Name: Un método eficiente y Simple para establecer líneas de células T de pacientes con infección crónica activa Virus Epstein - Barr y NK (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda a establecer líneas celulares NK y T de pacientes con infección crónica activa por Virus Epstein-Barr utilizando sangre periférica y dosis baja de IL-2. Este método eficiente facilita la investigación inmunológica.

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Este trabajo fue financiado por los proyectos clave de la Academia China de Ciencias (KFZD-SW-205), estratégica biológica recursos tecnología sistema de apoyo de la Academia China de Ciencias (CZBZX-1 y ZSSB-004) y por donaciones de la Fundación Nacional de Ciencias de China ( 81401640) y fondo de Ciencias naturales (14ZR1434800) de Shanghai.

Este estudio fue aprobado por el Comité de ética del Instituto de genética y Biología del desarrollo, Academia China de Ciencias, y el protocolo sigue los lineamientos institucionales para el bienestar humano.
Nota: Vea la figura 1 para un diagrama esquemático del flujo de trabajo.
1. aislamiento de PBMC de CAEBV pacientes
<ol><li>Purificar primaria PBMC de 2 mL de sangre total de pacientes CAEBV por gradiente (p. ej., placa de Ficoll) centrifugación siguiendo las instrucciones del fabricante. Por otra parte, deshielo cryopreserved PBMC de nitrógeno líquido con Medio RPMI 1640.</li>
	<li>Añadir 2 μl de azul tripán (0,4%) a 18 μL célula suspensión, espere 3 minutos para teñir las células, transferir la suspensión a la placa del contador de célula y medir la concentración y viabilidad con un contador de células automatizado de las células.</li>
	<li>Preparar la suspensión celular con una densidad de 2-3 x 106 células/mL con medio de cultivo RPMI 1640 completo que contiene 20% de suero humano (inactivado a 56 ° C por calor), 2 mM L-glutamina y antibióticos (estreptomicina 100 de μg/mL, 100 U/mL de penicilina). Sembrar 1 mL de la suspensión PBMC por pozo en placas de cultivo celular de 24 pozos.</li>
	<li>Añadir 150 U rhIL-2 por pocillo.</li>
	<li>Colocar las placas en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C.</li>
	<li>En el día 2, observar la morfología de la célula bajo el microscopio (200 aumentos); las células están en buenas condiciones cuando son brillantes y redondos.</li>
</ol>2. expansión de las células y las células viables de numeración
<ol><li>Observar la morfología de la célula bajo el microscopio (200 aumentos) y vigilar la condición del crecimiento celular numerando las células antes de cambiar de medio: Añadir 2 μl de azul tripán (0,4%) a 18 μL célula suspensión y calcular la concentración de las células (ver 1.2, Figura 2).</li>
	<li>Deseche 500 μl del medio en una placa de 24 pocillos y agregar 500 μl completa cultura medio fresco. Añadir 150U rhIL-2 por pocillo.</li>
	<li>Cambiar el medio dos veces a la semana como en el paso 2.2.</li>
	<li>Dibujar la curva de crecimiento de la célula (figura 3).</li>
	<li>Cuando excede la concentración de células viables/ml6de 5 × 10, se dividen las células en nuevos pozos a una concentración de 1-2 × 106 células/mL en cada pozo. Este proceso toma de 2-4 semanas.</li>
</ol>3. célula Phenotyping por citometría de flujo
<ol><li>Cuando las células se han ampliado, recoger 1 × 106 células para determinar los fenotipos de líneas celulares. Centrifugar las células a 240 x g durante 5 min a temperatura ambiente (células de NK/T precipitará en el fondo del tubo).</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante, lavar la precipitación añadiendo 7 mL de PBS. Centrifugar durante 5 min a 240 x g a temperatura ambiente. Repetir una vez.</li>
	<li>Añadir suero humano de 200 μL en cada tubo, mezclar bien e incubar 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar las células a 240 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en el 1 × 106/mL con PBSA frío (PBS+0.2%BSA). Se dividen las células en 5 tubos, cada tubo contiene 2 × 105 células.</li>
	<li>Centrifugar las células a 240 x g durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender las células con buffer PBSA o PBSA que contienen 10 μl PE (PE-Cy7) y 10 μl FITC anticuerpos para receptores de las células de las células T o NK en el hielo la mancha como indica la figura 4. Las células suspendidas con tampón PBSA se utilizan como un control negativo.</li>
	<li>Incubar las células con anticuerpos para 20-30 min en hielo en la oscuridad.</li>
	<li>Lavan las células dos veces con frío PBSA, resuspender las células con 300 μL PBSA frío.</li>
	<li>Analizar el fenotipo de la célula con un citómetro de flujo.<ol>
<li>Configurar el citómetro de flujo en condiciones de "Crear hoja de trabajo". Configurar la plantilla experimental con una trama de puntos que muestra forward scatter (FSC) versus dispersión lateral (SSC).</li>
		<li>Cargar el tubo de control de isotipo para optimizar las tensiones de FSC y SSC y optimizar el valor de umbral FSC para eliminar residuos sin interferir con la población de la célula de interés. Borrar todos los parámetros excepto el FSC y SSC, FITC, PE, PE-Cy7.</li>
		<li>Realizar compensación usando el control de isotipo y un solo control positivo en cada grupo de análisis de color de 2.</li>
		<li>Cargar las muestras y crear HLA-DR VS CD19, CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 y CD3 VS CD16 parcelas punto mostrando diferentes poblaciones de células. Nota: PBMC fueron utilizados para realizar la indemnización mediante el control de isotipo de negativo y control positivo solo. inmunofluorescencia de 2 colores con citómetro de flujo se utilizó rutinariamente para analizar la expresión de marcadores de superficie. Se incluyen los siguientes anticuerpos: anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC), anti-CD8 anti-CD56, conjugados con ficoeritrina (PE) CD3 y anti-CD19 conjugado con PE-Cy7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. expansión y criopreservación de células NK/T
<ol><li>Cambiar el medio una vez terminado el análisis del fenotipo de la célula. Retirar la mitad del sobrenadante cuidadosamente y evite tocar las células en la parte inferior de la placa. Añadir el mismo volumen de medio de cultivo fresco que contenga 300 U/mL rhIL-2 a las placas de la celda.</li>
	<li>Cambiar la mitad del medio cada 3 días (2.2) hasta la celda racimos son claramente visibles bajo el microscopio (figura 2). Por lo general, este proceso tarda 2-3 semanas.</li>
	<li>Transferencia de las células de las placas de 24 pocillos para frascos de cultivo T25 después de mezclar diferentes pozos del mismo linaje. Doble del volumen de medio de cultivo resulta amarillo hasta que el volumen del medio se amplía a 10-15 mL. Añadir rhIL-2 con la concentración de 150 U/mL.</li>
	<li>Cambio medio 24 h antes de congelar después de 2-3 semanas de crecimiento, cuando la célula masa puede observarse a simple vista. Medir la concentración de células con un contador de células.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular por 5 min a 240 g de x y Resuspenda el sedimento celulares a una densidad de 5-10 x 106 células/mL con la solución congelada que contiene 90% de suero fetal bovino y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Congelación a una velocidad de 1 ° C por minuto hasta-80 ° C y luego se transfieren directamente en nitrógeno líquido.</li>
</ol>

<ol><li>Cohen, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus infection.</a> N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).</li>
<li>Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-associated+lymphoproliferative+disease+in+non-immunocompromised+hosts%3A+a+status+report+and+summary+of+an+international+meeting%2C+8-9+September+2008%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008.</a> Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).</li>
<li>Oshimi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+and+managing+natural+killer-cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies.</a> Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).</li>
<li>Kawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+allergy+and+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer-cell+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease.</a> Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).</li>
<li>Kimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%3A+is+this+an+infectious+disease%2C+lymphoproliferative+disorder%2C+or+immunodeficiency%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?</a> Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).</li>
<li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+virologic+characteristics+of+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Blood. 98 (2), 280-286 (2001).</li>
<li>Ohshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+categorization+of+pathological+states+of+EBV-associated+T%2Fnatural+killer-cell+lymphoproliferative+disorder+%28LPD%29+in+children+and+young+adults%3A+overlap+with+chronic+active+EBV+infection+and+infantile+fulminant+EBV+T-LPD%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Int%22%5BJournal%5D)">Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD.</a> Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).</li>
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<li>Nagata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+natural+killer+%28NK%29-cell+and+gammadelta+T-cell+lines+established+from+primary+lesions+of+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas+associated+with+the+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus.</a> Blood. 97 (3), 708-713 (2001).</li>
<li>Nagata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+natural+killer-cell+clones+with+variable+proliferative+capacity+in+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Int%22%5BJournal%5D)">Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).</li>
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<li>Tsuchiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+human+natural+killer-cell+line+%28NK-YS%29+established+from+natural+killer+cell+lymphoma%2Fleukemia+associated+with+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection.</a> Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).</li>
<li>Tsuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-infected+natural+killer+%28NK%29+cell+proliferation+in+patients+with+severe+mosquito+allergy%3B+establishment+of+an+IL-2-dependent+NK-like+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line.</a> Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+cytological+and+cytogenetic+features+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-positive+natural+killer+%28NK%29+cells+and+cell+lines+derived+from+patients+with+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas%2C+chronic+active+EBV+infection+and+hydroa+vacciniforme-like+eruptions%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions.</a> Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).</li>
<li>Oyoshi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+expansion+of+Vgamma9-JgammaP%2FVdelta2-Jdelta3+gammadelta+T+cells+in+nasal+T-cell+lymphoma+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).</li>
<li>Imadome, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+xenograft+models+reveal+a+critical+role+of+CD4%2B+T+cells+in+the+proliferation+of+EBV-infected+T+and+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002326(2011).</li>
<li>Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine+requirement+for+the+generation+of+natural+killer+cells+from+CD34%2B+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).</li>
<li>Spits, H., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+Human+T+and+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cloning of Human T and Natural Killer Cells.</a> Methods. 9 (3), 416-421 (1996).</li>
<li>Liu, X., Xu, C., Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Red+Blood+Cell+Lysis+Method+for+the+Establishment+of+B+Lymphoblastoid+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Kawabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+flow+cytometric+in+situ+hybridization+assay+to+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer+cell+lymphoproliferative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases.</a> Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).</li>
</ol>

D.Z., X.Z. y XC son inventores Co en solicitudes de patentes pendientes que cubren posibles usos de este método para el establecimiento de líneas de células NK/T y las líneas celulares establecidas en el presente estudio. D.Z., X.Z. y XC no declaran a intereses financieros que compiten en este trabajo. Los restantes autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

En este protocolo, se ha desarrollado una nueva técnica para el establecimiento de líneas de células NK/T de la sangre de los pacientes CAEBV. En comparación con los métodos existentes, la gran ventaja de este método es su simplicidad y su exigencia de sólo un pequeño volumen de sangre, mientras que exhibe un alto índice de éxito y buenas condiciones de la viabilidad celular. Además, las líneas de la célula NK/T pueden establecerse mediante cultivo PBMC sin determinar los tipos de células EBV latente infectado por adelan...

Virus de Epstein - Barr (EBV) es ubicuo y se infecta no sólo las células de B, pero también T y células naturales del asesinas (NK), que causa un número de enfermedades linfoproliferativas NK/T EBV-asociado (LPD) y linfoma, leucemia, como hemophagocytic EBV-asociado lymphohistiocytosis, Hidroa vacciniforme-como el linfoma, el linfoma de células NK/T extranodal, tipo nasal y NK agresiva de la célula leucemia1,2,3. Entre éstos es severa active EBV (SCAEBV) enfermedad crónica, que es incidente principalmente en Asia oriental, y que ahora se considera un LPD causada por la expansión clonal de EBV-infectadas T o NK células4,5,6, 7, pero sin la aparente inmunodeficiencia presentes en mononucleosis infecciosa (IM)-como síntomas incluyendo fiebre, hepatoesplenomegalia, linfadenopatía y disfunción del hígado persistente o recurrente, así como alta DNA del VEB de la carga en el sangre periférica de8,9. Los pacientes con CAEBV tienen un pronóstico pobre10,11y su patogénesis y desconoce el papel de la EBV. Por lo tanto, la célula líneas derivadas de las enfermedades lymphoproliferative EBV-asociado NK/T y los linfomas son muy útiles como modelos celulares para clarificar el mecanismo de la EBV indujo proliferación NK o células T y su relación con alta incidencia de leucemia o linfoma.
Hasta la fecha, se han establecido varias líneas celulares con diferentes técnicas12,13,14,15,16. Una línea humana de la célula NK, NK-YS, fue establecida de leucemia/linfoma de células NK, por co-cultivo con una línea de células estromales de ratón como alimentador y en presencia de rhIL-2 en una concentración de 20U por mL15. KAI3 fue otra línea de células NK establecido de pacientes con alergia severa de mosquito o SCAEBV con línea de células limfoblastoides autólogas (LCL), células B transformadas por EBV, como células de alimentador y adición de rhIL-2 100U/mL16. SNK6 y SNT8 se derivan de los tejidos tumorales de pacientes de linfoma de la célula NK/T nasales mediante la adición de altas dosis de rhIL-2 (700U/mL)12. Con técnica similar, la célula de SNK-1 era de pacientes CAEBV, cultivados de PBMC quitando las células de T y adición de 700U/mL de rhIL-213,17. SNT13 y SNT15 fueron establecidos mediante la eliminación de CD4 + y CD8 + células18. Hasta ahora, otras líneas celulares de células T y NK de pacientes LPD EBV-NK/T fueron todos desarrollados con este método19.
Las desventajas de los métodos existentes antes mencionados incluyen el empleo de células de alimentador, el requisito de una alta dosis de IL-2, la utilización de tanto como 10 mL de sangre entera o la purificación de las células NK/T, que es muy difícil en la clínica debido a la necesidad de verificar que tipos de celular latente EBV infecta antes de empezar a la cultura. Como CAEBV ocurre principalmente en niños en Asia, 10 mL de sangre no es fácil de adquirir en todas las regiones. En este estudio, hemos desarrollado un nuevo método simple con un alto índice de éxito para establecer líneas NK y célula de T por cultivo PBMC de pacientes CAEBV usando una dosis baja de rhIL2 y un volumen de 2 mL de sangre sin células de alimentador. Los resultados de este método han demostrado su alta eficiencia y ahorro de tiempo.

<table><tbody><tr><td>Hu HLA-DR FITC</td><td>BD</td> 560944 <td></td><td>anticuerpo para FACS</td></tr><tr><td>Hu CD4 FITC</td><td>BD</td><td>555346</td><td>anticuerpo para FACS</td></tr><tr><td>Hu/NHP CD8 PE</td><td>BD</td><td>557086</td><td>anticuerpo para FACS</td></tr><tr><td>Hu CD3 PE</td><td>BD</td><td>555340</td><td>anticuerpo para FACS</td></tr><tr><td>Hu CD16 FITC 3G8</td><td>BD</td><td></td><td>555406 anticuerpo para FACS</td></tr><tr><td>Hu/NHP CD56 PE MY31</td><td>BD</td><td>556647</td><td>anticuerpo para FACS</td></tr><tr><td>hu/CD19 PE-Cy7</td><td>BD</td><td>560728</td><td>anticuerpo para FACS</td></tr><tr><td>humano IL-2</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>suero humano</td><td>MRC</td><td>CCC118-125</td><td></td></tr><tr><td>incubadora de CO2</td><td>SANYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>Microscopio de centrifugación</td></tr><tr><td></td><td>OLYMPUS CKX53</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado</td><td>Countstar</td><td>IC 1000</td><td>Para el recuento de células</td></tr><tr><td>24 pocillos clúster de cultivo celular</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>Placas de poliestireno Matraz de</td></tr><tr><td>cultivo celular de 25cm2</td><td>Nest</td><td>707001</td><td>Poliestireno</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Componente del medio celular</td></tr><tr><td>RPMI Medio 1640</td><td>vida</td><td>22400089</td><td>Para medio celular</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Amresco</td><td>374</td><td>Componente del medio celular</td></tr><tr><td>100 x estreptomicina solución de penicilina BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>Componente del medio celular</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Para el aislamiento in vitro de linfocitos</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Para la congelación de células</td></tr><tr><td>citómetro de flujo</td><td>BD</td><td>BD FACSAria II</td><td></td></tr><tr><td>software</td><td>BD</td><td>BD FACSDiva software</td><td>FACS análisis</td></tr></tbody></table>

un método eficiente y simple para establecer líneas de células t de pacientes con infección crónica activa virus epstein - barr y nk

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Un número de métodos se ha descrito para establecer líneas de células NK/T de pacientes con linfoma o linfoproliferativo síndrome. Estos métodos emplean células de alimentador, células NK o T purificadas con tanto como 10 mL de sangre o una dosis alta de IL-2. Este estudio presenta un nuevo método con una estrategia potente y simple para establecer líneas de células T y NK por cultivo periférico de la sangre las células mononucleares (PBMC) con la adición de IL-2 humana recombinante (rhIL-2) y utiliza tan poco como 2 mL de sangre entera. Las células pueden proliferar rápidamente en dos semanas y se mantuvo por más de 3 meses. Con este método, se han establecido 7 líneas NK o células T con una alta tasa de éxito. Este método es simple, confiable y aplicable para el establecimiento de líneas celulares de más casos de linfoma CAEBV o NK/T.

Después de 3 días de la cultura durante el establecimiento de líneas celulares, las células polimórficas comienzan a aparecer (figura 2). Después de 7 días, las células crecen rápidamente, mientras que el número y viabilidad de las células se aumentan a una velocidad alta (figura 3). Pequeños grupos de células son claramente visibles después de 10-14 días de crecimiento, cuando la concentración de células puede superar los 3-6 × ...

Un método simple para la obtención de clones de células T y NK de pacientes CAEBV fue desarrollado con eficacia alta, una pequeña cantidad de sangre periférica y una baja dosis de IL-2.

Un método eficiente y Simple para establecer líneas de células T de pacientes con infección crónica activa Virus Epstein - Barr y NK

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener líneas de células NK o T de pacientes con CAEBV, lo que tiene una gran importancia para la investigación sobre esta enfermedad mortal. Este método ayuda a obtener líneas de células NK o T para la investigación del mecanismo del CAEBV, como el estudio del VBV bruto en la proliferación celular, el cribado de inhibidores que interfieren en la proliferación de células NK/T. La principal ventaja de esta técnica es que es muy sencilla y eficaz, ya que requiere solo una pequeña cantidad de sangre periférica y una dosis baja de hierro dos para establecer líneas de células NK o T de pacientes con CAEBV.Por lo general, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades, porque la supervivencia celular en la primera de las dos semanas del cultivo es incierta y este método le mostrará cómo determinar la proliferación celular del cultivo temprano. Cuando tuvimos la idea de este método, descubrimos que el hierro sérico humano puede incluir PBMC hasta por dos semanas. Mostramos que la demostración de este método es crítica, ya que muestra la forma de las células y la causa de la proliferación.Y que la extensión de las células y la numeración de las células de la barra Y Para comenzar este procedimiento, purifique PBMC primario de dos mililitros de sangre total de pacientes con CAEBV mediante centrifugación en gradiente. Alternativamente, descongele PBMC criopreservado a partir de nitrógeno líquido con medio RPMI-1640. A continuación, agregue dos microlitros de azul de tripano al 0,4% a 18 microlitros de suspensión celular para teñir las células durante tres minutos, luego transfiera la suspensión a la placa del contador celular y mida la concentración y viabilidad de las células con un contador celular automatizado.Prepare la suspensión celular a una densidad de dos a tres veces 10 a la sexta células por mililitro, suplementada con un medio de cultivo completo RPMI-1640 que contenga 20% de suero humano, dos milimolares de L-glutamina y antibióticos. Después de eso, siembre un mililitro de suspensión de PBMC por pocillo en las placas de cultivo celular de 24 pocillos. A continuación, agregue 150 unidades por mililitro rhIL-2 a cada pocillo.Coloque las placas de cultivo en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. En el segundo día, observe la morfología de la célula bajo un microscopio con un aumento de 200 veces. Las celdas están en buenas condiciones cuando son brillantes y redondas.En este paso, agregue dos microlitros de azul de tripano al 0,4% a 18 microlitros de suspensión celular y calcule la concentración de las células. A continuación, observe la morfología de la célula y controle el estado del crecimiento celular numerando las células antes de cambiar de medio. Es importante controlar la morfología de la célula y su estado.Podemos juzgar si las células sobreviven por las células polimórficas y la condición de las células en la etapa temprana de un cultivo. Después, retire 500 microlitros del medio de cada pocillo de la placa de 24 pocillos y agréguele 500 microlitros de medio de cultivo completo fresco. Luego agregue 150 unidades por mililitro rhIL-2 a cada pocillo.Cambie el medio dos veces por semana. Traza la curva de crecimiento de la célula. Cuando la concentración de células viables supere cinco veces 10 a la sexta células por mililitro, divida las células en nuevos pocillos a una concentración de una a dos veces 10 a la sexta células por mililitro en cada pocillo.Este proceso tarda de dos a cuatro semanas. Cuando las células se hayan expandido, recoja una vez 10 a la sexta células para determinar los fenotipos de las líneas celulares. Centrifugarlas a 240 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente para precipitar las células NKNT.Después de eso, deseche el sobrenadante, lave la precipitación agregando siete mililitros de PBS. Centrifugar durante cinco minutos a 240 g de tiempo a temperatura ambiente. Repita el procedimiento una vez más, luego agregue 200 microlitros de suero humano a cada tubo, mezcle bien e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente Centrifugar las células a 240 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células a una vez, de 10 a la sexta células por mililitro con PBSA frío. Posteriormente, divida las células en cinco tubos, cada uno de los cuales contiene dos veces 10 por la quinta células. Después de eso, centrifugar las células a 240 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con tampón PBSA o PBSA que contenga 10 microlitros de PE y 10 microlitros de anticuerpos marcados con FITC para teñir los receptores celulares de células T o NK en hielo.Las células suspendidas con tampón PBSA se utilizan como control negativo. A continuación, incube las células con anticuerpos durante 20 a 30 minutos en hielo en la oscuridad. Lave las células dos veces con PBSA frío y vuelva a suspender las células con 300 microlitros de PBSA frío antes del análisis con el citómetro de flujo.Cuando se complete el análisis del fenotipo celular, retire con cuidado la mitad del sobrenadante y evite tocar las células en la parte inferior de la placa. Agregue el mismo volumen de medio de cultivo fresco que contenga rhIL-2 a 300 unidades por mililitro a las placas, luego cambie la mitad del medio cada tres días hasta que los grupos de células sean claramente visibles bajo el microscopio. Después de eso, transfiera las células de las placas de 24 pocillos a los matraces de cultivo T-25 después de mezclar diferentes pocillos del mismo linaje.Duplique el volumen del medio de cultivo a medida que se vuelve amarillo hasta que el volumen del medio se expanda a 10 a 15 mililitros. A continuación, agréguele rhIL-2 con una concentración de 150 unidades por mililitro. Cambie el medio 24 horas antes de congelar después de dos o tres semanas de crecimiento, cuando la masa celular se puede observar a simple vista.Mida la concentración de células con el contador de células. A continuación, centrifugar la suspensión celular durante cinco minutos a 240 veces g y volver a suspender el pellet celular a una densidad de cinco a 10 veces 10 veces 10 a la sexta células por mililitro con la solución madre congelada que contiene un 90% de suero fetal bovino y un 10% de DMSO. Congélelo a una velocidad de un grado Celsius por minuto a menos 80 grados Celsius y luego transfiéralo directamente al nitrógeno líquido.Después de tres días de cultivo durante el establecimiento de líneas celulares, comienzan a aparecer las células polimórficas. Después de siete días, las células crecen rápidamente, ya que tanto el número como la viabilidad de las células aumentaron a un ritmo elevado. Pequeños grupos de células son claramente visibles después de 10 a 14 días de crecimiento, cuando la concentración de células supera de tres a seis veces 10 a la sexta.En este período, las células deben expandirse por división en dos o tres pocillos de la placa de cultivo. Aproximadamente un mes después, una vez que el número de células llega de tres a cinco veces 10 a la séptima, el recuento es lo suficientemente alto como para la preservación. Otra cuestión importante es determinar los fenotipos después de que las células se hayan cultivado con éxito.Nuestros resultados indican que las células T y NK pueden cultivarse mediante el método descrito anteriormente y se pueden establecer líneas celulares con esta técnica, ya que las células crecieron más de tres meses en buenas condiciones. Este método, esta técnica, se puede hacer aún más. Es fácil de realizar correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la variabilidad de PBMC. Para este procedimiento, cualquiera de los dos métodos, como el kit de ensayo MTT 8, se puede realizar para responder preguntas adicionales como la toxicidad de las líneas de células NK o T que pueden usarse para la inmunoterapia adoptiva. Después de cada desarrollo, estas técnicas allanan el camino para que los investigadores en el campo de CAEBV exploren los mecanismos de NK/T asociados al VEB que involucran enfermedades operativas en el sistema modelo celular.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer y expandir las líneas de células NK y T siguiendo este protocolo. No olvide que trabajar con un patógeno puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones al realizar este procedimiento.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un protocolo de forma rápida, sencilla y rentable para la generación de donantes de origen multivirus CTL específicos (RCTL) para la perfusión del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas de trasplante (HSCT) con riesgo de desarrollar infecciones por CMV, EBV o Adv. Este proceso de fabricación es conforme a las GMP y debe garantizar la aplicación más amplia de células T inmunoterapia más allá de los centros especializados.

Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

Se describe un método para generar líneas de células transformadas B con virus Epstein-Barr. También ilustra un ensayo de novela que pueda identificar a las células B destinada a sufrir una transformación tan pronto como tres días después de la infección.

Establecimiento de Epstein-Barr transformado al crecimiento líneas celulares linfoblastoides

Aquí se describe la primera práctica de fabricación (GMP)-cumple método de producción de virus específicos de los linfocitos T citotóxicos (CTL) de la sangre del cordón umbilical, una fuente de células T predominantemente ingenuo.

La expansión de los linfocitos T citotóxicos sangre del cordón umbilical que Citomegalovirus Target, Virus de Epstein-Barr, adenovirus y

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

Sarcoma de Kaposi (KS) es un tumor inducido por infección con el virus oncogénico herpesvirus-8/KS el herpesvirus humano (HHV-8/KSHV). El modelo de cultura de célula endotelial descrito aquí está especialmente preparado para el estudio de los mecanismos por los cuales KSHV transforma las células del huésped.

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Aquí, presentamos un método para expandir el asesino natural de sangre periférica (PBNK), las células NK de los tejidos hepáticos y las células NK del receptor de antígeno quimérico (CAR) derivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o sangre del cordón umbilical (CB). Este protocolo demuestra la expansión de las células NK y CAR-NK utilizando células alimentadoras 221-mIL-21, además de la pureza optimizada de las células NK expandidas.

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Separación de subpoblaciones de células inmunitarias en muestras de sangre periférica de niños con mononucleosis infecciosa

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Aprenda a establecer líneas celulares NK y T de pacientes con infección crónica activa por Virus Epstein-Barr utilizando sangre periférica y dosis baja de IL-2. Este método eficiente facilita la investigación inmunológica.

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