Un protocolo para Decellularizing ratón cócleas para ingeniería de tejidos del oído interno
January 1st, 2018
El objetivo de este protocolo es un método eficaz para decellularize y descalcificar cócleas de ratón para utilización como andamios para aplicaciones de ingeniería de tejidos.
El objetivo general de este procedimiento es demostrar un método eficaz para descelularizar y descalcificar las cócleas de ratón para utilizar un andamio para aplicaciones de ingeniería de tejidos del oído interno. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la audición y la ingeniería de tejidos, como por ejemplo, ¿cómo influyen la cóclea 3D y los diversos componentes de la matriz extracelular en la diferenciación de las células madre? La principal ventaja de esta técnica es que permite al investigador estudiar cómo las células interactúan directamente con la matriz extracelular de la cóclea para formar un epitelio sensorial.
La demostración visual de este método es fundamental, ya que el aislamiento del hueso temporal y el aparato de profusión celular pueden ser difíciles de visualizar correctamente basándose únicamente en descripciones de texto. Para comenzar este procedimiento, corte en dos el cráneo en el plano sagital medio con un par de tijeras quirúrgicas afiladas. A continuación, extraiga el tejido cerebral del cráneo.
A continuación, identifique el hueso temporal a través de la presencia de las raíces nerviosas auditivas y vestibulares en el interior del cráneo y el canal auditivo desde el exterior. Corta cuidadosamente el cráneo para aislar el hueso temporal del resto del cráneo. Después, inserte las pinzas finas en la abertura del canal auditivo aproximadamente cinco milímetros para que las puntas no corran el riesgo de perforar la cóclea.
Rompe suavemente el hueso de la bola para que se fracture. Con pinzas finas, saque el resto de la bola del hueso temporal exponiendo el laberinto óseo de la cóclea. Posteriormente, sumerja el hueso temporal en PBS con las ventanas ovaladas y redondas de la cóclea hacia arriba.
Con un par de pinzas ultrafinas, retire la arteria estapedial que pasa a través del estribo. A continuación, introduzca una punta de las pinzas ultrafinas a través del arco del estribo por donde pasa la arteria y levante delicadamente el estribo hacia arriba. A continuación, perfore las ventanas ovaladas y redondas.
Luego, coloque el tubo que está conectado a una jeringa de calibre 28.5 llena de PBS sobre la ventana ovalada. Profundar dos milímetros de 10%Antibiótico-Atimicótico y 10%Penicilina-Estreptomicina en PBS a través de la cóclea durante cinco minutos para eliminar la perilinfa. A continuación, retire y deseche los restos de tejido muscular y huesos fragmentos.
Para la descelularización, con la pipeta de transferencia, introduzca suavemente la cóclea en la pipeta para que solo pase el borde cortado unos milímetros. A continuación, expulse la cóclea en el vial de centelleo lleno de solución al 1 % de SDS. Haga circular dos mililitros de SDS al 1 % en agua desionizada a través de la cóclea en el vial de centelleo utilizando una pipeta de transferencia.
Coloque el vial de centelleo en un rotor y déjelo girar a 10 RPM durante 72 horas a temperatura ambiente. Reemplácela con una solución nueva de SDS al 1% cada 24 horas durante un período de 72 horas y tenga cuidado de no exponer la cóclea al aire durante el reemplazo de la solución. Después de eso, lave la cóclea tres veces en el mismo vial de centelleo durante 30 minutos cada una con agua desionizada.
En esta etapa, la cóclea debe ser descelularizada. Para la descalcificación, retire el agua desionizada restante del vial de centelleo dejando solo lo suficiente para mantener la cóclea sumergida. Para comenzar la descalcificación, agregue cinco mililitros de agua con EDTA y desionizada al 10% de EDTA al vial de centelleo que contiene la cóclea.
Haga circular dos mililitros de EDTA al 10% en agua desionizada a través de la cóclea en el vial de centelleo utilizando una pipeta de transferencia. Vuelva a colocar el vial de centelleo en el rotador y deje que el vial de centelleo gire a 10 RPM durante 72 horas a temperatura ambiente. Cambie la solución de EDTA al 10% cada 24 horas durante un período de 72 horas.
Tenga cuidado al cambiar de solución para que la cóclea no quede expuesta al aire. A continuación, enjuague la cóclea tres veces durante dos horas cada una con PBS. En esta etapa, la cóclea debe estar descalcificada.
Antes de infundir células, comience incubando la cóclea descelularizada y descalcificada en una incubadora de cultivo celular al 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante un mínimo de una hora. Para profusar las cócleas, agregue una gota de MSCGM a cada cóclea para evitar que la cóclea se seque. Transfiéralos a una nueva placa de 24 pocillos con una pipeta de transferencia.
Oriente delicadamente la cóclea con pinzas ultrafinas de modo que las ventanas ovaladas y redondas queden hacia arriba. A continuación, utilizando una jeringa estéril de insulina de calibre 28,5 con tubo conectado, extraiga 0,2 mililitros de gelatina de Human Wharton resuspendidas. Posteriormente, coloque el tubo sobre la ventana ovalada con pinzas finas esterilizadas.
Profundar delicada y lentamente la cóclea con 0,2 mililitros de gelatina de Wharton humano resuspendida durante cinco minutos. Este paso de profusión es importante. La profusión exitosa de líquidos a través de la cóclea tiene un gran impacto en el resultado de este protocolo.
Después de la profusión, agregue 0,8 mililitros de MSCGM precalentado a 37 grados Celsius al pocillo que contiene la cóclea para llevar el volumen total a un mililitro. Repita el procedimiento para cada cóclea. Usar una jeringa y un tubo nuevos cada vez.
Coloque la cóclea profusa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados Celsius y cambie el medio tres veces por semana. Aquí se muestra la descelularización y descalcificación exitosas de una cóclea de ratón sin ninguna célula inyectada. En general, la anatomía de la cóclea se conserva con huecos sin manchas manchadas.
Estos son los resultados representativos del cultivo exitoso de células gelatinosas de Human Wharton en un andamio de cóclea. Se observan abundantes manchas de color dappy en toda la cóclea y en la superficie ósea externa. Un examen más detallado de las vueltas individuales revela que las estructuras finas de la cóclea se conservan después de la descelularización y la descalcificación y que las células inyectadas están unidas o interactuando con la matriz extracelular de la cóclea nativa.
También se investigó la descelularización en cultivos celulares posteriores mediante tinción con H&E. La cóclea descelularizada no contenía ninguna de las células de la cóclea nativa, pero conserva la mayor parte de la anatomía del órgano de Corti porque la matriz extracelular permanece. Inyectado en células cultivadas se puede observar a través del órgano de Corti, interactuando con la matriz extracelular descelularizada.
Una vez dominada, la profusión de células en una cóclea descelularizada puede tardar aproximadamente de 10 a 15 minutos si la cóclea ya está preparada y las herramientas necesarias están dispuestas adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante manipular la cóclea con cuidado, ya que es frágil. También es importante evitar la introducción de aire en la cóclea, ya que las burbujas bloquearán el flujo de líquidos durante las profusiones.
Este procedimiento general se puede aplicar a cócleas de otras especies y también se puede inyectar una amplia gama de tipos de células. Es probable que los tiempos específicos de descelularización y descalcificación varíen, pero los conceptos subyacentes seguirán siendo los mismos. El Dr. Peter Santi de la Universidad de Minnesota desarrolló inicialmente la técnica de descelularización que modificamos para este protocolo.
Esperamos que nuestra técnica y el cultivo celular en andamio de cóclea estén disponibles para otros ingenieros de tejidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar, descelularizar y descalcificar con éxito los huesos temporales antes de inyectar células para su uso en experimentos de cultivo.
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Descripción general
Este protocolo demuestra un método eficaz para descelular y descalcificar cócleas de ratón para su uso como andamios en aplicaciones de ingeniería de tejidos. La técnica permite a los investigadores estudiar la interacción entre las células y la matriz extracelular de la cóclea, lo cual es crucial para comprender la formación del epitelio sensorial.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Ingeniería de Tejidos
- Investigación Auditiva
- Interacciones Celulares
Antecedentes
- La descelularización y descalcificación son esenciales para crear andamios.
- Comprender la estructura de la cóclea es vital para la investigación del oído interno.
- La diferenciación de células madre está influenciada por la matriz extracelular.
- Los métodos visuales mejoran la comprensión de los procedimientos complejos.
Propósito del estudio
- Proporcionar un método fiable para la preparación de andamios de cóclea.
- Facilitar la investigación sobre las interacciones celulares de la cóclea.
- Avanzar en el conocimiento en los campos de la ingeniería auditiva y de tejidos.
Métodos utilizados
- Aislamiento del hueso temporal del cráneo.
- Descelularización de las cócleas.
- Proceso de descalcificación para la preparación del andamio.
- Demostración visual del procedimiento para mayor claridad.
Resultados principales
- Descelularización y descalcificación exitosas de las cócleas de ratón.
- Mayor comprensión de las interacciones célula-matriz extracelular.
- Métodos mejorados para estudiar la formación del epitelio sensorial.
- Las ayudas visuales mejoran significativamente la comprensión del procedimiento.
Conclusiones
- Este método proporciona una herramienta valiosa para la investigación del oído interno.
- Abre vías para estudiar el comportamiento de las células madre en los andamios de la cóclea.
- Las demostraciones visuales son cruciales para los procedimientos biológicos complejos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to generate physiologically relevant cochlear scaffolds for studying stem cell interactions with native extracellular matrix, supporting target validation in auditory regenerative medicine. By preserving extracellular matrix architecture while removing cellular components, the method provides a defined system to de-risk mechanistic hypotheses about matrix-mediated cell behavior in inner ear tissue engineering. The approach supports preclinical model development for hearing loss therapeutics by allowing controlled evaluation of cell-scaffold dynamics in a 3D disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding extracellular matrix influence on stem cell differentiation and sensory epithelium formation.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets by isolating matrix-specific effects from cellular variables in a controlled scaffold system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, reproducible biological systems for quantitative assessment of cell invasion, proliferation, and matrix interaction.
- Operational Value: Supports assay scalability and platform reuse through consistent decellularization and decalcification outputs across multiple cochleae.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes disease-relevant system continuity from discovery through preclinical validation by maintaining native cochlear architecture.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by enabling longitudinal observation of cell-scaffold interactions over 30-day culture periods.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing extracellular matrix scaffolds post-isolation, enabling hypothesis testing in lead identification stages before preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking by allowing direct study of cell-extracellular matrix interactions without confounding cellular debris.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized scaffold preparation that preserves structural integrity for reliable compound or cell evaluation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via cell invasion depth, proliferation rates, and matrix interaction patterns observable through staining and imaging.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining organ of Corti structure, enabling extrapolation to in vivo-like environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable scaffold platform applicable across cell types and species, reducing redundant isolation efforts in auditory tissue engineering programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in extracellular matrix-mediated cell behavior.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined decellularization (72-hour SDS rotation) and decalcification (72-hour EDTA rotation) protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling early assessment of matrix-dependent cell responses, reducing late-stage biological risk in auditory regenerative programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of stem cell or matrix-modulating candidates based on scaffold-based functional readouts.
Implementation Considerations
- Required expertise in microsurgical temporal bone isolation and sterile cell perfusion techniques.
- Instrumentation needs include ultra-fine forceps, transfer pipets, rotators, and sterile syringe perfusion systems.
- Cross-team standardization requires adherence to solution exchange schedules and air-exposure avoidance during decellularization/decaltification.
- Adaptation considerations include species-specific timing adjustments and validation of scaffold integrity for alternative cell types beyond Wharton's jelly-derived MSCs.
- Practical limitations include cochlear fragility necessitating careful handling to prevent structural damage during isolation and perfusion.
