Un método eficiente y Simple para establecer líneas de células T de pacientes con infección crónica activa Virus Epstein - Barr y NK

El objetivo general de este procedimiento es obtener líneas de células NK o T de pacientes con CAEBV, lo que tiene una gran importancia para la investigación sobre esta enfermedad mortal. Este método ayuda a obtener líneas de células NK o T para la investigación del mecanismo del CAEBV, como el estudio del VBV bruto en la proliferación celular, el cribado de inhibidores que interfieren en la proliferación de células NK/T. La principal ventaja de esta técnica es que es muy sencilla y eficaz, ya que requiere solo una pequeña cantidad de sangre periférica y una dosis baja de hierro dos para establecer líneas de células NK o T de pacientes con CAEBV.

Por lo general, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades, porque la supervivencia celular en la primera de las dos semanas del cultivo es incierta y este método le mostrará cómo determinar la proliferación celular del cultivo temprano. Cuando tuvimos la idea de este método, descubrimos que el hierro sérico humano puede incluir PBMC hasta por dos semanas. Mostramos que la demostración de este método es crítica, ya que muestra la forma de las células y la causa de la proliferación.

Y que la extensión de las células y la numeración de las células de la barra Y Para comenzar este procedimiento, purifique PBMC primario de dos mililitros de sangre total de pacientes con CAEBV mediante centrifugación en gradiente. Alternativamente, descongele PBMC criopreservado a partir de nitrógeno líquido con medio RPMI-1640. A continuación, agregue dos microlitros de azul de tripano al 0,4% a 18 microlitros de suspensión celular para teñir las células durante tres minutos, luego transfiera la suspensión a la placa del contador celular y mida la concentración y viabilidad de las células con un contador celular automatizado.

Prepare la suspensión celular a una densidad de dos a tres veces 10 a la sexta células por mililitro, suplementada con un medio de cultivo completo RPMI-1640 que contenga 20% de suero humano, dos milimolares de L-glutamina y antibióticos. Después de eso, siembre un mililitro de suspensión de PBMC por pocillo en las placas de cultivo celular de 24 pocillos. A continuación, agregue 150 unidades por mililitro rhIL-2 a cada pocillo.

Coloque las placas de cultivo en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. En el segundo día, observe la morfología de la célula bajo un microscopio con un aumento de 200 veces. Las celdas están en buenas condiciones cuando son brillantes y redondas.

En este paso, agregue dos microlitros de azul de tripano al 0,4% a 18 microlitros de suspensión celular y calcule la concentración de las células. A continuación, observe la morfología de la célula y controle el estado del crecimiento celular numerando las células antes de cambiar de medio. Es importante controlar la morfología de la célula y su estado.

Podemos juzgar si las células sobreviven por las células polimórficas y la condición de las células en la etapa temprana de un cultivo. Después, retire 500 microlitros del medio de cada pocillo de la placa de 24 pocillos y agréguele 500 microlitros de medio de cultivo completo fresco. Luego agregue 150 unidades por mililitro rhIL-2 a cada pocillo.

Cambie el medio dos veces por semana. Traza la curva de crecimiento de la célula. Cuando la concentración de células viables supere cinco veces 10 a la sexta células por mililitro, divida las células en nuevos pocillos a una concentración de una a dos veces 10 a la sexta células por mililitro en cada pocillo.

Este proceso tarda de dos a cuatro semanas. Cuando las células se hayan expandido, recoja una vez 10 a la sexta células para determinar los fenotipos de las líneas celulares. Centrifugarlas a 240 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente para precipitar las células NKNT.

Después de eso, deseche el sobrenadante, lave la precipitación agregando siete mililitros de PBS. Centrifugar durante cinco minutos a 240 g de tiempo a temperatura ambiente. Repita el procedimiento una vez más, luego agregue 200 microlitros de suero humano a cada tubo, mezcle bien e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente Centrifugar las células a 240 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células a una vez, de 10 a la sexta células por mililitro con PBSA frío. Posteriormente, divida las células en cinco tubos, cada uno de los cuales contiene dos veces 10 por la quinta células. Después de eso, centrifugar las células a 240 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con tampón PBSA o PBSA que contenga 10 microlitros de PE y 10 microlitros de anticuerpos marcados con FITC para teñir los receptores celulares de células T o NK en hielo.

Las células suspendidas con tampón PBSA se utilizan como control negativo. A continuación, incube las células con anticuerpos durante 20 a 30 minutos en hielo en la oscuridad. Lave las células dos veces con PBSA frío y vuelva a suspender las células con 300 microlitros de PBSA frío antes del análisis con el citómetro de flujo.

Cuando se complete el análisis del fenotipo celular, retire con cuidado la mitad del sobrenadante y evite tocar las células en la parte inferior de la placa. Agregue el mismo volumen de medio de cultivo fresco que contenga rhIL-2 a 300 unidades por mililitro a las placas, luego cambie la mitad del medio cada tres días hasta que los grupos de células sean claramente visibles bajo el microscopio. Después de eso, transfiera las células de las placas de 24 pocillos a los matraces de cultivo T-25 después de mezclar diferentes pocillos del mismo linaje.

Duplique el volumen del medio de cultivo a medida que se vuelve amarillo hasta que el volumen del medio se expanda a 10 a 15 mililitros. A continuación, agréguele rhIL-2 con una concentración de 150 unidades por mililitro. Cambie el medio 24 horas antes de congelar después de dos o tres semanas de crecimiento, cuando la masa celular se puede observar a simple vista.

Mida la concentración de células con el contador de células. A continuación, centrifugar la suspensión celular durante cinco minutos a 240 veces g y volver a suspender el pellet celular a una densidad de cinco a 10 veces 10 veces 10 a la sexta células por mililitro con la solución madre congelada que contiene un 90% de suero fetal bovino y un 10% de DMSO. Congélelo a una velocidad de un grado Celsius por minuto a menos 80 grados Celsius y luego transfiéralo directamente al nitrógeno líquido.

Después de tres días de cultivo durante el establecimiento de líneas celulares, comienzan a aparecer las células polimórficas. Después de siete días, las células crecen rápidamente, ya que tanto el número como la viabilidad de las células aumentaron a un ritmo elevado. Pequeños grupos de células son claramente visibles después de 10 a 14 días de crecimiento, cuando la concentración de células supera de tres a seis veces 10 a la sexta.

En este período, las células deben expandirse por división en dos o tres pocillos de la placa de cultivo. Aproximadamente un mes después, una vez que el número de células llega de tres a cinco veces 10 a la séptima, el recuento es lo suficientemente alto como para la preservación. Otra cuestión importante es determinar los fenotipos después de que las células se hayan cultivado con éxito.

Nuestros resultados indican que las células T y NK pueden cultivarse mediante el método descrito anteriormente y se pueden establecer líneas celulares con esta técnica, ya que las células crecieron más de tres meses en buenas condiciones. Este método, esta técnica, se puede hacer aún más. Es fácil de realizar correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la variabilidad de PBMC. Para este procedimiento, cualquiera de los dos métodos, como el kit de ensayo MTT 8, se puede realizar para responder preguntas adicionales como la toxicidad de las líneas de células NK o T que pueden usarse para la inmunoterapia adoptiva. Después de cada desarrollo, estas técnicas allanan el camino para que los investigadores en el campo de CAEBV exploren los mecanismos de NK/T asociados al VEB que involucran enfermedades operativas en el sistema modelo celular.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer y expandir las líneas de células NK y T siguiendo este protocolo. No olvide que trabajar con un patógeno puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones al realizar este procedimiento.