Name: Método basado en la precipitación de formazán inducida por exposición a la luz azul de la tinción de ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprende a cuantificar ADN en geles mediante tinción con SYBR Green I y NBT, usando luz azul o solar. Este método sencillo permite análisis de campo con equipamiento mínimo y escáneres estándar.

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Este trabajo fue financiado por el Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), Chile, proyecto 11130263 (a la derecha), proyecto CONICYT, NERC + Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (a la derecha) y U-inicia de la Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (a la derecha).
Gracias a Tatiana Naranjo-Palma por la ayuda en la etapa inicial de este proyecto, el Dr. Jorge Babul y Diego Quiroga-Roger de discusión útil, Robert Lesch para revisar el manuscrito y la Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Sociedad de la Universidad de Chile. Gracias también a Marcelo Pérez para editar el video y Neil Stevens para corregir el texto y Errol Watson para proporcionar la voz en OFF.

1. preparar y ejecutar el Gel
<ol><li>Preparar geles no desnaturalizantes 12% gel de poliacrilamida, utilizando la receta de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida Gel electroforesis (SDS-PAGE), encuentra en Sambrook y Russell14 pero usando agua en lugar de SDS.<ol>
<li>Para preparar 5 mL de solución de gel, uso de 1,7 mL de agua destilada, 2 mL de acrilamida/bis-acrilamida (30/0.8% w/v), 1,3 mL de Tris 1,5 M pH 8,8, 0,05 mL de persulfato de amonio 10% y 0,002 mL de TEMED.</li>
		<li>Para preparar 2 mL de gel de apilamiento utilice 1,5 mL de agua, 0,33 mL de acrilamida/bis-acrilamida (30/0.8% w/v), 0.25 mL de 1 M Tris pH 6.8, 0,02 mL de persulfato de amonio 10% y 0,002 mL de TEMED. Las dimensiones del gel son 7,3 cm x 8,2 cm x 0.075 cm (l x w x d). Nota: Utilice un peine bien 15 de 0,75 mm de espesor para mayor sensibilidad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agregar las cantidades apropiadas de 6 veces la carga del buffer y la muestra de ADN a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (por ejemplo uso 1 μl de tampón de carga de 6 x a 5 μl de muestra de ADN).</li>
	<li>Colocar el gel en la cámara de electroforesis vertical.<ol>
<li>Llene la cámara con 750 mL de buffer x TAE 1 ejecutar el 2 geles. Para preparar 1 L de 50 x TAE, utilizar 442 g de Tris base, 57,1 mL de ácido acético glacial y 100 mL de pH de EDTA de 0.5 M 8. Añadir agua destilada hasta un volumen final de 1 L.</li>
		<li>Cargar las muestras en el gel. Correr el gel a 100 V durante 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Por otra parte, preparar un gel de agarosa x TAE 1 usando la receta en Sambrook14.<ol>
<li>Añadir 300 mL de 1 x TAE a la cámara de electroforesis horizontal. Correr el gel por 45 min a 100 V.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NBT-SG que tinción (figura 1).
<ol><li>
Gel de acrilamida de tinción.
	<ol>
<li>Preparar las soluciones: 0.1% w/v NBT y 1.2 x SG me. Nota: Es posible utilizar el bromuro de etidio, GelRed y SYBR oro en vez de SG, pero tenía el mejor desempeño de la SG.</li>
		<li>Verter 16,75 mL de 1.2 x SYBR I solución verde en un recipiente de tamaño adecuado. Nota: Utilizamos la tapa de una caja de punta de pipeta como un contenedor, y estos volúmenes se calculan para cubrir el gel con este contenedor; sus dimensiones son 11,6 cm x 7.6 cm x 2.6 cm (l x w x d).</li>
		<li>Coloque el gel en la solución. Añadir 3,25 mL de solución de NBT 0,1% w/v para dar NBT de 0,2 mM y 1 x (equivalente a 2.0 μm) SG concentraciones finales.</li>
		<li>Sellar el recipiente con película plástica y envuelva completamente el recipiente con papel de aluminio para bloquear cualquier luz ambiente. Nota: La película plástica se utiliza para evitar salpicaduras y evitar la reacción de aluminio con la solución de tinción.</li>
		<li>Agitar durante 25 min en un agitador orbital a 60 rpm.</li>
		<li>Retire el aluminio y cubierta de plástico. Exponer al sol durante 90 minutos máximo. Compruebe cada 5 min hasta que aparezca la banda de interés.</li>
		<li>Para usar la luz azul, prepare un protoboard con 3 diodos emisores de luz (LED) y coloque los LEDs de 5 mm de la superficie del gel (verifica la tinción continuamente, como el tiempo necesario dependerá de la intensidad de la fuente de luz de LED).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gel de agarosa de tinción.
	<ol>
<li>Después de preparar y ejecutar una agarosa 1% gel como se describe en las secciones 1.4 (las dimensiones son 1 x 6,2 cm x 7 cm, l x w x d), siga los mismos pasos que en 2.1 con estas modificaciones:</li>
		<li>Verter 41,9 mL de 1.2 x SG solución en la tapa de una caja de punta de pipeta; sus dimensiones son 11,6 cm x 7.6 cm x 2.6 cm (l x w x d). Añadir 8,1 mL de solución NBT 0,1%.</li>
		<li>Sellar el recipiente con película plástica y luego envolver completamente el recipiente con papel de aluminio para bloquear cualquier luz ambiente.</li>
		<li>Agitar durante 1 h en un agitador orbital a 60 rpm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. los datos análisis.
<ol><li>
NBT-SG I curvas de calibración.
	<ol>
<li>Escaneo en 1200 ppp para obtener imágenes de gel.</li>
		<li>Software libre para análisis de imagen. Enderezar las imágenes usando un editor de imágenes. Ejecute una densitometría de la imagen.</li>
		<li>Calcular el área bajo la curva. Preparar un gráfico de laMax frente a concentración de ADN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. DNA recuperación.
<ol><li>Preparar un gel de agarosa al 1% en 1 x TAE con la receta encontrada en Sambrook14.</li>
	<li>Añadir 300 mL de 1 x TAE a la cámara de electroforesis horizontal. Carga 4 μL de 100 ng/μl pDJ10015 plasmid y escalera de ADN siguiendo el esquema dado en la figura 2. Correr el gel durante 1 h a 100 V.</li>
	<li>Marca y pesan dos tubos de microcentrífuga de 2 mL.</li>
	<li>Corte el gel por la mitad para tener dos mitades idénticas. Cada uno debe contener la escala y el plásmido de muestra para comparar las diferentes técnicas de tinción. Es de una representación esquemática en la figura 2.</li>
	<li>La mancha una media con NBT-SG I como en el paso 2.<ol>
<li>Corte la banda de plásmido con un bisturí limpio. Guardar la pieza de gel en un tubo y pesar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La otra parte del gel con SG de la mancha I con 50 mL de 1 x SG solución y agitar lentamente (60 rpm) el gel durante 1 hora en la oscuridad.<ol>
<li>Coloque el gel en un transiluminador y expuestos durante 2 minutos corte hacia fuera de la banda de plásmido con un bisturí limpio.</li>
		<li>Guarde la pieza de gel en el otro tubo y pesan. Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí manteniendo los tubos a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Llevar a cabo la extracción de plásmidos mediante un kit de extracción de gel comercial.</li>
</ol>5. plásmido normalización.
<ol><li>En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, añadir 10 μl del plásmido extraído y 60 μL de tipo de agua. Mezclar y transferir a una cubeta de cuarzo de 60 μL o utilizar 2 μl directamente en un Nanodrop.</li>
	<li>Medir el espectro de absorción entre 230 a 320 nm. Calcular la concentración de plásmido de la muestra utilizando la fórmula siguiente: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56528/56528eq1v3.jpg"> donde D es el factor de dilución aplicado (en este caso es 70/10), es Ax a x nm y 50 es el factor de conversión μg/ml de dsDNA.</li>
	<li>Diluir las muestras a 9,1 ng/μl.</li>
	<li>Transformar células competentes de Escherichia coli (e. coli) (e.g. XL10 oro) después de la de procedimiento de la transformación de Inoue16 con 5 μl de muestra diluida.</li>
	<li>Contar el número de colonias en las placas Petri y tenga en cuenta la dilución. Calcular las unidades de formación de Colonia (UFC) con la siguiente fórmula17: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56528/56528eq2v2.jpg"> donde D es el factor de dilución aplicado desde la cultura inicial.</li>
	<li>Realice una prueba de t no pareada.</li>
</ol>

<ol><li>LePecq, J. B., Paoletti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+complex+between+ethidium+bromide+and+nucleic+acids%3A+physical-chemical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization.</a> J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).</li>
<li>Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SYBR+Green+I+nucleic+acid+gel+stain+mutagenicity+and+ethidium+bromide+mutagenicity+in+the+Salmonella%2Fmammalian+microsome+reverse+mutation+assay+%28Ames+test%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test).</a> Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).</li>
<li>Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SYBR+Green-I%3A+a+new+fluorescent+dye+optimized+for+detection+picogram+amounts+of+DNA+in+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels.</a> Biophys. J. 66 (A150), (1994).</li>
<li>Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+agarose+gels+stained+with+methylene+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue.</a> Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).</li>
<li>Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterion-dye+staining+method+for+DNA+in+agarose+gels+using+crystal+violet+and+methyl+orange%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange.</a> Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).</li>
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<li>Santillán-Torres, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+stain+for+DNA+in+agarose+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel stain for DNA in agarose gels.</a> Trends Genet. 9 (2), 40(1993).</li>
<li>Adkins, S., Burmeister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+DNA+in+agarose+gels+as+migrating+colored+bands%3A+applications+for+preparative+gels+and+educational+demonstrations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations.</a> Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).</li>
<li>Cong, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visible+dye-based+staining+method+for+DNA+in+polyacrylamide+gels+by+ethyl+violet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet.</a> Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).</li>
<li>Altman, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+salts+and+formazans%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium salts and formazans.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).</li>
<li>Nineham, A. W. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cr50002a004">The chemistry of formazans and tetrazolium salts.</a> Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).</li>
<li>Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+imidazole-%2C+imidazolium%2C+and+tetrazolium-containing+compounds+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).</li>
<li>Paredes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+visible+and+selective+DNA+staining+method+in+gels+with+tetrazolium+salts%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts.</a> Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+a+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: a Laboratory Manual</a>. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).</li>
<li>Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3009026">In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor.</a> Cell. 45 (3), 397-406 (1986).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadigan%2C+M+%22Brock+biology+of+microorganisms%22">Brock biology of microorganisms</a>. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Una sensible y novela tinción de ADN basado en la reducción de NBT y el uso de SG me presenté en este artículo. El paso crítico en este protocolo es el tiempo de incubación del gel en el NBT-SG solución y la concentración de NBT. El tiempo de tinción de geles de agarosa es más largo que para geles de acrilamida debido al mayor espesor de geles de agarosa. Este método no funciona bien en presencia de SDS como NBT precipita en contacto con ella. Si el gel obtiene un fondo púrpura, recomendamos que se prepare otro gel y par...

Con los avances en Bioquímica y biología molecular, los estudios de ADN han exigido mejores técnicas para analizar el ADN. El primer método para la tinción de ADN fue plata coloración, que es muy sensible, pero carece de selectividad y no permite recuperación de muestra. Más tarde, el desarrollo de la tinción fluorescente del ADN permitió la cuantificación selectiva de DNA con la posibilidad de recuperación de la muestra. Uno de los primeros tintes fluorescentes utilizados para la cuantificación de ADN fue de bromuro de etidio1, que es mutagénico2. Sin embargo, ahora hay mejores tintes fluorescentes que son más seguros y más sensibles, como GelRed y SYBR Green I (SG I)3; pero todos estos tintes fluorescentes requieren el uso de un transiluminador (UV) ULTRAVIOLETA o un Fluorímetro.
Existen otras técnicas de tinción visiblemente ADN, tales como azul de metileno4 y cristal violeta5,6,7,8,9, pero todos ellos sufren de disminución de la sensibilidad y selectividad. Las sales de tetrazolio son susceptibles a la reducción de compuestos orgánicos y cuando esto sucede forman un insoluble y formazan coloreado precipitado10,11. Recientemente, algunas sales de tetrazolio bivalente se han demostrado para atar al ADN debido a sus anillos de tetrazolio positivo12.
En una reciente publicación13, se propuso una nueva técnica visible mancha y cuantificar ADN en geles de poliacrilamida, mediante la reducción de una sal de tetrazolio bivalente se llama nitro azul tetrazolio (NBT) y tintes fluorescentes como el bromuro de etidio, GelRed, SYBR Green I y SYBR oro. Esta reacción trabaja en presencia de luz azul o luz del sol y permite la recuperación de la muestra con la mejora de la calidad en comparación con el uso de SG I con un transiluminador UV. El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo detallado de la técnica de tinción con tetrazolio sales.

<table><tbody><tr><td>Reactivo de tetrazolio azul nitro</td><td>Gold Biotechnology</td><td>298-83-9</td><td>utilizado en la tinción</td></tr><tr><td>SYBR Green I 10000X</td><td>Reactivo Thermo-Fisher</td><td>S7563</td><td>utilizado en la</td></tr><tr><td>tinción Kit de extracción en gel</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>utilizado para extraer el plásmido del gel en el ensayo de integridad</td></tr><tr><td>escalera de ADN</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SM 1331</td><td>utilizado para hacer curvas de calibración y como referencia para la banda de corte en el ensayo de integridad</td></tr><tr><td>Agar Agar</td><td>Merck</td><td></td><td>utilizado para hacer placas de cultivo de LB-ampicilina&nbsp;</td></tr><tr><td>cloruro de sodio</td><td>Merck</td><td>1064045000</td><td>utiliza para fabricar placas de cultivo de LB-ampicilina&nbsp;</td></tr><tr><td>extracto de levadura</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>utilizado para hacer placas de cultivo de LB-ampicilina&nbsp;</td></tr><tr><td>peptona</td><td>Merck</td><td>72161000</td><td>utilizada para fabricar placas de cultivo de LB-ampicilina&nbsp;</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>AMRESCO</td><td>761</td><td>utilizado para fabricar geles de poliacrilamida</td></tr><tr><td>persulfato de amonio</td><td>Calbiochem</td><td>2310</td><td>utilizado para fabricar geles de poliacrilamida</td></tr><tr><td>acrilamida</td><td>invitrogen</td><td>15512-023</td><td>utilizado para fabricar geles de poliacrilamida</td></tr><tr><td>bisacrilamida</td><td>SIGMA</td><td>146072</td><td>utilizado para fabricar geles de poliacrilamida</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Merck</td><td>1083821000</td><td>utilizado para fabricar tampón TAE y tampón tris-HCl en gel de poliacrilamida no desnaturalizante</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td>utilizado para fabricar tampón TAE</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Merck</td><td>1.000.632.500</td><td>utilizado para fabricar tampón TAE</td></tr><tr><td>agarosa</td><td>Merck</td><td>16802</td><td>utilizado para fabricar tampón TAE</td></tr><tr><td>espectrofotómetro</td><td>Tecan</td><td>infinite 200 pro</td><td>utilizado para cuantificar plásmido</td></tr> <tr><td>de ADNunidad de purificación de agua</td><td>Merck</td><td>Elix 100</td><td>se utiliza para fabricar agua tipo 1 (ASTM) utilizada en espectrofotometría y diluciones de ADN\</td></tr>agua <tr><td>destilada</td><td></td><td></td> <td>utilizada en geles, medios de cultivo, tinciones y soluciones generales</td></tr><tr><td>HCl</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-03</td><td>utilizado para hacer gel de poliacrilamida no desnaturalizante tampón tris-HCl</td></tr><tr><td>6X colorante de carga de ADN</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R0610</td><td></td></tr><tr>Fuente de luz <td>LED azul de 5 mm</td><td>Jinyuan electronics</td><td>SP-021</td><td>utilizada en</td></tr><tr><td>la placa de protosistemas</td> de ensayo de integridad <td>KANDH</td><td>KH102</td><td>soporte y circuito de la fuente de luz&nbsp;</td></tr><tr><td>Batería de 9 V</td><td>Duracell</td><td>:</td> <td>utilizada para alimentar la</td></tr><tr><td>cámara de electroforesis horizontal</td> del LED <td>Biorad</td><td>1704486EDU</td><td>utilizada para fabricar y procesar gel de agarosa en el kit</td></tr><tr>de<td>electroforesis vertical</td> de ensayo de integridad <td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>utilizada para ejecutar geles de poliacrilamida en curvas de calibración</td></tr><tr><td>fuente de alimentación</td><td>Biorad</td><td>1645050&nbsp;</td><td>utilizado para alimentar la electroforesis</td></tr></tbody></table>

método basado en la precipitación de formazán inducida por exposición a la luz azul de la tinción de adn

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

Métodos de tinción de ADN son muy importantes para la investigación biomédica. Hemos diseñado un método sencillo que permite la visualización de ADN a simple vista por la formación de un precipitado coloreado. Actúa empapando la acrilamida o agarosa ADN del gel en una solución de 1 x (equivalente a 2.0 μm) SYBR Green I (SG I) y 0,20 mM nitro blue tetrazolium que produce una púrpura precipitar de precipitado cuando se expone a la luz solar o específicamente la luz azul. También, se realizaron pruebas de recuperación de ADN usando un plásmido resistente a ampicilina en un gel de agarosa teñido con nuestro método. Se obtuvo un mayor número de colonias con nuestro método que tradicional que manchaba usando SG con iluminación ULTRAVIOLETA. El método descrito es rápido, específico y no tóxico para la detección de ADN, permitiendo visualización de biomoléculas a "simple vista" sin un transiluminador y es barato y apropiado para el uso del campo. Por estas razones, nuestro ADN nueva tinción tiene beneficios potenciales para la investigación y la industria.

Un precipitado de formazán púrpura aparece donde se encuentra el ADN (verificado por espectrometría de masas13). En el experimento, una escalera de ADN fue cargada para hacer una curva de calibración (figura 3). El protocolo trabaja para geles de acrilamida y agarosa, pero tiene una intensidad menor y tarda más tiempo en agarosa. Sin embargo, el uso de geles de agarosa permite la recuperación de la muestra utilizando un kit disponible ...

Este método permite la coloración selectiva y cuantificación de DNA en geles sumergiendo el gel en un SYBR Green I / solución Nitro azul de tetrazolio y luego exponerlo a la luz del sol o una fuente de luz azul. Esto produce un precipitado visible y no requiere casi ningún equipo, haciéndolo ideal para uso de campo.

Método basado en la precipitación de formazán inducida por exposición a la luz azul de la tinción de ADN

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

El protocolo de tinción de ADN tiene tres pasos generales. La primera es poner el gel en una solución de SYBR Green I y nitro blue tetrazolio, también conocido como NBT. A continuación, el gel se agita durante 25 minutos si se trata de un gel de poliacrilamida y una hora si se trata de un gel de agarosa.El último paso es exponer el gel a una fuente de luz azul, como LED azules o luz solar. Durante este paso aparecen algunas bandas precipitadas. Estas bandas tienen una correlación directa con la concentración de ADN y el gel puede ser digitalizado en un escáner de oficina con el fin de cuantificar el ADN.Para el gel de poliacrilamida, se prepara un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. A continuación, el gel se carga con las muestras y se inicia el proceso de electroforesis. SYBR Green I se diluye a 1,2X y las soluciones NBT de 20 milimolares ya están preparadas.El gel se coloca en un recipiente de plástico y se añaden 16,75 milésimas de pulgada de SYBR Green I diluido y 325 milésimas de pulgada de NBT a 20 milimolares. Luego, el recipiente se cubre con Parafilm y papel de aluminio y se agita a 60 rpm durante 25 minutos. Finalmente, se retira el papel de aluminio y un Parafilm

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Es difícil entender la función de los procesos esenciales en bacterias. Microscopía de fluorescencia con objetivo específicos de colorantes puede proporcionar ideas claves en la progresión de crecimiento y el ciclo celular la célula microbiana. Aquí, Agrobacterium tumefaciens se utiliza como una bacteria modelo para resaltar los métodos de proyección de imagen de células vivas para la caracterización de los procesos esenciales.

Vivo de la célula de microscopía de fluorescencia para observar procesos esenciales durante el crecimiento de la célula microbiana

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar tiazol naranja para la detección de ADN en experimentos de electroforesis de gel. El uso de naranja de tiazol permite eliminación de bromuro de etidio, y se logra la detección de la fluorescencia con luz azul o UV.

Electroforesis de DNA utilizando naranja de tiazol en lugar de bromuro de etidio o tintes alternativos

Aquí, presentamos una implementación de MATLAB de detección automatizada y descripción cuantitativa de gotas de lípidos en imágenes de microscopía de fluorescencia de fission y células de levadura en ciernes.

Análisis del contenido de gotas de lípidos en fesión y levaduras en ciernes mediante el procesamiento automatizado de imágenes

El protocolo describe el etiquetado específico de nucleoides mitocondriales con una mancha de gel de ADN disponible comercialmente, la adquisición de la serie time lapse de células etiquetadas en vivo mediante microscopía de iluminación estructurada de superresor resolución (SR-SIM) y el seguimiento automático del movimiento nucleoide.

Etiquetado específico de nucleoides mitocondriales para microscopía de iluminación estructurada de lapso de tiempo

Los antibióticos etiquetados fluorescentemente son herramientas poderosas que se pueden utilizar para estudiar múltiples aspectos de la resistencia a los antimicrobianos. Este artículo describe la preparación de antibióticos etiquetados fluorescentemente y su aplicación para estudiar la resistencia a los antibióticos en bacterias. Las sondas se pueden utilizar para estudiar mecanismos de resistencia bacteriana (por ejemplo, eflujo) por espectrofotometría, citometría de flujo y microscopía.

Visualización de la resistencia bacteriana mediante sondas fluorescentes antibióticas

Este protocolo introduce una metodología de cribado fluorométrico optimizada para identificar inhibidores naturales de productos o pequeñas moléculas en la síntesis de proteínas. Su viabilidad la hace adecuada tanto para la enseñanza de grado en técnicas de descubrimiento de fármacos como para su implementación en campañas de química medicinal.

Un protocolo basado en fluorescencia para el cribado preliminar de inhibidores de síntesis de proteínas de fuentes naturales

Aprende a cuantificar ADN en geles mediante tinción con SYBR Green I y NBT, usando luz azul o solar. Este método sencillo permite análisis de campo con equipamiento mínimo y escáneres estándar.

Método basado en la precipitación de formazán inducida por exposición a la luz azul de la tinción de ADN

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