Método basado en la precipitación de formazán inducida por exposición a la luz azul de la tinción de ADN
28 de enero de 2018
Este método permite la coloración selectiva y cuantificación de DNA en geles sumergiendo el gel en un SYBR Green I / solución Nitro azul de tetrazolio y luego exponerlo a la luz del sol o una fuente de luz azul. Esto produce un precipitado visible y no requiere casi ningún equipo, haciéndolo ideal para uso de campo.
El protocolo de tinción de ADN tiene tres pasos generales. La primera es poner el gel en una solución de SYBR Green I y nitro blue tetrazolio, también conocido como NBT. A continuación, el gel se agita durante 25 minutos si se trata de un gel de poliacrilamida y una hora si se trata de un gel de agarosa.
El último paso es exponer el gel a una fuente de luz azul, como LED azules o luz solar. Durante este paso aparecen algunas bandas precipitadas. Estas bandas tienen una correlación directa con la concentración de ADN y el gel puede ser digitalizado en un escáner de oficina con el fin de cuantificar el ADN.
Para el gel de poliacrilamida, se prepara un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. A continuación, el gel se carga con las muestras y se inicia el proceso de electroforesis. SYBR Green I se diluye a 1,2X y las soluciones NBT de 20 milimolares ya están preparadas.
El gel se coloca en un recipiente de plástico y se añaden 16,75 milésimas de pulgada de SYBR Green I diluido y 325 milésimas de pulgada de NBT a 20 milimolares. Luego, el recipiente se cubre con Parafilm y papel de aluminio y se agita a 60 rpm durante 25 minutos. Finalmente, se retira el papel de aluminio y un Parafilm y el gel se expone a la luz solar o a una fuente de luz azul.
Para la cuantificación de bandas y las curvas de calibración, el gel se coloca en un escáner de oficina, luego la imagen se analiza utilizando un software de análisis de imágenes. Finalmente, se realiza un injerto de señal normalizada frente a concentración. Se hace un gel de agarosa.
Los pocillos se cargan con un plásmido que tiene resistencia a la ampicilina y el gel se corta en dos piezas, cada una de las cuales se tiñe con una tinción diferente. A continuación, se extrae la banda del plásmido y se transforma mediante transformación química en células competentes con medios que contienen ampicilina. Se prepara un gel de agarosa al 1% en tampón TAE 1X y se carga con cuatro microlitros de plásmido a unos 100 nanogramos por microlitro.
A continuación, el gel de la cámara de electroforesis se hace funcionar a 100 voltios durante una hora. La mitad del gel se tiñe con el método SYBR Green I y NBT y la otra mitad con el método SYBR Green I UV. Para el gel de agarosa, el método SYBR Green I NBT se realiza utilizando SBYR Green I a una concentración de 1,2X y NBT a 2 milimolares.
El gel se coloca en un recipiente de plástico y el volumen de la solución se escala para cubrir el gel y el tiempo de agitación se extiende a una hora. En el caso de los geles de agarosa, el método SYBR Green I de uso común se realiza cubriendo el gel con 1X solución de SYBR Green I y agitando durante una hora. A continuación, el gel se expone a un transiluminador UV para la visualización de la banda durante dos minutos.
Una vez teñido el gel, se corta la banda del plásmido con un bisturí y se extrae el plásmido con un kit de extracción comercial. El ADN se normaliza a 9,1 nanogramos por microlitro para transformar la bacteria Escherichia coli XL 10 químicamente competente. Por último, se cuentan las colonias.
Se calculan las unidades formadoras de colonias. El resultado se injerta y se comparan los resultados obtenidos con SYBR Green I NBT y SYBR Green I UV. Aparece un precipitado de formazano púrpura donde se encuentra el ADN.
En el experimento se cargó una escalera de ADN para hacer una curva de calibración con un límite de detección de 192 picogramos a 1.500 pares de bases. El uso de geles de agarosa permite la recuperación de la muestra utilizando un kit disponible en el mercado y no interfiere con la extracción. Cierta recuperación utilizando este método con LED azul da como resultado una mejor calidad en comparación con el SYBR Green I que usa transiluminador.
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Descripción general
Este método permite la tinción selectiva y la cuantificación de ADN en geles utilizando una solución de SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium. El proceso requiere un equipo mínimo, lo que lo hace adecuado para aplicaciones de campo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Bioquímica
- Biología molecular
- Aplicaciones de campo
Antecedentes
- La cuantificación de ADN es esencial para diversos estudios biológicos.
- Los métodos tradicionales a menudo requieren equipos complejos.
- Este método simplifica significativamente el proceso.
- Utiliza reactivos comunes para obtener resultados efectivos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método sencillo para la tinción de ADN.
- Permitir la cuantificación de ADN en diferentes tipos de geles.
- Facilitar el trabajo de campo con requisitos mínimos de equipo.
Métodos Utilizados
- Sumergir el gel en una solución de SYBR Green I y NBT.
- Agitar el gel durante 25 minutos (poliacrilamida) o 1 hora (agarosa).
- Exponer el gel a una fuente de luz azul o a la luz solar.
- Digitalizar el gel para la cuantificación de ADN.
Resultados principales
- Las bandas de precipitado visibles se correlacionan con la concentración de ADN.
- Se logra una tinción eficaz con equipo mínimo.
- Los resultados pueden cuantificarse utilizando escáneres de oficina estándar.
- El método demuestra fiabilidad en condiciones de campo.
Conclusiones
- El método proporciona un enfoque práctico para la cuantificación de ADN.
- Es adecuado para diversos tipos de geles y aplicaciones de campo.
- Mejora el acceso para investigadores en ubicaciones remotas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método de tinción de ADN permite la visualización directa y la cuantificación de ácidos nucleicos sin necesidad de equipos especializados, lo que favorece una validación rápida del blanco en entornos con recursos limitados. Al eliminar la dependencia de transiluminadores UV, reduce los riesgos de seguridad y la complejidad operativa en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano. El enfoque mejora la confianza predictiva mediante una correlación reproducible de la señal basada en colorantes con la concentración de ADN, facilitando decisiones de avance o descarte en los procesos de identificación de compuestos prometedores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la comprobación de hipótesis mediante la correlación directa entre la intensidad del precipitado de formazán y la concentración de ADN, lo que apoya la evaluación del acoplamiento al blanco.
- Valor operativo: Utiliza agitación a temperatura ambiente y exposición a luz azul, evitando protocolos con radiación UV peligrosa y equipos especializados de imagen.
- Valor predictivo: Proporciona una salida cuantitativa compatible con escáneres de oficina, permitiendo una comparación rápida de los rendimientos de ácidos nucleicos entre diferentes condiciones experimentales.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Genera bandas de precipitado estables y visibles que sirven como lecturas estandarizadas para formatos de cribado de ácidos nucleicos de alto rendimiento.
- Reproducibilidad: Tiempos definidos de agitación (25 min para poliacrilamida, 60 min para agarosa) y concentraciones escalables de reactivos garantizan una generación de señal consistente entre lotes.
- Compatibilidad con plataformas: Funciona tanto con geles de agarosa como de poliacrilamida, permitiendo una integración sin problemas en flujos de trabajo existentes de electroforesis para análisis de variantes o de plásmidos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Permite la recuperación de plásmidos funcionales tras la tinción, como se demuestra mediante un mayor número de unidades formadoras de colonias en comparación con los métodos basados en UV, posibilitando la validación funcional posterior.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Evita el daño en el ADN inducido por UV, preservando la integridad de la muestra para una correlación precisa entre genotipo y fenotipo en ensayos de cribado fenotípico.
- Utilidad Preclínica: Permite la cuantificación portable de constructos de expresión génica o títulos virales en modelos preclínicos sin necesidad de infraestructura de laboratorio.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento que va desde la extracción de ácidos nucleicos hasta la validación de ensayos funcionales, especialmente en contextos donde el acceso a equipos es limitado o se requiere una iteración rápida.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la validación de dianas al proporcionar lecturas cuantificables de ADN que se correlacionan con la eficiencia transcripcional o de edición en estudios de modulación de vías.
- Detección: Permite la cuantificación estandarizada de ácidos nucleicos para la confirmación de resultados positivos en bibliotecas CRISPR u de sobreexpresión, mejorando la reproducibilidad del ensayo.
- Análisis: Genera curvas lineales de señal-concentración mediante imágenes obtenidas con escáner de oficina, lo que facilita la normalización de datos en formatos basados en placas de múltiples pocillos o geles.
- Investigación Traducional: Facilita la recuperación de ácidos nucleicos íntegros para ensayos funcionales in vitro, conectando el descubrimiento con las pruebas de eficacia preclínica.
- Reutilización Empresarial: Requiere únicamente SYBR Green I, NBT y una fuente de luz azul, lo que lo convierte en un módulo de bajo costo y reutilizable entre múltiples equipos de proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al evitar artefactos inducidos por UV, mejorando la fiabilidad de los datos en ensayos de validación de objetivos.
- Valor operativo: Elimina la necesidad de cuartos oscuros o transiluminadores, aumentando el rendimiento y reduciendo cuellos de botella en instalaciones centrales compartidas.
- Valor estratégico: Disminuye el gasto de capital para la cuantificación de ácidos nucleicos, permitiendo pruebas descentralizadas en laboratorios satélite o sitios colaborativos.
- Impacto en el portafolio: Apoya el avance ajustado al riesgo al proporcionar una confirmación temprana e independiente del equipo sobre el rendimiento del constructo antes de invertir en purificación posterior.
Consideraciones de Implementación
- Requiere formación básica en biología molecular para la preparación de geles y la electroforesis.
- Necesita acceso a una fuente de luz azul (por ejemplo, LED de 470 nm) o luz solar, y equipo estándar de agitación de laboratorio.
- Exige tiempos de tinción y concentraciones de reactivos estandarizados para garantizar la reproducibilidad entre laboratorios.
- Puede requerir optimización para formatos de alto rendimiento debido a los pasos manuales de manipulación de geles.
- Limitado a la detección de ácidos nucleicos; no es aplicable para ensayos de proteínas o moléculas pequeñas sin adaptación.
