Name: Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprende a aislar fagosomas que contienen Salmonella typhimurium de macrófagos mediante biotina y estreptavidina. Este método sencillo sin equipo especializado facilita estudios de maduración de fagosomas e inmunología.

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Investigación en laboratorio de Robinson es apoyada por fondos de Colonia Cluster de excelencia en las respuestas de estrés celular en enfermedades Aging-Associated, Universidad de Colonia, Alemania (CECAD; financiado por el DFG dentro de la iniciativa de excelencia de la federal alemana y los gobiernos del estado) y becas de la Fundación Maria-Pesch de la Universidad de Colonia, Alemania, Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670) y fortuna Köln.

todos los pasos que implican el uso de patógenos S. typhimurium debe llevarse a cabo en un BSL-2 o mayor facilidad de nivel de seguridad biológica. La cultura y la capa de S. Typhimurium, así como la infección de macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) debe realizarse bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. El aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas se puede realizar en cualquier banco de laboratorio BSL-2.
 la extracción de médula ósea de ratones para su diferenciación en macrófagos fue realizada de acuerdo con las directrices sobre bienestar animal y aprobada por la Agencia Estatal de Renania del Norte-Westfalia para la naturaleza, Medio ambiente y protección del consumidor [Landesamt für Natur, Umwelt y Verbraucherschutz (LANUV) Renania del Norte-Westfalia; Archivo no: 02.05.40.14.082 84 y 84-02.04.2015.A443] y la Universidad de Colonia.
 1. cultivo S. typhimurium <ol><li>inocule S. typhimurium (SL1344 tensión) de una única colonia bacteriana en 5 mL de cerebro corazón infusión (BHI) caldo utilizando un bucle bacteriano.</li>
	<li>Incubar la suspensión bacteriana en una incubadora a 37 ° C durante la noche con sacudarir.</li>
	<li>Al día siguiente, transferir 1 mL de la suspensión bacteriana en 19 mL de caldo BHI en un matraz cónico e incubar a 37 ° C en una incubadora con agitación.</li>
	<li>Supervisar la S. typhimurium crecimiento midiendo la densidad óptica (OD) a 600 nm (OD 600) con un espectrofotómetro. Las mediciones deben tomarse aproximadamente cada 30 minutos</li>
	<li>OD cuando 600 alcanza 1.0, retire la suspensión bacteriana de la incubadora y transferencia en tubo de 50 mL. Centrifugue las bacterias a 5.400 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante y resuspender en 10 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>Centrifugar a 5.400 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender las bacterias en 4,9 mL de PBS estéril.</li>
</ol> 2. Capa de S. typhimurium con bolas magnéticas conjugado NHS-biotina/estreptavidina biotina <ol><li>Agregar 100 μl de 10 mg/mL a la solución (NHS-biotina disuelto en dimetil sulfóxido, DMSO) recién preparada, a la suspensión bacteriana preparado en el paso anterior. Por ejemplo, diluir 5 mg de biotina de NHS en 0,5 mL de DMSO estéril. Mezcla adecuadamente mediante pipeteo arriba y abajo varias veces.</li>
	<li>Dividir la mezcla en cinco tubos de 1.5 mL.</li>
	<li>Incubar por 2 h a temperatura ambiente (RT) en un termobloque con agitación constante a 350 rpm.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 15.000 x g por 10 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender en 1 mL de PBS estéril, centrifugar a 15.000 x g por 10 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Repetir 2,5 dos veces más para eliminar el exceso biotina une solución.</li>
	<li>Después del último lavado, Resuspender el precipitado en 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Transferir 100 μl de solución de conjugado estreptavidina - granos magnéticos de 10 mg/mL en un tubo de 1,5 mL y dejarla en la rejilla magnética de 5 min.</li>
	<li>Quitar el disolvente con una pipeta, tomar el conjugado estreptavidina-solución granos magnéticos de la rejilla magnética y resuspender con 1 mL de suspensión bacteriana revestido de biotina preparado en el paso 2.7.</li>
	<li>Incubar durante 1 h a temperatura ambiente en un termobloque con agitación constante a 350 rpm.</li>
	<li>Coloque la solución en la rejilla magnética, espere 5 minutos y luego retire con una pipeta de las bacterias que no adhirió a la pared (guardarlo en un tubo etiquetado como &#34; bacterias sin recubrimiento &#34;). La fracción que se adhiere a la pared del tubo en contacto con el imán es la bacteria biotina/estreptavidina-revestido.</li>
	<li>Quitar el tubo que contiene las bacterias marcadas de la rejilla magnética y resuspender en 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Colocarlo otra vez en la rejilla magnética, espere 5 minutos y utilice una pipeta para extraer el PBS.</li>
	<li>Repita 2.13 y 2.14 dos veces para eliminar todas las bacterias que no están cubiertas con las bolas magnéticas conjugado estreptavidina.</li>
	<li>Después del último lavado, resuspender las bacterias recubiertas en 500 μl de PBS estéril y etiquetar el tubo como &#34; revestido bacterias &#34;.</li>
	<li>Contar las colonias formando unidades (UFC) de ambos &#34; no recubiertas de bacterias &#34; y &#34; recubiertas de bacterias &#34; soluciones por diluciones seriadas en placas de agar BHI de la galjanoplastia. Se obtienen aproximadamente 2 x 10 8 UFC/mL de bacterias recubiertas de 20 mL de suspensión bacteriana inicial con OD 600 de 1.0. Mantener la suspensión bacteriana cubierto a 4 ° C para ser utilizado al día siguiente para infectar a los macrófagos.</li>
</ol> 3. Infección de BDMDs <ol><li>el mismo día cuando las bacterias están recubiertas con biotina y estreptavidina conjugada granos magnéticos, placa completamente el distinguido BMDMs 22 platos de 6 cm con una densidad de 5 x 10 6 células por plato.</li>
	<li>Al día siguiente, centrifugar la suspensión bacteriana cubrió a 15.000 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) en una concentración de 10 x 10 6 UFC/mL.</li>
	<li>Para infectar a los macrófagos en una multiplicidad de infección (MOI) de 10, quitar el medio de las BMDMs y añadir 5 mL de suspensión bacteriana cubierto preparado. MOI óptima puede evaluarse para cada tipo de células o el propósito experimental de los fagosomas aisladas.</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente durante 10 min para sincronizar fagocitosis.</li>
	<li>Incubar a 37 ° C en un incubador 5% CO 2 durante 30 minutos iniciar la fagocitosis. Otros tipos de células pueden requerir tiempos de incubación diferentes para asegurar la internalización de la bacteria.</li>
	<li>Quitarlo del medio que contiene bacterias de los platos y lavar las células con RPMI tres veces para eliminar las bacterias internalizadas no.</li>
	<li>Por último, añadir 10 mL de RPMI con 10% FBS y 50 μg/mL gentamicina para matar a las bacterias fagocitadas no.</li>
	<li>Incubar los infectados BMDMs a 37 ° C con 5% CO 2 hasta que punto el tiempo deseado. El momento deseado debe ser determinada experimentalmente según la bacteria y tipo de la célula usado y el propósito de análisis. Para el estudio de los acontecimientos tempranos de la fusión fagosoma-endosome en S. BMDMs typhimurium infectada, se recomienda una incubación de 30 min. Para el análisis de acontecimientos posteriores, fagosomas pueden extraerse después de 2 h o 4 h de incubación. Incubación prolongada de macrófagos con S. Typhimurium más allá de 24 h resulta en la muerte de los macrófagos. Extendido la infección intracelular antes de la extracción de fagosoma probablemente podría conducir a la degradación de las moléculas de biotina. Sin embargo, no se observó pérdida de biotina en bacterias recubiertas hasta 24 h.</li>
</ol> 4. Aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas almacenador intermediario <ol><li>preparar el volumen de fagosoma necesario aislamiento A (50 mM tubos, pH.7, 50 mM de MgCl 2, 5 mM EGTA) mediante la adición de Ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 1 mM, citocalasina B para un final concentración de 10 μm y proteasa y fosfatasa inhibidores según lo recomendado por el fabricante. 
	Nota: TDT y Cytochalasin B deben agregarse al búfer de aislamiento de fagosoma A siempre inmediatamente antes de usar. Cytochalasin B altera el citoesqueleto, facilitando la ruptura de la membrana celular.</li>
	<li>En el momento deseado punto, eliminar el medio de las células infectadas y lavar con PBS estéril calentada a RT.</li>
	<li>Añadir 750 μl de phagosome aislamiento del almacenador intermediario A por plato e incubar 20 minutos en hielo. Cuando se utiliza un número diferente de células, debe ajustarse proporcionalmente el volumen de tampón de aislamiento A.</li>
	<li>Añadir 250 μl de tampón de fagosoma aislamiento B (tubos de 50 mM, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, manitol de 220 mM y 68 mM sacarosa). Roca la placa para que el buffer llegue a toda la superficie del plato. Cuando se utiliza un número diferente de células, debe ajustarse proporcionalmente el volumen de tampón de aislamiento B.</li>
	<li>Eliminar las células del plato raspando suavemente usando un policía de goma y transferirlos a un tubo de 1.5ml previamente enfriada.</li>
	<li>Pasar la suspensión celular a través de una aguja de 26G utilizando una jeringa de 1 mL por lo menos 15 veces (una aspiración y una expulsión del suspensión del recuento como una vez). Esto es suficiente para liberar el contenido citosólico de BMDMs. El número de pasadas a través de la aguja debe ser optimizado para cada tipo de celular.</li>
	<li>Coloque la suspensión de células en la rejilla magnética y espere 5 minutos. Las partículas de imán son los fagosomas que contienen revestido - S. Typhimurium. La suspensión contiene el resto de los componentes celulares.</li>
	<li>Transferir la suspensión a un tubo de 1,5 mL etiquetado como &#34; citosol &#34;.</li>
	<li>Quitar el tubo con los fagosomas aislados de la rejilla magnética y resuspender en 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Coloque la suspensión del fagosoma en la rejilla magnética, espere 5 minutos y retirar el PBS.</li>
	<li>Repita los pasos 4.9 y 4.10 para lavar el aislado S. typhimurium-que contienen fagosomas.</li>
	<li>Finalmente retirar el PBS y resuspender los fagosomas en el buffer necesario; por ejemplo, en un tampón de ensayo (RIPA) radioinmunoprecipitación para análisis de proteínas. Aproximadamente el 50-200 μg de proteína se obtiene por ejemplo siguiendo este protocolo, dependiendo de la cantidad inicial de las células y el Ministerio del interior de la infección de.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un nuevo método para el aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas cubriendo las bacterias con biotina y estreptavidina conjugada granos magnéticos se describe aquí. Después de la interrupción de la membrana celular suave, fagosomas que contienen bacterias pueden ser fácilmente extraídos mediante una rejilla magnética. Demostramos que el etiquetado de las bacterias conserva la capacidad del patógeno para inducir inflamación y no altera la propiedad fagocítica de la célula huésped. Lo importan...

Los macrófagos circulan células fagocíticas especializadas que detectan, fagocitan y degradarán cualquier partícula extranjera presente en los tejidos periféricos, que van desde células apoptóticas a la invasión de microorganismos como las bacterias. Sobre superficie receptor-medió el reconocimiento de marcadores específicos del patógeno comúnmente presentes en la superficie de los microorganismos (conocido como patrones moleculares asociados a patógenos PAMPs), los macrófagos inician una reorganización compleja de la membrana celular en orden para rodear y fagocitan el patógeno1.
El patógeno engulló entonces contenido por el macrófago en una vesícula intracelular denominada fagosoma. A través de una serie de eventos de fisión con otras vesículas de endosomas y lisosomas y fusión, el fagosoma que contiene el patógeno adquiere un conjunto de proteínas necesario para la eliminación del contenido phagosomal. Por lo tanto, la composición enzimática del fagosoma es altamente variable en el transcurso de este proceso, conocido como de la maduración del fagosoma2.
Poco después de la fagocitosis, la multimérica Complejo ATPasa vacuolar (v-ATPasa) se incorpora a la membrana del fagosoma por fusión con endosomas3. Este complejo utiliza ATP para protones bomba desde el citosol al lumen del fagosoma4. Acidificación del fagosoma es esencial para los eventos de fusión con otras vesículas5 y para la activación de un gran número de enzimas degradativas dependiente de pH6. Otro complejo enzimático multimérica que rápidamente se ensambla en la membrana del fagosoma es el complejo NADPH-oxidasa (NOX). NOX complejo oxida NADPH para producir especies reactivas del oxígeno (ROS) que se secretan en el lumen del fagosoma y que contribuyen significativamente a la muerte de los microorganismos ingieren7.
Durante los pasos iniciales de la maduración, fagosomas presentan marcadores típicamente como Rab5 y Rab7 de endosomas temprano y tardío respectivamente junto con la subunidad de0 V de la v-ATPasa8. Fusión de los fagosomas con los lisosomas y endosomas finales resulta en la exposición del patógeno fagocitado a una gran variedad de enzimas hidrolíticas tales como lipasas y proteasas catepsina y β-galactosidasa9. Acidificación del lumen también se requiere para la activación de estas enzimas. Por ejemplo, el escote de catepsina D para producir la forma corta activa es dependiente de pH10. Estas enzimas degradan el patógeno y median la producción de péptidos derivados del patógeno cortos que son presentados por el macrófago de histocompatibilidad (MHC) clase II moléculas complejas a las células T para desencadenar una respuesta inmune adaptativa11.
Por lo tanto, la maduración del fagosoma es crucial para la respuesta inmunitaria innata y une los brazos del sistema inmune innatos y adaptativos. No es de sorprender que los patógenos han desarrollado estrategias para superar la eliminación por los macrófagos a través del proceso anteriormente descrito de la maduración del fagosoma. Por ejemplo, la bacteria intracelular tuberculosis del Mycobacterium y Legionella pneumophila prevenir la maduración del fagosoma por Asamblea de v-ATPase inhibidor y lumen consecuente acidificación12,13 . Otras bacterias como la Listeria monocytogenes o Shigella flexneri inducen la formación de poros en la membrana del fagosoma para escapar en el citosol14,15. Por otra parte, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) es capaz de modificar las propiedades del fagosoma dentro de la vacuola para transformarlo en un lugar adecuado para su replicación16. Esta capacidad hace S. typhimurium un modelo muy interesante para estudiar la interferencia mediada por el patógeno de la maduración del fagosoma.
S. typhimurium es una bacteria intracelular facultativa que produce gastroenteritis en humanos. Después de invasión de la lámina propia, S. Bacterias typhimurium son rápidamente detectadas y fagocitadas por los macrófagos y dentro de fagosomas17. Algunos informes han descrito previamente S. typhimurium-fagosomas que contienen actualmente los fabricantes de endosomas y lisosomas18, y otros estudios han encontrado la fusión fagosoma-lisosoma prevenida sobre S. De la infección typhimurium19.
Inicialmente, maduración de fagosoma al S. la infección typhimurium ha sido investigada por microscopia de la inmunofluorescencia. El desarrollo de técnicas para el aislamiento de las bacterias que contienen fagosomas permitió un estudio más preciso del contenido en términos de marcadores endosome y lisosoma fagosoma. Hasta la fecha, el método principal utilizado para el aislamiento de las bacterias que contienen fagosomas es el fraccionamiento subcelular en sacarosa paso gradientes18,20. Sin embargo, este método requiere varios pasos de centrifugación que pueden causar daños mecánicos en fagosomas, pueden afectar la estabilidad de phagosomal componentes (proteínas y lípidos) y consume tiempo. Por otra parte, requiere el uso de una ultracentrífuga: una pieza de equipo especializado que no es accesible para cada laboratorio.
Recientemente, se ha aplicado un nuevo enfoque para el aislamiento de bacterias que contienen fagosomas, en la que bacterias patógenas están marcados con lipopetide biotinilado (Lipobiotin) y más tarde extrajeron usando bolas magnéticas conjugado estreptavidina21 . Proponemos un método alternativo complementario por etiquetado bacterianas superficiales macromoléculas que contienen amina con NHS-biotina seguido de bolas magnéticas conjugado estreptavidina. Fagosomas obtenidos por este método son altamente enriquecidos en marcadores endosome y lisosoma y pueden utilizarse para una amplia gama de ensayos, de análisis de proteínas para análisis ómicas. Además, no requiere equipo especializado como ultracentrífugas. Por otra parte, mediante la eliminación de los pasos de centrifugación, el daño mecánico a los fagosomas y la cantidad de tiempo empleado se reducen considerablemente. Este método se puede adaptar fácilmente para el aislamiento de los fagosomas que contienen otras bacterias como la gram-positivos Staphylococcus aureus, incluido también en este manuscrito. En Resumen, este método para el aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas es un simple, rentable, y menos consumo de tiempo que el aislamiento clásico de sacarosa gradiente-ultracentrifugación, representación altamente enriquecido fagosomas que contienen bacterias.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link NHS Biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>FluidMag Estreptavidina</td><td>Chemicell</td><td>4205</td><td></td></tr><tr><td>TUBERÍAS</td><td>Carl Roth</td><td>9156.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>A537.4</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina B</td><td>Sigma</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>DYNAL o DynaMag</td><td>Imán Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Espectrofotómetro</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Bucle bacteriano (10&micro; l)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1562.010</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td><td>Instituto Leibniz DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos</td><td></td><td></td>celulares</tr><tr><td>RPMI</td><td>Biochrom</td><td>FG1415</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-estreptavidina</td><td>Invitrogen</td><td>SA1011</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-beta-actina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-mCherry</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-34974</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-Rab5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46692</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-Rab7</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10764</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-v-ATPasa (V0)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-28801</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-v-ATPasa (V1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20943</td><td></td></tr><tr><td>anti-catepsina D anticuerpo</td> Santa <td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-6486</td><td></td></tr><tr><td>anti-Tomm20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17764</td><td></td></tr><tr><td>anti-calnexina anti-Calnexin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46669</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-20357</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium es una bacteria intracelular facultativa que produce gastroenteritis en humanos. Después de invasión de la lámina propia, S. bacterias typhimurium son rápidamente detectadas y fagocitadas por los macrófagos y contenidas en vesículas denominadas fagosomas para degradar. Aislamiento de S. typhimurium-fagosomas que contienen han sido ampliamente utilizados para el estudio de cómo S. la infección typhimurium altera el proceso de maduración del fagosoma para evitar la degradación bacteriana. Clásicamente, el aislamiento de las bacterias que contienen fagosomas ha llevado a cabo por centrifugación gradiente de sacarosa. Sin embargo, este proceso lleva tiempo y requiere de equipo especializado y un cierto grado de destreza. Se describe aquí es un método simple y rápido para el aislamiento de S. typhimurium-con fagosomas de los macrófagos en cubriendo las bacterias con bolas magnéticas conjugado con biotina-estreptavidina. Fagosomas obtenidos por este método pueden suspenderse en cualquier buffer de elección, permitiendo la utilización de fagosomas aisladas para una amplia gama de ensayos, como el análisis de proteínas, metabolitos y lípidos. En Resumen, este método para el aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas es específico, eficiente, rápida, requiere equipos mínimos y es más versátil que el clásico método de aislamiento por gradiente de sacarosa-ultracentrifugación.

Aislamiento de bacterias que contienen fagosomas en este protocolo requiere el biotinylation de las bacterias como un primer paso. Por lo tanto se evaluó la eficacia de S. Biotinilación de typhimurium por análisis de microscopía confocal de BMDMs infectadas con biotinilado mCherry -S. typhimurium marcado con Cy5-estreptavidina. Brevemente, BMDMs fueron infectados como se describe en este protocolo con mCherry -S. typhimurium previament...

Aquí describimos un método simple y rápido para el aislamiento de Salmonella typhimurium-con fagosomas de los macrófagos en cubriendo las bacterias con biotina y estreptavidina.

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar las bacterias intactas y enriquecidas que contienen fagosomas. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como los cambios en la maduración de los fagosomas y el procesamiento de antígenos cuando los microorganismos patógenos invaden las células huésped. La principal ventaja de la técnica es que produce bacterias de alta calidad que contienen fagosomas mediante pasos sencillos y sin necesidad de equipos especializados.Las personas nuevas en el método lo encontrarían técnicamente accesible en comparación con las no metodologías. La primera vez que tuvimos la idea de desarrollar este método fue cuando estudiábamos los mecanismos por los cuales los patógenos intracelulares secuestran los fagosomas para su beneficio. La comprobante de este procedimiento estará a cargo de Saray Gutiérrez, postdoc de mi laboratorio.Para iniciar el cultivo de Salmonella Typhimurium, use un asa de bacterias para inocular una sola colonia bacteriana en 5 mililitros de caldo de infusión cerebro-corazón. Luego incube la suspensión en una incubadora a 37 grados centígrados durante la noche mientras agita. Transfiera un mililitro de esta suspensión bacteriana a 19 mililitros de caldo BHI en un matraz cónico al día siguiente.Incubar de nuevo en una incubadora a 37 grados centígrados mientras se agita. Cuando el OD600 alcance uno, retire el matraz de la incubadora y transfiera el cultivo a un tubo de 50 mililitros. A continuación, centrifugar el tubo a 5400 x G a 4 grados centígrados durante 15 minutos.Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet bacteriano en 10 mililitros de PBS estéril. Después de repetir la centrifugación una vez, vuelva a suspender el pellet en 4,9 mililitros de PBS. A continuación, agregue 100 microlitros de solución de enlace de biotina recién preparada a la suspensión bacteriana.Después de dividir esta suspensión en cinco tubos de 1,5 mililitros, incubar en un bloque térmico a temperatura ambiente con agitación constante a 350 rpm durante dos horas. Después de centrifugar los tubos a 15.000 x G a temperatura ambiente durante diez minutos, deseche el sobrenadante. Después de dos pasos más de centrifugación y la eliminación completa de la solución de enlace de biotina, vuelva a suspender esta bacteria codificada con biotina en un PBS estéril de un mililitro en un solo tubo de 1,5 mililitros.Transfiera 100 microlitros de solución de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina a un tubo nuevo de 1,5 mililitros y colóquelo en una rejilla magnética durante cinco minutos. Después de retirar el disolvente del tubo, retire el tubo de la rejilla magnética. A continuación, vuelva a suspender las perlas que quedaron en el tubo con un mililitro de suspensión bacteriana codificada con biotina.Incubar el tubo en un bloque térmico a temperatura ambiente durante una hora mientras se agita a 350 rpm. A continuación, coloque el tubo en la rejilla magnética durante cinco minutos. Utilice una pipeta para eliminar las bacterias que no se adhirieron a la pared y transfiéralas a un nuevo tubo etiquetado como bacterias no codificadas.El tubo con perlas magnéticas adheridas a la pared contiene bacterias codificadas con biotina estreptavidina. Retire el tubo con bacterias codificadas con biotina estreptavidina de la rejilla magnética y vuelva a suspenderlo en un mililitro de PBS estéril. Después de que el tubo haya estado en la rejilla magnética durante cinco minutos, retire el PBS.Finalmente, vuelva a suspender las bacterias codificadas con biotina estreptavidina lavadas en 500 microlitros de PBS estéril y etiquete el tubo como bacterias codificadas. El día anterior a la infección, se colocaron BMDM completamente diferenciados en una placa de seis centímetros en RPMIs suplementados con un diez por ciento de FBS. Al día siguiente, centrifugar la suspensión bacteriana codificada a 15.000 x G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet bacteriano en medio RPMI suplementado con un diez por ciento de FBS. Retire el medio de los BMDM y agregue cinco mililitros de suspensión bacteriana codificada en el medio RPMI para infectar las células. Para sincronizar la fagocitosis, incubar a temperatura ambiente durante diez minutos.Luego, para iniciar la fagocitosis, incube a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al cinco por ciento durante 30 minutos. Después de la incubación, retire el medio de los platos y lave las células tres veces a RPMI para eliminar las bacterias no internalizadas. Para matar cualquier bacteria no fagocitada a diez mililitros de RPMI que contiene diez por ciento de FBS en 50 microgramos por mililitro de gentamicina.Finalmente, incube los BMDM infectados a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono al cinco por ciento hasta el punto de tiempo deseado. En primer lugar, prepare el volumen de tampón de aislamiento de fagosomas A necesario añadiendo DTT y citocalasina B justo antes de su uso y los inhibidores de la proteasa y la fosfatasa según lo recomendado por el fabricante. Retire el medio de las células infectadas en el momento deseado y lave las células con PBS estéril precalentado a temperatura ambiente.A continuación, añada 750 microlitros de tampón de aislamiento de fagosomas A a la placa e incube en hielo durante 20 minutos. Recuerde mecer el plato de vez en cuando. A continuación, agregue 250 microlitros de tampón de aislamiento de fagosomas B y luego agite las placas para asegurarse de que el tampón cubra completamente la superficie.Raspe suavemente las células con un policía de goma para quitar las células del plato y transfiéralas a un tubo preenfriado de 1,5 mililitros. Luego use una jeringa de un mililitro para pasar la suspensión celular a través de una aguja de calibre 26 al menos 15 veces. A continuación, coloque la suspensión de la celda en el bastidor magnético durante cinco minutos.Las partículas unidas a las perlas magnéticas son fagosomas que contienen S. Typhimurium codificado. A continuación, transfiera la suspensión que contiene el resto de los componentes celulares a un nuevo tubo de 1,5 mililitros etiquetado como Cytosol. Retire el tubo que contiene fagosomas aislados de la gradilla y vuelva a suspenderlo en un mililitro de PBS estéril.Vuelva a colocar el tubo en la rejilla magnética durante cinco minutos y luego retire el PBS. Después de repetir este lavado con PBS una vez, retire el PBS y, finalmente, vuelva a suspender los fagosomas que contienen S. Typhimurium en el tampón requerido. Para evaluar la efectividad de la biotinilación de S. Typhimurium mediante microscopía confocal, los BMDM se infectaron con mCherry S. Typhimurium marcado con biotina.Después de la fijación e incubación con Cy5-Streptavidin, la biotinilación exitosa fue confirmada por la señal fluorescente de Cy5-Streptavidin. Esta señal se observó exclusivamente en mCherry S.Typhimurium biotinilado, mientras que no hubo señal en mCherry S.Typhimurium no biotinilado. El análisis de inmunobloques de fagosomas aislados mostró un enriquecimiento significativo de mCherry que expresa S. Typhimurium en fagosomas en comparación con la fracción citosólica.El análisis de inmunobloqueo utilizando marcadores de endosomas y lisosomas en fagosomas aislados mostró un enriquecimiento de los marcadores probados en fagosomas aislados cuatro horas después de la infección en comparación con 30 minutos después de la infección. Cuando se aplicó este protocolo a Staphylococcus aureus, se demostró una biotinilación exitosa de GFP que expresa S. aureus. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora y media dependiendo del tiempo de incubación elegido para la infección por el investigador.Para garantizar el éxito del aislamiento de bacterias que contienen fagosomas, asegúrese de que los tampones contengan las concentraciones indicadas y que las placas estén mecidas para garantizar la cobertura homogénea de las células. Además, tenga cuidado al raspar las células y al pasar la suspensión celular a través de la aguja. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas como la proteómica o la metabolómica con fagosomas aislados para estudiar la alteración causada por patógenos bajo factores patogénicos implicados.

isolation-salmonella-typhimurium-containing-phagosomes-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Gutiérrez, S., et. al., Aislamiento de fagosomas que contienen Salmonella typhimurium de macrófagos. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra el cultivo y la preparación de Salmonella typhimurium para obtener una suspensión bacteriana limpia y metabólicamente activa adecuada para uso experimental.

Preparación de cultivo de Salmonella typhimurium

Fuente: Sigal, N., et al. Purificación de ARN de Listeria monocytogenes cultivada intracelularmente en células macrófagas.  J. Vis. Exp. (2016).Este vídeo demuestra el aislamiento de bacterias patógenas internalizadas a partir de macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) infectados. Se permite que las bacterias se adhieran a las células huésped y las bacterias no adheridas son arrastradas. Tras la internalización, se añade un antibiótico para eliminar bacterias no internalizadas. Las...

Aislamiento de bacterias patógenas intracelulares a partir de células infectadas del huésped

Source: Gutiérrez, S., et al., Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the magnetic isolation of phagosomes containing biotin–streptavidin bead–coated bacteria from infected macrophages. The protocol includes buffer treatments, cell disruption, magnetic separation, and washing to yield purified phagosomes for analysis.

Isolation of Phagosomes Containing Magnetic Bead-Tagged Bacteria from Infected Macrophages

Source: Fernández-Fernández, R., et. al. Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the use of exogenous LPS (Lipopolysaccharide) as a receptor mimic to inactivate lytic bacteriophages in Salmonella cultures. Through sequential incubation, centrifugation, and washing, phages are eliminated, resulting in a viable, phage-free bacterial suspension for downstream applications.

Inactivation of Bacteriophages Using Exogenous Lipopolysaccharide to Generate Phage-Free Salmonella Cultures

Este video muestra un ensayo para cuantificar Salmonella typhimurium citosólico y vacuolar dentro de macrófagos derivados de la médula ósea utilizando permeabilización diferencial. Los macrófagos están infectados con una proteína fluorescente que expresa Salmonella, que se internaliza dentro de una estructura vacuolar especializada llamada vacuola que contiene Salmonella o SCV. Un subconjunto de bacterias escapa del VCS y entra en el citosol. La membrana plasmática rica en colesterol de los...

Un ensayo para cuantificar Salmonella citosólica y vacuolar en macrófagos primarios infectados

Este video demuestra una técnica de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) de alta resolución para la visualización en tiempo real de la formación y cierre de fagosomas durante la fagocitosis mediada por macrófagos de glóbulos rojos (RBC) opsonizados con IgG adheridos a la superficie de un plato con fondo de vidrio. Los macrófagos extienden seudópodos alrededor de los glóbulos rojos y los engullen dentro de los fagosomas, separándolos de la superficie del vidrio.

Visualización basada en microscopía TIRF de la formación y el cierre de fagosomas

Un ensayo de alto rendimiento in vitro de Salmonella fenotipo u otra asociación bacteriana, invasión, y la replicación en las células fagocíticas con capacidad de alto rendimiento se ha desarrollado. Se empleó el método de evaluar las cepas mutantes de Salmonella gen knockout por sus implicaciones en la interacción huésped-patógeno.

Ensayo de alto rendimiento para Fenotipo Salmonella enterica Asociación Typhimurium, Invasión y replicación en macrófagos

Describimos aquí un protocolo sencillo para aislar macrófagos peritoneales murinos. A este procedimiento le sigue la extracción de ARN para llevar a cabo el análisis de la expresión génica tras la estimulación de los receptores tipo Toll.

Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación

Describimos la cuantificación de Salmonella typhimurium citosólica y vacuolar en macrófagos derivados de la médula ósea utilizando la permeabilización diferencial de digitonina.

Cuantificación de Citosólica vs. Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; En macrófagos primarios por permeabilización diferencial

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón usando la fluorescencia verde mayor expresando proteínas de Escherichia coli.

Utilizando mayor expresión de proteína de fluorescencia verde Escherichia Coli evaluar fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón

Los bacteriófagos, ubicuos y diversos en la Tierra, infectan y se replican dentro de los huéspedes bacterianos, desempeñando un papel crucial en los ecosistemas microbianos. A pesar de su importancia, su presencia puede perturbar los procesos industriales. Hemos desarrollado un método que utiliza lipopolisacáridos bacterianos para eliminar bacteriófagos de cultivos de Salmonella .

Eliminación de bacteriófagos de cultivos infectados de Salmonella

Aprende a aislar fagosomas que contienen Salmonella typhimurium de macrófagos mediante biotina y estreptavidina. Este método sencillo sin equipo especializado facilita estudios de maduración de fagosomas e inmunología.

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

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