarias completas de ratones sanos y enfermos.La demostración de esta técnica estará a cargo de Chris Thompson, un estudiante graduado en mi laboratorio. Después de sacrificar ratones nulíparos hembra de ocho a 10 semanas de edad de acuerdo con el protocolo de texto, fije el cadáver en posición supina y use etanol al 70% para saturarlo. Usa fórceps para pellizcar la piel justo por encima del pubis y córtala con unas tijeras quirúrgicas pequeñas.Luego, girando las tijeras, corte la piel a lo largo de la línea media ventral, moviéndola de caudal a craneal. Con unas tijeras más grandes o un hemostático, diseccione sin rodeos la fascia subcutánea bilateralmente, teniendo cuidado de no perforar el peritoneo. Corte a lo largo de los márgenes horizontales en ambos extremos distales de la incisión.A continuación, abra las solapas de piel con alfileres y rocíe el pañuelo con PBS para mantenerlo húmedo. Luego, localizando las glándulas mamarias de interés, deslice una hoja de bisturí a lo largo del interior de los colgajos de piel, cortando la glándula mamaria y el tejido adiposo subcutáneo asociado libre de la dermis. Antes de separar la glándula abdominal de la inguinal, tenga cuidado de identificar las glándulas lo más claramente posible.Sumerja inmediatamente la glándula recién aislada en un tubo cónico que contenga aproximadamente seis mililitros de una solución de 10 a uno con un volumen de tejido de 10% de formalina tamponada neutra y coléguela durante 24 a 48 horas. Después de derretir la parafina de los portaobjetos y rehidratar las rodajas de acuerdo con el protocolo de texto, hierva la solución de citrato de sodio de 10 milimolares en un plato caliente o en un microondas y vierta la solución en un frasco Coplin. Coloque lentamente los portaobjetos en el frasco de Coplin, asegurando una inmersión completa, e incube los portaobjetos a 100 grados centígrados durante 10 minutos para recuperar los epítopos.Luego, retire y seque cuidadosamente los portaobjetos. A continuación, dibuja una barrera alrededor del tejido con un marcador hidrofóbico. Una vez que se haya secado, enjuague los portaobjetos con PBS durante uno o dos segundos.Luego, agregue suficiente bloqueador de enzimas endógenas para cubrir el tejido e incube los portaobjetos durante 10 minutos. Sumerja los portaobjetos en 1X PBS durante 10 minutos. A continuación, añada suficiente suero de burro al 10% y PBS para cubrir el tejido, e incube las muestras a temperatura ambiente en una cámara humidificada durante una hora.Decantar el exceso de bloqueador de los portaobjetos y añadir el anticuerpo primario debidamente diluido en suero al 1% directamente a los portaobjetos, asegurándose de que el tejido esté uniformemente cubierto de solución. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente en una cámara humidificada durante 30 minutos. Lave cuidadosamente los portaobjetos haciendo fluir aproximadamente un mililitro de agua desionizada sobre el tejido, y luego incube los portaobjetos en un cambio de 1X PBS durante cinco minutos.Decantar el exceso de PBS y añadir suficiente anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante, e incubar las muestras en una cámara humidificada durante 30 minutos. Lave cuidadosamente los portaobjetos haciendo fluir aproximadamente un mililitro de agua desionizada sobre el tejido e incube el tejido en un cambio de 1X PBS durante cinco minutos como antes. Después de preparar la solución de DAB más cromógeno, decantar el exceso de tampón de los portaobjetos y añadir dos o tres gotas de tinte de cromógeno directamente sobre el tejido.Incubar las muestras en una cámara humidificada durante cinco minutos. Luego, lave cuidadosamente los portaobjetos haciendo fluir aproximadamente un mililitro de agua desionizada sobre el pañuelo. Después de un enjuague final después de la incubación del cromógeno, sumerja los portaobjetos en hematoxilina Harris durante dos a dos minutos y medio.Luego, enjuague suavemente los portaobjetos con agua del grifo durante uno o dos minutos. Sumerja los portaobjetos en una solución de diferenciación durante dos o tres segundos. Luego, enjuague suavemente los portaobjetos con agua del grifo durante aproximadamente uno o dos minutos.Sumerge las diapositivas en el agente azul durante 60 segundos. Luego, enjuague los portaobjetos con etanol al 95% durante 30 segundos. Transfiera los portaobjetos a eosina Y alcohólica durante dos o tres minutos antes de deshidratar el tejido en dos cambios de etanol al 95% durante un minuto cada uno.Luego, finalmente, deshidrate el tejido una vez en etanol al 100% durante un minuto. Seque cuidadosamente los portaobjetos con una toallita sin pelusa. A continuación, aplique una gota de medio de montaje sintético no acuoso a base de resina a la guía y aplique un cubreobjetos.Para llevar a cabo el análisis ductal, seleccione portaobjetos teñidos para alfa SMA. A continuación, utilizando un microscopio óptico equipado con un objetivo montado en la cámara, recoja imágenes representativas con un aumento de 20X. Para contar los conductos de cada imagen, cuéntelos manualmente o abra ImageJ y seleccione los complementos.A continuación, seleccione analizar y, en el menú desplegable, elija el contador de celdas. Haga clic en inicializar y, a continuación, resalte el tipo uno para comenzar a etiquetar los conductos. Cuando termine, seleccione los resultados para ver el recuento ductal.Comienza dibujando una línea sobre la barra de escala de la imagen con la herramienta de línea. A continuación, haga clic en analizar y establecer la escala. En la siguiente ventana, escriba la distancia en distancia conocida y las unidades en unidad de longitud.A continuación, haga clic en Aceptar. A continuación, en las opciones de medición establecidas, verifique el área y el perímetro. A continuación, con la herramienta de polígono a mano alzada, dibuje una línea alrededor de cada conducto en el compartimento mioepitelial.Seleccione medir y registre el perímetro y el área. Usando la herramienta de polígono a mano alzada nuevamente, dibuje una línea a lo largo del lado apical del epitelio ductal dentro del interior del lumen. A continuación, seleccione medir y registre el perímetro y el área.Resta el área del compartimento lumenal del área del compartimento mioepitelial para obtener el área del epitelio ductal. Reste el perímetro del compartimento lumenal del perímetro del compartimento mioepitelial para obtener la circunferencia del epitelio ductal. Para llevar a cabo el análisis inmunohistoquímico, cargue imágenes de campo claro en un software analítico, como ImageJ o Fiji Suite.Usando el menú del plugin en ImageJ, abra la caja de herramientas IHC. En el cuadro combinado Seleccionar modelo que se abre, seleccione el tinte adecuado. Seleccione la opción de color para aislar la mancha.Esto abrirá una ventana de resultados. Utilice el deslizador selector de color para garantizar un aislamiento adecuado de la mancha, sin inclusión de fondo ni exclusión excesiva de manchas. Vaya a tipo de imagen, 16 bits, para convertir la imagen a 16 bits.Luego, umbral de la imagen yendo a imagen, ajuste el umbral. Finalmente, vaya a analizar, configure la medición para medir el área resultante y el valor de gris medio, y elija analizar, medir, para recopilar la medición. En estas secciones fijas de la glándula mamaria número cuatro se analizó la expresión de colágeno, fibronectina y tenascina-C.Las flechas indican la presencia de conductos en estos tejidos. Para cuantificar las características morfológicas de los conductos, es importante tratar las secciones histológicas con cuidado, ya que una manipulación inadecuada puede dar lugar a tejidos dañados y conductos que no son medibles. Aquí se muestra un ejemplo de tejido dañado que no se puede utilizar para el análisis.En este panel se muestra una muestra de tejido intacto donde los conductos son medibles y cuantificables. Los conductos no solo se caracterizan por el estroma circundante teñido de fibronectina, sino también por la densa población de células epiteliales que recubren la luz de los conductos. En esta sección teñida con fibronectina, varios conductos intactos contienen ramas indicadas por flechas.A los efectos de este análisis, estas ramas ductales no deben considerarse como estructuras ductales separadas. Al evaluar y medir los conductos, es importante distinguir los conductos de las estructuras vasculares. Las estructuras vasculares se indican con flechas rojas y las estructuras ductales se indican con flechas negras.Las estructuras vasculares no solo se pueden identificar por la presencia de una monocapa endotelial que recubre el lumen, sino también por la presencia de estructuras eosinófilas anucleares indicativas de glóbulos rojos dentro del lumen. Una vez dominado, la recolección de tejidos se puede realizar en aproximadamente 15 minutos por animal, y las tinciones de sección se pueden completar en aproximadamente siete a ocho horas, con imágenes de portaobjetos tomadas al día siguiente si todo se realiza correctamente. Al intentar estos procedimientos, es importante recordar que los objetivos individuales del experimento pueden requerir optimizaciones en pasos específicos.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la generación de segundos armónicos o la dispersión Raman anti-Stokes coherente para responder preguntas adicionales sobre la composición o arquitectura del estroma tisular. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores de muchos campos, como la biología tumoral, exploraran la organización de los tejidos y los patrones de expresión de proteínas en numerosos modelos animales de enfermedades y patologías humanas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar y aislar las glándulas mamarias de ratón.También debe comprender los procedimientos de tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido, incluido el uso de contratinciones. No olvide que trabajar con animales y sus tejidos y productos químicos como los xilenos y el cromógeno DAB puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como la capacitación adecuada en la cría y el uso de equipo de protección personal al realizar estos procedimientos.

isolation-intact-whole-mouse-mammary-glands-for-analysis

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este método describe la forma de analizar y evaluar el desarrollo de la glándula mamaria y la función de los ratones. Extirpado las glándulas mamarias son evaluados por el grado de desarrollo con montaje completo, mientras que la eyección de leche se evaluó mediante un ensayo basado en la oxitocina contracción de las células mioepiteliales.

Evaluación de la glándula mamaria de desarrollo y función en modelos de ratón

Imagen de lapso de tiempo se utiliza para evaluar el comportamiento de las células mamarias preneoplásicas primarias epiteliales derivadas de los modelos de ratón genéticamente modificadas de riesgo de cáncer de mama para determinar si existen correlaciones entre los parámetros de comportamiento específicas y distintas lesiones genéticas.

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

El protocolo de inmunofluorescencia indirecta descrito en este artículo permite la detección y la localización de las proteínas en la glándula mamaria del ratón. Un método completo se da para preparar muestras de glándula mamaria, para llevar a cabo la inmunohistoquímica, a la imagen las secciones de tejido mediante microscopía de fluorescencia, y para reconstruir imágenes.

Inmunofluorescencia indirecta en secciones congeladas de ratón Glándula Mamaria

Este protocolo describe métodos para purificar, cuantificar y caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exosomas de células epiteliales mamarias no adherentes / mesenquimales y para usarlas para transferir la capacidad de formación de glándulas mamarias a células epiteliales mamarias luminales. Los EVs / exosomas derivados de células epiteliales mamarias de tipo tallo pueden transferir esta propiedad celular a células que ingieren los EVs / exosomas.

Transferencia de la capacidad de formación de glándulas mamarias entre las células epiteliales basales mamarias y las células lumminales mamarias mediante vesículas extracelulares / exosomas

El desarrollo de la glándula mamaria en el roedor se ha evaluado típicamente mediante evaluaciones descriptivas o mediante la medición de atributos físicos básicos. La densidad de ramificación es un indicador del desarrollo mamario que es difícil de cuantificar objetivamente. Este protocolo describe un método fiable para la evaluación cuantitativa de las características de ramificación de las glándulas mamarias.

Cuantificación de la densidad de ramificación en las monturas enteras de la glándula mamaria de rata usando el método de análisis Sholl

Desarrollamos un método para eliminar, procesar, seccionar y teñir exitosamente, para la evaluación histopatológica, el tejido mamario que originalmente había sido fijado en diapositivas como monturas enteras. Este método puede promover la recolección y evaluación de monturas enteras de glándulas mamarias en estudios de referencia de pruebas reproductivas y de desarrollo.

Seccionando los Montes Enteros de las Glándulas Mamarias para la Identificación de Lesiones

La glándula mamaria es una estructura bicapa, que comprende células epiteliales mioepiteliales externas e internas. Presentado es un protocolo para preparar organoides utilizando la trippsinización diferencial. Este método eficiente permite a los investigadores manipular por separado estos dos tipos de células para explorar preguntas sobre sus funciones en la forma y función de la glándula mamaria.

Generación de organoides mamarios de mosaico por trippsinización diferencial

El método de imágenes intravitales descrito aquí utiliza la segunda generación armónica de colágeno y la fluorescencia endógena del cofactor metabólico NAD(P)H para segmentar de forma no invasiva un microambiente tumoral no etiquetado en compartimentos tumorales, estromales y vasculares para un análisis en profundidad de imágenes intravitales 4D.

Un enfoque de segmentación sin etiquetas para imágenes intravitales del microambiente tumoral mamario

El presente protocolo describe una técnica sencilla para la obtención de imágenes intravitales de la glándula mamaria de ratón lactante mediante microscopía confocal y multifotónica de barrido láser.

Microscopía subcelular intravital de la glándula mamaria

Este protocolo discute un enfoque para generar organoides epiteliales a partir de tejido mamario primario normal y tumoral a través de centrifugación diferencial. Además, se incluyen instrucciones para el cultivo tridimensional, así como imágenes inmunofluorescentes de organoides incrustados.

Generación y obtención de imágenes de organoides epiteliales humanos y de ratón a partir de tejido mamario normal y tumoral sin pasar

Este protocolo describe un enfoque escalable de cribado intraductal CRISPR que permite estudios paralelos in vivo de eliminación y activación génica en la glándula mamaria del ratón.

Cribado in vivo paralelo de la eliminación y activación génica en la glándula mamaria del ratón

Aprenda a aislar glándulas mamarias intactas de ratón para analizar la expresión de proteínas de matriz extracelular y la arquitectura ductal mediante histología e inmunohistoquímica. Este método facilita estudios de biología del desarrollo y cáncer.

Aislamiento de las glándulas mamarias del ratón intacto, todo para el análisis de expresión de la matriz extracelular y la morfología de la glándula (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de las glándulas mamarias del ratón intacto, todo para el análisis de expresión de la matriz extracelular y la morfología de la glándula

Explorar más videos