Name: Un protocolo para Decellularizing ratón cócleas para ingeniería de tejidos del oído interno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprenda a descelularizar cócleas de ratón para ingeniería de tejidos del oído interno. Este método permite estudiar la interacción celular con la matriz extracelular y avanzar en investigación auditiva.

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El proyecto fue financiado por la Universidad de Kansas Prueba de concepto de fondo. Nos gustaría agradecer al personal de enfermería en el KUMC (Kansas City, KS) para asistirnos en la obtención de cordones umbilicales humanos y David Jorgensen para ayudar con las culturas de cócleas.

Se realizaron todos los procedimientos, incluyendo la eutanasia animal, según el (ACUP #2014-2234) protocolo aprobado institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en la Universidad de Kansas Medical Center (KUMC).
Nota: HWJCs fueron aislados de humanos los cordones umbilicales que fueron donados por los pacientes que el consentimiento informado y se utilizaron muestras según los protocolos aprobados por el Comité de temas humanos de Universidad de Kansas (KU-IRB #15402).
1. hueso Temporal cosecha y aislamiento de la cóclea
<ol>
	<li>Decapitar un ratón apropiadamente eutanasia, 15 semanas de edad por el corte entre el cráneo y primera vértebra cervical con un fuerte par de tijeras quirúrgicas, luego rocíe abajo de la cabeza con etanol al 70% para desinfectar (figura 1A).</li>
	<li>Atraviesan el cráneo en un plano sagital, utilizando el mismo par de afilado de tijeras quirúrgicas (figura 1B-C, las líneas punteadas).</li>
	<li>Retire el tejido cerebral del cráneo con un par de fórceps (figura 1, flecha).</li>
	<li>Identificar el hueso temporal a través de la presencia del auditorio y las raíces del nervio vestibular (Figura 1E-F, puntas de flecha) en el interior del cráneo y el conducto auditivo externo desde el exterior (Figura 1F, flecha). Corte cuidadosamente a través del cráneo para aislar el hueso temporal del resto del cráneo (figura 1). Nota: En algunos casos, puede ser posible para delicadamente los huesos circundantes del cráneo del hueso temporal sin necesidad de corte.</li>
	<li>Inserte el fórceps fino en la abertura del conducto auditivo aproximadamente 5 mm (figura 1 H), por lo que las puntas no hay riesgo de punción de la cóclea. Con cuidado romper el hueso de la ampolla (figura 1 H, área sombreada roja superior) para fracturas (figura 1I, rojo punteado de línea). Nota: Si es necesario, un microscopio de disección puede ayudar en este proceso para asegurar la exacta ubicación y manipulación de instrumentos.</li>
	<li>Con unas pinzas finas, haga palanca, el resto de la ampolla del hueso temporal, exponiendo el laberinto óseo de la cóclea (Figura 1J, soportes de rojo).</li>
	<li>Colocar una placa de Petri lo suficientemente grande como para sostener el hueso temporal (por ejemplo, 30 mm o mayor) por debajo de la disección alcance campo de visión y llenarlo con suficiente fosfato tampón salino (PBS) para cubrir el hueso temporal (p. ej., 0,5 a 1 mL).</li>
	<li>Sumergir el hueso temporal con la bulla en el PBS con las ventanas redondeos y ovales de la cóclea hacia arriba. Nota: El retiro del sistema vestibular de la cóclea no es necesario, como el sistema vestibular sirve bien como un mango para manipular y orientar las funciones de la cóclea (figura 1I y figura 2B).</li>
	<li>Con un ultra fino par de pinzas, quite la arteria stapedial, que pasa a través del estribo.</li>
	<li>Inserte una punta de las pinzas ultra finas por el arco del estribo donde la arteria pasa a través y delicadamente Levante el estribo. El estribo desarticulado debe levantar fuera de la ventana oval.</li>
	<li>Usando una punta de las pinzas ultra finas, el óvalo de la puntura y alrededor de windows.</li>
	<li>Usando un PBS 1 x relleno 28,5 calibre jeringa con un tubo (diámetro interno 0,28 mm, diámetro externo mm 0,61) Unido, coloque el tubo sobre la ventana oval (figura 2A -B). Nota: La apertura del tubo puede ser manipulada usando fórceps ultra fina, ayudando a garantizar una colocación exacta.<ol>
		<li>Utilice una nueva jeringa y tubo para cada cóclea.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfusión 2 mL de antibiótico-antimicótico (anti-anti) 10% y 10% penicilina-estreptomicina (pen-strep) en PBS a través de la cóclea más 5 minutos para quitar la perilinfa. Inunda demasiado rápido con demasiada presión puede dañar las estructuras finas dentro de la cóclea. Nota: Conducción manualmente de la jeringa con la mano para inundar el líquido a través de la cóclea es eficaz, aunque una bomba de perfusión podría utilizarse como alternativa.<ol>
		<li>Si inunda manualmente, utilice un par de multa, cierre pinza estabilizar la cóclea (figura 2A) durante la perfusión agarrando la porción vestibular del hueso temporal. Nota: Aunque no es necesario, esto deja ambas manos libres manejar los instrumentos; una mano puede conducir a la jeringa (figura 2A) mientras que el otro puede colocar el tubo correctamente (figura 2B).</li>
		<li>De este paso adelante, tenga cuidado para evitar exponer la cóclea innecesariamente al aire. Introducir burbujas de aire en los espacios líquidos bloqueará la circulación del líquido, y secar más dañará las bellas estructuras dentro de la cóclea.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Retire y deseche cualquier restantes fragmentos de tejido y hueso músculo con unas pinzas finas.</li>
	<li>Si es necesario, almacenar cócleas aislados a 4 ° C en anti-anti 10% y 10% solución de pen-strep en PBS durante siete días con cambios regulares de solución de antibiótico cada 48 h.</li>
</ol>
2. coclear procesamiento
<ol>
	<li>Descelularización
	<ol>
		<li>Para cada cóclea, llenar una cubeta de centelleo de vidrio de 20 mL con un 1% sodio dodecil sulfato en solución (SDS) en agua desionizada de (DI), que se utiliza para decellularize la cóclea.</li>
		<li>Cortar la punta de una plástico 7 mL pipeta usando una cuchilla de afeitar para que la abertura es suficientemente grande para que una cóclea pasar a través.</li>
		<li>Usando la pipeta de transferencia, suavemente elaborar la cóclea con la pipeta por lo que sólo pasa el borde de corte por unos milímetros.</li>
		<li>Expulsar a la cóclea en el vial de centelleo lleno de solución 1% SDS.</li>
		<li>Circular 2 mL de SDS 1% en agua desionizada (DI) a través de la cóclea en el vial de centelleo con una pipeta de transferencia.</li>
		<li>Coloque el frasco centelleo en un rotor y deje que el frasco centelleo girar a 10 rpm durante 72 h a temperatura ambiente.<ol>
			<li>Cambiar solución SDS al 1% cada 24 h durante un periodo de 72 h. Tenga cuidado cuando cambie de SDS para nunca exponer la cóclea al aire.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Lave la cóclea tres tiempos de 30 min con agua desionizada.</li></ol></li></ol>Realizar los lavados en el mismo vial de centelleo usado para los cargos de SDS; en esta etapa, la cóclea es decellularized.
	
	
	<li>Descalcificación
	<ol>
		<li>Quite el agua restante de la DI desde el vial de centelleo, dejando sólo lo suficiente para mantener la cóclea sumergido.</li>
		<li>Para empezar la descalcificación, añadir 5 mL de 10% de ácido etilendiaminotetracético (EDTA) (0.02 M) en agua desionizada para el vial de centelleo con la cóclea.</li>
		<li>Circular 2 mL de EDTA de 10% en agua desionizada a través de la cóclea en el vial de centelleo con una pipeta de transferencia.</li>
		<li>Vuelva a colocar el vial de centelleo en el rotor y deje que el frasco centelleo girar a 10 rpm durante 72 h a temperatura ambiente. Cambiar la solución de EDTA de 10% cada 24 h durante un periodo de 72 h. Tenga cuidado cuando cambie las soluciones para que la cóclea no está expuesta al aire.</li>
		<li>Enjuague la cóclea 3 veces durante 2 h cada uno con PBS 1 x; en esta etapa, la cóclea es descalcificada.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Almacenamiento de información
	<ol>
		<li>Almacenar las cócleas hasta 72 h en una solución 10% anti-anti, 10% pen-strep en PBS a 4 ° C. Nota: Períodos más largos de almacenamiento pueden ser posibles con cambios regulares de solución de antibiótico; sin embargo, almacenaje extendido de cócleas procesados no ha sido validado en el presente Protocolo.</li>
	</ol>
	</li>

3. adquisición y ampliación de hWJCs
<ol>
	<li>HWJCs aislante según protocolos previamente publicados22. Brevemente, segmento de cordón umbilical en secciones de 3 cm.</li>
	<li>Cuidadosamente hacer una incisión superficial con un bisturí a lo largo de cada segmento de cordón umbilical para desenrollar y exponer la gelatina de Wharton del cordón umbilical. Use pinzas para sacar los vasos sanguíneos.</li>
	<li>Lave los segmentos cordón umbilical dos veces con suficiente PBS (p. ej., 40 mL en una placa de Petri de 60 mm) para sumergir el tejido. Pique finamente segmentos de tejido con un bisturí. Digerir el tejido en una placa de Petri con 50 mL de medio de digestión de 100 mm (colagenasa tipo 2 de 0.2%, 1% de penicilina-estreptomicina, baja glucosa en medio (DMEM modificado Eagle de Dulbecco)).</li>
	<li>Coloque el tejido en digerir medio en un agitador orbital a 50 rpm durante la noche en un 5% CO2, incubadora de 37 ° C. Al día siguiente, diluya medio de digestión en una proporción de 1:16 en el 2% antibiótico-antimicótico en PBS y de la pelotilla de las células por centrifugación a 500 x g a temperatura ambiente (~ 27 ° C) por 10 minutos descartar sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el pellet en células madre mesenquimales crecimiento medio (MSCGM) y combinar celdas. Las células de la placa a una densidad de 7 x 103 células/cm2 en cultivo de tejidos tratan frascos de T-75. HWJCs en MSCGM de la cultura y ampliar al paso 5 para experimentos. Nota: HWJCs puede cultivarse el en T-frascos más grandes (e.g., T-150, T-300) cuando pases para aumentar la producción de hWJCs para los experimentos.</li>
</ol>
4. infusión de hWJCs en cócleas Decellularized
<ol>
	<li>Preparar cócleas decellularized
	<ol>
		<li>Utilizando una técnica aséptica, lavar cócleas almacenados en PBS 1 x tres veces para 30 minutos.</li>
		<li>Transferencia de cócleas en pocillos distintos de una placa de 24 pocillos y agregar 1 mL de 37 º C previamente calentado MSCGM.</li>
		<li>Incubar cócleas en un 5% CO2, incubadora de cultura celular de 37 ° C durante un mínimo de 1 h antes de la infusión de células.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Se disocian hWJCs y resuspender
	<ol>
		<li>HWJCs de lavado con 37 º C previamente había calentado 1 x PBS dos veces.</li>
		<li>Añadir suficiente 37 º C previamente calentado tripsina con EDTA 0.5% para cubrir la superficie de la célula recipiente.</li>
		<li>Incubar hWJCs para hasta 5 min en un 5% CO2, incubadora de 37 ° C de la célula cultura.<ol>
			<li>Verificar que el 90% de las células han separado de la superficie de cultivo celular mediante la visualización de las células bajo un microscopio invertido. Nota: Las células que se mueven cuando la nave de cultura es golpeada suavemente, han destacado. Las células que permanecen inmóviles, no han separado.</li>
			<li>Golpee ligeramente los lados del frasco para desalojar más células adjuntas.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Utilizando una técnica aséptica, transferencia hWJCs del recipiente de cultivo a un tubo cónico de 50 mL que contiene un volumen equivalente de MSCGM en el volumen de la tripsina se utiliza para disociar las células.</li>
		<li>El hWJCs de pellets por centrifugación a 500 x g a temperatura ambiente (~ 27 ° C) durante 5 minutos.</li>
		<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender el hWJCs en MSCGM en una concentración de 500.000 células/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfusión de cócleas
	<ol>
		<li>Cócleas de transferencia a una nueva placa de 24 pocillos usando una pipeta de transferencia.</li>
		<li>Añadir una gota de MSCGM a cada cóclea para prevenir cualquier cóclea de la desecación.</li>
		<li>Oriente con delicadeza la cóclea usando fórceps ultra fina para que las ventanas ovales y redondeos son hacia arriba. Nota: Tenga mucho cuidado al manipular directamente cada cóclea como la cóclea se daña fácilmente.</li>
		<li>Utilizando una jeringa de insulina estéril de calibre 28,5 con tubería conectada, elaborar hWJCs 0,2 mL suspendida (100.000 células).</li>
		<li>Con unas pinzas finas esterilizadas, posición de la tubería sobre la ventana oval.</li>
		<li>Con delicadeza y lentamente perfusión la cóclea con 0.2 mL de hWJCs resuspendido utilizando una jeringa de insulina de 28,5 calibre conectada a la tubería de polietileno (diámetro externo: 0,61 mm, diámetro interior: mm 0,28) durante aproximadamente 5 minutos.</li>
		<li>Después de la perfusión, agregar 0,8 mL de 37 º C previamente calentado MSCGM a bien que contiene la cóclea para llevar el volumen total en el pozo a 1 mL.</li>
		<li>Repita los pasos 4.3.3-4.3.7 para cada cóclea, utilizando una jeringa nueva y cada vez que la tubería.</li>
		<li>Lugar de cócleas inundadas en un 5% CO2, incubadora de 37 ° C de la célula cultura y cambiar los medios de comunicación tres veces por semana.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. conservación y cosecha cóclea
Nota: Cócleas pueden ser cultivados y cosechan en cualquier momento perfusión posterior de hasta 30 días.
<ol>
	<li>Para conservar cócleas, fijar en paraformaldehído al 4% en PBS 1 x durante la noche a 4 ° C en una plataforma oscilante.</li>
	<li>Después de la fijación, lavado cócleas con PBS 1 x tres veces por 5 minutos cada uno.</li>
	<li>Poco a poco deshidratar cóclea con etanol y claro con un solvente hidrocarburo alifático antes de inclusión en parafina.</li>
	<li>Sección muestras a un grosor de 10 μm utilizando un micrótomo y montar en portaobjetos de vidrio. Nota: Las muestras están ahora listas para histológica o immunohistochemical usando protocolos estándar.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con éxito hemos demostrado que las células cocleares nativas pueden extraerse de la cóclea a través de un proceso de descelularización, que permite el uso de la cóclea como un andamio de tejido intrincado, tridimensional. Santi et al. 15 desarrolló el método inicial para cócleas decellularizing y con precisión se han estimado los volúmenes de muchas estructuras cocleares a través con la ayuda de microscopia de luz hoja23. Estos primeros trabajos sirvieron de base f...

La cóclea es una estructura intrincada espiral encontrada en el hueso temporal. Se compone de un exterior laberinto óseo y laberinto membranoso concéntricos, interior1. El laberinto membranoso consta de tres espacios fluidos: vestibuli de Scala, Scala tympani de Scala1y medios. Los medios del scala alberga el epitelio sensorial, que se compone de una multitud de tipos celulares, pero las células de pelo sensoriales (HC), que transduce la energía mecánica de las ondas sonoras a impulsos nerviosos2, son de particular interés. Exposición a trauma acústico3,4,5, medicamento6, enfermedad7,8y9 de envejecimiento puede resultar en deterioro de la función auditivo por medio de la muerte HC. Pérdida de células ciliadas en los mamíferos es permanente, a diferencia de HCs aviares, que pueden regenerar después de lesión10.
Una variedad de esfuerzos de investigación han intentado restablecer perdidos HCs, aunque varían los enfoques experimentales específicos. Manipulación de expresión génica en el epitelio sensorial y la implantación de células diferenciadas fuera del cuerpo son los enfoques dominantes en el campo, aunque han sido métodos de inducción que buscan diferenciar células madre en organoides coclear trató de11,12,13. Cada uno de estos enfoques es dependiente directamente de las células madre o las claves del desarrollo utilizadas por las células de vástago; sin embargo, un segundo compartido y potencialmente crítico, elemento es el ECM de la cóclea se14,15.
El ECM no sólo proporciona soporte físico para las células y tejidos, que incluye una superficie para la adhesión celular, proliferación, supervivencia y migración, pero también juega un papel crítico en el desarrollo de HCs y la espiral del ganglio15,16 ,17. Naturalmente ECM que ofrece señales inductivas que pueden guiar la determinación de fenotipo celular o de adhesión, proliferación y supervivencia de la célula18. En consecuencia, el uso de la cóclea decellularized en combinación con hWJCs cultivadas ofrecen una oportunidad única para explorar el papel de la regeneración de ECM y HC. HWJCs son un tipo de disponible, no controvertida de la célula aislado de humanos los cordones umbilicales que se comportan como células madre mesenquimales19. HWJCs han demostrado la capacidad de diferenciarse hacia abajo célula neurosensorial linajes20,21. Así, el protocolo actual detalla el aislamiento, la descelularización y perfusión de cócleas de canales de ratón C57BL con hWJCs para ingeniería de tejidos del oído interno.

<table><tbody><tr><td>Centrífuga Allegra X-14R</td><td>Beckman-Coulter</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Tubo semirrígido intramedic</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 2000 Shaler orbital</td><td>Eppendorf</td><td>M1190-0002</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas ultrafinas</td><td>Fine Science Tools</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB087579B</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina U-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td></td></tr><tr><td>Vial de centelleo</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-73</td><td></td></tr><tr><td>Rotador</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-049</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Placa</td> <td>de 24 pocillosFisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost PLUS Portaobjetos de microscopio de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antidecolorante con DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046341</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Series II 3110 Incubadora de CO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de células madre mesenquimales</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-3232</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-75 Matraz de cultivo</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-150 Matraz de cultivo</td><td>MidSci</td><td>TP90151</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-300 Matraz de cultivo</td><td>MidSci</td><td>Microscopio de</td> disección TP90301 <td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido Nikon Eclipse Ts2R-FL</td><td>Nikon Instruments</td><td>MFA51010</td><td></td></tr><tr><td>NuAire Clase II, Tipo A2 Cabina de bioseguridad</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>1% SDS Solución</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143-100G</td><td></td></tr><tr><td>10% EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo para decellularizing ratón cócleas para ingeniería de tejidos del oído interno

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

En los mamíferos, las células de pelo de mechanosensory que facilitan la falta de audiencia la capacidad de regenerar, que ha limitado los tratamientos para la pérdida auditiva. Estrategias actuales de la medicina regenerativa se han centrado en el trasplante de células madre o la manipulación genética de células de apoyo en el oído interno para estimular la sustitución de células dañadas para corregir la pérdida de la audición de alrededor. Sin embargo, la matriz extracelular (ECM) puede jugar un papel vital en inducir y mantener la función de las células de pelo y no ha sido bien investigada. Usando el coclear ECM como un andamio para cultivar células madre adultas puede proporcionar perspectivas únicas en cómo la composición y la arquitectura del entorno extracelular ayuda a las células en el mantenimiento de la función auditiva. Aquí presentamos un método para aislar y decellularizing cócleas de ratones para usar como andamios aceptar perfusión células madre adultas. En el actual protocolo, cócleas son aislados de ratones eutanasia, decellularized y descalcificada. Después, celdas de jalea de Wharton humana (hWJCs) que fueron aisladas de cordón umbilical fueron perfundidas con cuidado en cada cóclea. Las cócleas fueron utilizados como Biorreactores, y las células fueron cultivadas durante 30 días antes de someterse a tratamiento para el análisis. Decellularized cócleas conservan estructuras extracelulares identificables, pero no reveló la presencia de células o notables fragmentos de ADN. Perfundidos en la cóclea las células invadieron la mayor parte del interior y el exterior de la cóclea y crecieron sin incidentes con una duración de 30 días. Así, el método actual que puede utilizarse para estudiar cómo coclear ECM afecta desarrollo de las células y comportamiento.

Utilizando los métodos presentados aquí, éxito descelularización de cócleas se evaluó mediante el examen de la presencia o ausencia de ADN a través de 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción. Cócleas eran considerados totalmente decellularized si ADN no fue identificado dentro de la cóclea decellularized. Una cóclea nativa de un experimento anterior que no experimentaron descelularización o descalcificación se utilizó como control positivo para ilustrar las estructuras y células que...

El objetivo de este protocolo es un método eficaz para decellularize y descalcificar cócleas de ratón para utilización como andamios para aplicaciones de ingeniería de tejidos.

Un protocolo para Decellularizing ratón cócleas para ingeniería de tejidos del oído interno

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un método eficaz para descelularizar y descalcificar las cócleas de ratón para utilizar un andamio para aplicaciones de ingeniería de tejidos del oído interno. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la audición y la ingeniería de tejidos, como por ejemplo, ¿cómo influyen la cóclea 3D y los diversos componentes de la matriz extracelular en la diferenciación de las células madre? La principal ventaja de esta técnica es que permite al investigador estudiar cómo las células interactúan directamente con la matriz extracelular de la cóclea para formar un epitelio sensorial.La demostración visual de este método es fundamental, ya que el aislamiento del hueso temporal y el aparato de profusión celular pueden ser difíciles de visualizar correctamente basándose únicamente en descripciones de texto. Para comenzar este procedimiento, corte en dos el cráneo en el plano sagital medio con un par de tijeras quirúrgicas afiladas. A continuación, extraiga el tejido cerebral del cráneo.A continuación, identifique el hueso temporal a través de la presencia de las raíces nerviosas auditivas y vestibulares en el interior del cráneo y el canal auditivo desde el exterior. Corta cuidadosamente el cráneo para aislar el hueso temporal del resto del cráneo. Después, inserte las pinzas finas en la abertura del canal auditivo aproximadamente cinco milímetros para que las puntas no corran el riesgo de perforar la cóclea.Rompe suavemente el hueso de la bola para que se fracture. Con pinzas finas, saque el resto de la bola del hueso temporal exponiendo el laberinto óseo de la cóclea. Posteriormente, sumerja el hueso temporal en PBS con las ventanas ovaladas y redondas de la cóclea hacia arriba.Con un par de pinzas ultrafinas, retire la arteria estapedial que pasa a través del estribo. A continuación, introduzca una punta de las pinzas ultrafinas a través del arco del estribo por donde pasa la arteria y levante delicadamente el estribo hacia arriba. A continuación, perfore las ventanas ovaladas y redondas.Luego, coloque el tubo que está conectado a una jeringa de calibre 28.5 llena de PBS sobre la ventana ovalada. Profundar dos milímetros de 10%Antibiótico-Atimicótico y 10%Penicilina-Estreptomicina en PBS a través de la cóclea durante cinco minutos para eliminar la perilinfa. A continuación, retire y deseche los restos de tejido muscular y huesos fragmentos.Para la descelularización, con la pipeta de transferencia, introduzca suavemente la cóclea en la pipeta para que solo pase el borde cortado unos milímetros. A continuación, expulse la cóclea en el vial de centelleo lleno de solución al 1 % de SDS. Haga circular dos mililitros de SDS al 1 % en agua desionizada a través de la cóclea en el vial de centelleo utilizando una pipeta de transferencia.Coloque el vial de centelleo en un rotor y déjelo girar a 10 RPM durante 72 horas a temperatura ambiente. Reemplácela con una solución nueva de SDS al 1% cada 24 horas durante un período de 72 horas y tenga cuidado de no exponer la cóclea al aire durante el reemplazo de la solución. Después de eso, lave la cóclea tres veces en el mismo vial de centelleo durante 30 minutos cada una con agua desionizada.En esta etapa, la cóclea debe ser descelularizada. Para la descalcificación, retire el agua desionizada restante del vial de centelleo dejando solo lo suficiente para mantener la cóclea sumergida. Para comenzar la descalcificación, agregue cinco mililitros de agua con EDTA y desionizada al 10% de EDTA al vial de centelleo que contiene la cóclea.Haga circular dos mililitros de EDTA al 10% en agua desionizada a través de la cóclea en el vial de centelleo utilizando una pipeta de transferencia. Vuelva a colocar el vial de centelleo en el rotador y deje que el vial de centelleo gire a 10 RPM durante 72 horas a temperatura ambiente. Cambie la solución de EDTA al 10% cada 24 horas durante un período de 72 horas.Tenga cuidado al cambiar de solución para que la cóclea no quede expuesta al aire. A continuación, enjuague la cóclea tres veces durante dos horas cada una con PBS. En esta etapa, la cóclea debe estar descalcificada.Antes de infundir células, comience incubando la cóclea descelularizada y descalcificada en una incubadora de cultivo celular al 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante un mínimo de una hora. Para profusar las cócleas, agregue una gota de MSCGM a cada cóclea para evitar que la cóclea se seque. Transfiéralos a una nueva placa de 24 pocillos con una pipeta de transferencia.Oriente delicadamente la cóclea con pinzas ultrafinas de modo que las ventanas ovaladas y redondas queden hacia arriba. A continuación, utilizando una jeringa estéril de insulina de calibre 28,5 con tubo conectado, extraiga 0,2 mililitros de gelatina de Human Wharton resuspendidas. Posteriormente, coloque el tubo sobre la ventana ovalada con pinzas finas esterilizadas.Profundar delicada y lentamente la cóclea con 0,2 mililitros de gelatina de Wharton humano resuspendida durante cinco minutos. Este paso de profusión es importante. La profusión exitosa de líquidos a través de la cóclea tiene un gran impacto en el resultado de este protocolo.Después de la profusión, agregue 0,8 mililitros de MSCGM precalentado a 37 grados Celsius al pocillo que contiene la cóclea para llevar el volumen total a un mililitro. Repita el procedimiento para cada cóclea. Usar una jeringa y un tubo nuevos cada vez.Coloque la cóclea profusa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados Celsius y cambie el medio tres veces por semana. Aquí se muestra la descelularización y descalcificación exitosas de una cóclea de ratón sin ninguna célula inyectada. En general, la anatomía de la cóclea se conserva con huecos sin manchas manchadas.Estos son los resultados representativos del cultivo exitoso de células gelatinosas de Human Wharton en un andamio de cóclea. Se observan abundantes manchas de color dappy en toda la cóclea y en la superficie ósea externa. Un examen más detallado de las vueltas individuales revela que las estructuras finas de la cóclea se conservan después de la descelularización y la descalcificación y que las células inyectadas están unidas o interactuando con la matriz extracelular de la cóclea nativa.También se investigó la descelularización en cultivos celulares posteriores mediante tinción con H&E. La cóclea descelularizada no contenía ninguna de las células de la cóclea nativa, pero conserva la mayor parte de la anatomía del órgano de Corti porque la matriz extracelular permanece. Inyectado en células cultivadas se puede observar a través del órgano de Corti, interactuando con la matriz extracelular descelularizada.Una vez dominada, la profusión de células en una cóclea descelularizada puede tardar aproximadamente de 10 a 15 minutos si la cóclea ya está preparada y las herramientas necesarias están dispuestas adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante manipular la cóclea con cuidado, ya que es frágil. También es importante evitar la introducción de aire en la cóclea, ya que las burbujas bloquearán el flujo de líquidos durante las profusiones.Este procedimiento general se puede aplicar a cócleas de otras especies y también se puede inyectar una amplia gama de tipos de células. Es probable que los tiempos específicos de descelularización y descalcificación varíen, pero los conceptos subyacentes seguirán siendo los mismos. El Dr. Peter Santi de la Universidad de Minnesota desarrolló inicialmente la técnica de descelularización que modificamos para este protocolo.Esperamos que nuestra técnica y el cultivo celular en andamio de cóclea estén disponibles para otros ingenieros de tejidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar, descelularizar y descalcificar con éxito los huesos temporales antes de inyectar células para su uso en experimentos de cultivo.

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