Name: Ácidos grasos saturados inducir muerte celular de macrófago asociado de ceramida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprende a preparar macrófagos primarios de médula ósea y conjugados de ácido graso-BSA para estudiar la muerte celular inducida por ácidos grasos saturados y su relación con los niveles de ceramida.

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Este trabajo fue financiado parcialmente por los fondos de puesta en marcha de la Universidad de Louisville y el Instituto Nacional del cáncer (Bethesda, MD) concede a R01CA177679, R01CA180986.

el protocolo fue aprobado por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Louisville.
 1. macrófagos de derivados de la médula ósea de ratón (BMDMs) <ol><li>Euthanize un ratón de tipo salvaje de 6 a 8 semanas de edad, sano con CO 2. Perno hasta un tablero de la espuma y spray con etanol al 70% hasta que se haya empapado. Quitar los huesos tibia/fémur con pinzas y tijeras. Ponerlos en una placa Petri con 5 mL 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Realizar todos los procedimientos bajo condiciones estériles.</li>
	<li>Corte ambos extremos del hueso fémur tibia con una tijera en una campana de cultivo estériles para tejidos. Al ras del hueso con una aguja de 25 G con PBS + 2% de suero bovino fetal (FBS) en un tubo de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar las células de médula ósea a 500 x g, 4 ° C por 5 min</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en tampón de lisis de glóbulos rojos de 1 mL a lyse células de sangre rojas (RBC) de menos de 1min diluir inmediatamente con 9 mL 1 x PBS. Centrifugar nuevamente como en el paso 1.3. Decantar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 10 mL 1 x PBS, filtrar la suspensión de células a través de una malla de nylon estéril 40 μm en otro tubo de 15 mL para eliminar células residuos/grupos. Centrifugar nuevamente como en 1.3. Decantar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en el Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con el 5% medio FBS de 15 mL y 10 μg/mL gentamicina, placa que las células en una placa de cultivo de tejido de 100 mm a 37 o C incubadora para 60 minutos agitar suavemente el plato, sacan el flotante las células y contarlas.</li>
	<li>Placa de 6 x 10 6 células en un plato de 100 mm con macrófagos 12 mL diferenciar los medios de comunicación (RPMI 1640 con 5% FBS y gentamicina 10 μg/mL, mezclado con 30% elución de L929 acondicionado media 10) con macrófagos de ratón recombinante de 10 ng/mL factor estimulante de colonias (M-CSF) durante 2 días.</li>
	<li>Después de cultivo durante 2 días en una incubadora de 37 ° C con 5% CO 2, alimentación cada plato con macrófagos fresco 6 mL diferenciar los medios de comunicación con el M-CSF de 10 ng/mL.</li>
	<li>El día 5, 8 mL de los viejos medios a sin molestar a las células y añadir macrófago fresco 10 mL diferenciar los medios de comunicación con el M-CSF de 10 ng/mL.</li>
	<li>En el día 7, de la cosecha los macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) usando un levantador celular. 
	Nota: Adjunto los macrófagos también pueden ser disociados con 5 mL de 1 mM de EDTA en PBS 1 x durante 5 a 10 minutos después de quitar las células de flotación y lavado de la placa dos veces con 5 mL 1 x PBS. Centrifugar las células como en el paso 1.3. resuspender en macrófago fresco diferenciar los medios de comunicación y contar con un hemocitómetro.
	<ol><li>Confirmar las BMDMs &#39; fenotipo mediante citometría de flujo como describe en 5. Preparar el ratón derivado macrófagos en cierta concentración para los estudios siguientes.</li>
	</ol></li></ol> 2. BSA-grasos ácido conjugado preparación <ol><li>Prepare 2 mM BSA en PBS estéril. Por ejemplo, pesar 6,65 g BSA, Añadir 30 mL 1 x PBS para disolver, luego agregar más PBS hasta 50 mL, escalamiento componentes para hacer 2 mM BSA en PBS 1 x.</li>
	<li>Prepare 5 mM individuales sodio sal de ácidos grasos en 2 mM BSA. Calentar a 37 ° C o superior, si es necesario y someter a ultrasonidos la mezcla de 2 mM BSA y sal de sodio de los ácidos grasos hasta obtener una solución clara. 
	Nota: En comparación con ácidos grasos insaturados, ácidos grasos saturados necesitan una temperatura más alta y más tiempo de sonicación para la disolución de.</li>
	<li>Filtro de la solución de grasos ácido de BSA a través de un 0.22 μm filtro, alícuota en microcentrífuga estéril 1.5 mL los tubos y almacenarlos a 4 ° C para uso a corto plazo o a-20 ° C para almacenamiento a largo plazo. Ninguna precipitación debe observarse después de almacenamiento a 4 ° C en el refrigerador.</li>
</ol> 3. Saturado ácidos grasos inducen celular muerte de ratón médula ósea macrófagos derivados de <ol><li>placa BMDMs en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos con 0.4 x 10 6/ml en macrófago diferenciar los medios de comunicación.</li>
	<li>Tratar las células con los 0.4m m de ácido palmítico y ácido esteárico por 16 a 24 h a una incubadora de 37 ° C con 5% CO 2. Utilizar BSA como control negativo.</li>
	<li>Las células con un levantador de células después del tratamiento de la cosecha y desactivación de las células a 500 x g, 4 ° C por 5 min.</li>
	<li>Mancha las células con anexina V-Alexa 488 y aminoactinomycin 7 D (7-AAD) en 100 μL de anexina tampón de Unión V durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Diluir la muestra con 200 μL de tampón de Unión anexina, mezclar suavemente, y luego guardar las muestras en hielo después de la incubación.</li>
	<li>Analizar las células tan pronto como sea posible por citometría de flujo 5. Annexin V-Alexa 488 se detecta en canal FITC y 7-AAD es en canal PerCP/PerCP-Cy5.5.</li>
</ol> 4. Tinción intracelular de ceramida <ol><li>después del tratamiento de ácido graso, cosechar las células como en el paso 3.3. Luego fijar las células en paraformaldehído al 4% durante 30 minutos</li>
	<li>Lavar la muestra con 1 mL 1 x PBS, girar hacia abajo como en el 3.3 y decantar el sobrenadante.</li>
	<li>Teñir las células con el anticuerpo primario anti-ceramida (dilución 1: 200) en buffer de permeabilización de 1 x μL 100 durante 30 minutos</li>
	<li>Lavado y exprimido por las células otra vez como en el paso 4.2.</li>
	<li>Teñir las células con el anticuerpo secundario de anti-ratón IgM (dilución 1: 500) en buffer de permeabilización de 1 x μL 100 durante 30 minutos</li>
	<li>Lavado y centrifugado hacia las células otra vez como en el paso 4.2. Añadir 250 μL 1 x PBS y analizar las células mediante citometría de flujo 5. 
	Nota: Vea la lista detallada de reactivos en la tabla de equipos y reactivos.</li>
</ol>

<ol><li>Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+fatty+acids+on+a+macrophage+cell+line+%28J774%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774).</a> Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).</li>
<li>Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+high+and+low+affinity+fatty+acid+binding+sites+on+human+serum+albumin+revealed+by+NMR+drug-competition+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis.</a> J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).</li>
<li>Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+Acid+Saturation+of+Albumin+Used+in+Resuscitation+Fluids+Modulates+Cell+Damage+in+Shock%3A+In+Vitro+Results+Using+a+Novel+Technique+to+Measure+Fatty+Acid+Binding+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity.</a> Shock. , (2017).</li>
<li>Vusse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+as+fatty+acid+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Albumin as fatty acid transporter.</a> Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Fatty+Acid+Binding+Protein+Promotes+Saturated+Fatty+Acid-Induced+Macrophage+Cell+Death+through+Enhancing+Ceramide+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production.</a> J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Fatty+Acid+binding+protein+promotes+skin+inflammation+induced+by+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet.</a> Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-induced+NLRP3-ASC+inflammasome+activation+interferes+with+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling.</a> Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-binding+protein+E-FABP+restricts+tumor+growth+by+promoting+IFN-beta+responses+in+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages.</a> Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).</li>
<li>Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+and+stearic+fatty+acids+induce+caspase-dependent+and+-independent+cell+death+in+nerve+growth+factor+differentiated+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells.</a> J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. , (2008).</li>
<li>Dansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+binding+of+very-long-chain+fatty+acyl-CoA+esters+to+the+peroxisomal+non-specific+lipid-transfer+protein+%28sterol+carrier+protein-2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2).</a> Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).</li>
<li>Ulloth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+methyl-beta-cyclodextrin+toxicity+in+NGF-differentiated+PC12+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death.</a> Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).</li>
</ol>

Los autores declaran no hay conflictos de intereses financieros.

La preparación adecuada de solución de ácido graso es de vital importancia para el estudio de la función biológica de los ácidos grasos. La neutralización de los ácidos grasos aumenta su solubilidad en la solución acuosa. Sin embargo, sales de sodio de ácidos grasos, especialmente los ácidos grasos saturados, son todavía de baja solubilidad en agua o PBS como observado. Un método es utilizar el etanol del 95-100% para ayudar a disolver ácidos grasos1. Usando este método, mayor toxicidad para las c...

Los ácidos grasos juegan un papel crítico en el metabolismo energético y en la síntesis de fosfolípidos de membrana en diferentes tipos de células. Los ácidos grasos tienen una solubilidad acuosa baja. Preparación apropiada de ácidos grasos es de vital importancia para el estudio de las funciones biológicas de los ácidos grasos en las células mamíferas. Cuando los ácidos grasos se preparan con etanol, muchos ácidos grasos pueden mostrar su efecto tóxico jabón (detergente) en la membrana celular, incluso en concentraciones relativamente bajas de1. Como un natural, importante transportador de ácidos grasos libres en el suero, la albúmina sérica se considera un buen portador para ácido graso entrega en vitro para ácidos grasos función ensayos2,3,4. Sin embargo, los detalles de la preparación de ácidos grasos y albúmina de suero conjugado generalmente no están disponibles aunque se han publicado numerosos trabajos de investigación utilizando ácidos grasos.
Los macrófagos expresan muy epidérmica proteína de unión a ácidos grasos y adiposo proteína de unión a ácidos grasos5,6,de7,8. Se activa la absorción saturada y ácidos grasos insaturados que puede regular sus funciones inmunitarias. Para estudiar el impacto de los ácidos grasos en los macrófagos y otras células, diferentes métodos de preparación de ácidos grasos fueron aplicados1,7,9. Utilizando apropiadamente preparado, suero, ácidos grasos conjugados de albúmina para investigar el impacto de los ácidos grasos sobre la función de macrófagos es de vital importancia en la obtención de datos biológicamente significativos. Estudios sobre el impacto de los ácidos grasos sobre la función del macrófago pueden proporcionar conocimientos básicos y potenciales dianas terapéuticas relacionadas con el metabolismo de ácidos grasos en enfermedades implicadas macrófagos.

<table><tbody><tr><td>Baño ultrasónico CPX &nbsp;</td><td>Bransonic</td><td>Modelo 2800</td><td></td></tr><tr><td>Palmitato de sodio (PA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1109</td><td>M.W. 278</td></tr><tr><td>Estearato de sodio (SA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1111</td><td>M.W. 306</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA), libre de ácidos grasos</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Factor estimulante de colonias de macrófagos de ratón (mM-CSF)&nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular,&nbsp; Inc.</td><td>5228</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>VWR International</td><td>71002-878</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V, Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>Fisher Scientific</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-ceramida (IgM de ratón)</td><td>Sigma</td><td>C8104-50TST</td><td>Clon: MID 15B4</td></tr><tr><td>Anticuerpo IgM anti-ratón de cabra, y micro; cadena, FITC conjugado</td><td>Sigma</td><td>AP128F</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fijación</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de permeabilización</td><td>Ebioscience</td><td>4307693</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos&nbsp;</td><td></td> Tampón de unión de anexina 11814389001 <td></td><td>Sigma</td></tr><tr><td>556454</td><td></td><td></td><td>Biosciences</td></tr><tr><td>L929 ATCC</td><td></td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Elevador de células&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-364</td><td></td></tr><tr><td>Nota: M.W. es para peso molecular.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Ácidos grasos saturados inducir muerte celular de macrófago asociado de ceramida

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Los macrófagos expresan muy epidérmica proteína de unión a ácidos grasos y la proteína de unión a ácidos grasos adiposa. Se activa la absorción saturada y ácidos grasos insaturados, que podría desempeñar un papel crítico en la regulación de sus funciones inmunes. Numerosos estudios han demostrado que diversos ácidos grasos, saturados o insaturados, poseen diferentes efectos sobre el crecimiento celular y la función. Sin embargo, varían los enfoques utilizados para la preparación de ácido graso que puede conducir a resultados no fisiológicos. Albúmina sérica, un portador natural de ácidos grasos en sangre periférica de mamífero, se recomienda para la formación de un conjugado complejo con la sal de sodio de los ácidos grasos para estudiar la función del ácido graso en células de mamífero, minimizando la toxicidad del jabón de ácido graso. Así, una sencilla, relativamente rápida de la calefacción y sonicando método es desarrollada y presentada aquí para la formación del conjugado ácida grasos BSA. Se describe un protocolo de uso de ácidos grasos saturados, especialmente el esteárico ácidos para inducir muerte celular severa en macrófagos derivado de médula ósea de ratón. Demostramos más que la muerte celular inducida por ácidos grasos saturados está positivamente asociada con los niveles de ceramida celulares acumulados. Este método se puede extender para los estudios del impacto de los ácidos grasos en las células de otros mamíferos.

La obesidad aumenta las concentraciones de ácidos grasos libres en suero. Como fagocitos profesionales, macrófagos activamente toman ácidos grasos para mantener la homeostasis de host. Durante estos procesos, sobrecarga de lípidos pueden inducir muerte celular de macrófago. Para ello, cultiva BMDMs en vitro con obesos niveles de ácidos grasos dietéticos y muerte de las células macrófagos medido utilizando tinción de citometría de flujo. En comparación con el control de la BSA, ác...

Nos ilustran un método directo para derivar macrófagos murinos primarios de células de médula ósea y conjuga un método sencillo para preparar ácidos grasos BSA. Entonces demostramos que ácidos grasos saturados puede inducir la muerte celular de macrófago, y tal muerte celular está positivamente asociada con la acumulación celular de los niveles de ceramida.

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

El objetivo general de este experimento, en el que los macrófagos se tratan con ácidos grasos saturados, es demostrar que la muerte celular de los macrófagos inducida por ácidos grasos saturados está asociada con los niveles celulares acumulados de ceramidas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inflamación metabólica. Tales como: muerte celular e inflamación inducida por ácidos grasos saturados.La principal ventaja de esta técnica es proporcionar un enfoque simple pero detallado para impulsar los conjugados de ácidos grasos BSA. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es un desafío preparar una solución conjugada de ácidos grasos BSA estable y precisa con resultados consistentes. Comience este procedimiento con la extracción de los huesos de la tibia y el fémur de un ratón silvestre sano de seis a ocho semanas de edad sacrificado, como se describe en el protocolo de texto.Corta ambos extremos de los huesos de la tibia y el fémur con una tijera y una capucha de cultivo de tejidos estéril. Enjuague los huesos con una aguja de calibre 25 con PBS más un dos por ciento de suero fetal bovino en un tubo de 15 mililitros. Centrifugar las células de médula ósea a 500 g, cuatro grados centígrados durante cinco minutos.A continuación, vuelva a suspender el gránulo de células en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos para lisar los glóbulos rojos durante menos de un minuto. Diluir las células inmediatamente con nueve mililitros de 1x PBS. Centrifugar de nuevo, como antes, y decantar el sobrenadante.Vuelva a suspender el pellet de celda en 10 mililitros de 1x PBS. Luego, filtre la suspensión celular a través de una malla de nailon estéril de 40 micras en otro tubo de 15 mililitros para eliminar los desechos y grupos celulares. Después de la centrifugación como antes, vuelva a suspender el pellet de celda en 15 mililitros de Roswell Park Memorial Institute medium 1640 con cinco por ciento de FBS y 10 microgramos por mililitro de gentamicina.Luego, coloque las células en una placa de cultivo de tejidos de 100 milímetros y colóquela en una incubadora a 37 grados Celsius durante 60 minutos. Agite suavemente el plato, saque las células flotantes y cuéntelas. A continuación, coloque 6.000.000 de células en una placa de 100 milímetros con 12 mililitros de medios diferenciadores de macrófagos y 10 nanogramos por mililitro de factor estimulante de colonias de macrófagos de ratón recombinante, o MCSF, durante dos días.Después de cultivar durante dos días en una incubadora a 37 grados centígrados con cinco por ciento de CO2, alimente cada plato con seis mililitros de medios diferenciadores de macrófagos frescos que contengan 10 nanogramos por mililitro de MCSF. En el quinto día, saque ocho mililitros del medio viejo sin alterar las células y agregue 10 milímetros de medio diferenciador de macrófagos fresco con 10 nanogramos por mililitro de MCSF. En el séptimo día, coseche los macrófagos derivados de la médula ósea, o BMDM, utilizando un elevador de células.Confirme el fenotipo de los BMDM mediante citometría de flujo, tal como se menciona en el protocolo de texto. Para preparar el conjugado de ácidos grasos BSA, prepare cinco sal de sodio individual milimolar de ácidos grasos en dos milimolares BSA. Caliente la mezcla a 37 grados centígrados o más si es necesario.A continuación, calienta sónicamente la mezcla de dos milimolares de BSA y sal sódica de ácidos grasos hasta obtener una solución clara. Después de la sonicación, filtre la solución de BSA de ácidos grasos a través de un filtro de 0,22 micras. A continuación, alícuota de la solución filtrada en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mililitros.Almacene los tubos a cuatro grados centígrados para uso a corto plazo, o a menos 20 grados centígrados para almacenamiento a largo plazo. No se debe observar precipitación después del almacenamiento a cuatro grados centígrados en el refrigerador. Coloque los BMDM en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos con 0,4 millones de células por mililitro en un medio diferenciador de macrófagos.Trate las células con ácido palmítico de 0,4 milimolares y ácido esteárico durante 16 a 24 horas en una incubadora a 37 grados centígrados con cinco por ciento de CO2. Coseche las células con un levantador de células después del tratamiento.Luego, gire las células a 500 g, cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Tiñir las células con anexina V-Alexa 488 y 7-AAD en 100 microlitros de tampón de unión a anexina-V durante 15 minutos a temperatura ambiente. Diluir la muestra con 200 microlitros de tampón aglutinante de anexina y mezclar suavemente.Mantenga las muestras en hielo después del período de incubación. Analice las células teñidas lo antes posible mediante citometría de flujo. La anexina V-Alexa 488 se detecta en el canal FITC y la 7-ADD se detecta en el canal PerCP PerCP-Cy5.5.Después del tratamiento con ácidos grasos, coseche las células como antes. Luego, fije las células en paraformaldehído al cuatro por ciento durante 30 minutos. Lave la muestra con un milímetro de 1x PBS antes de centrifugar la muestra como antes.Después de decantar el sobrenadante, tiñir las células con Anticuerpo Primario Anti-Ceramida en 100 microlitros de 1x Tampón de Permeabilización durante 30 minutos. Después de lavar y centrifugar las células como antes, tiña las células con Anticuerpo Secundario IgM Anti-Ratón en 100 microlitros de tampón de permeabilización 1x durante 30 minutos. Lave y gire las celdas nuevamente como antes.A continuación, añada 250 microlitros de 1x PBS y analice las células teñidas mediante citometría de flujo. Las BMDM se cultivaron in vitro con niveles obesos de ácidos grasos en la dieta y la muerte celular de macrófagos se midió mediante tinción por citometría de flujo. En comparación con el control de BSA, los ácidos grasos saturados, en particular los ácidos estéricos, indujeron una muerte celular significativa de los BMDM.Las células muertas se mostraron como población doble positiva teñida por anexina V y 7-AAD. Además, la muerte celular inducida por ácidos grasos saturados se asocia positivamente con los niveles celulares acumulados de ceramida en los macrófagos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar conjugaciones de ácidos grasos BSA y tratar los macrófagos con conjugados de ácidos grasos BSA para estudiar la muerte celular y la inflamación.En su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inflamación metabólica exploraran la muerte celular inducida por ácidos grasos saturados y la inflamación en la obesidad.

saturated-fatty-acids-induce-ceramide-associated-macrophage-cell-death

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Para probar la interacción de una proteína con su objetivo de lípidos se utilizó MACS y anexina V conjugada con partículas magnéticas y de las vesículas de lípidos sintetizados a partir de los lípidos de destino y fosfatidilserina anexina V vinculante. Proteínas unidas a los lípidos de destino se co-purificados y analizados después de la elución de las cuentas.

Lípidos vesículas mediada por cromatografía de afinidad utilizando magnética clasificación de células activadas (LIMACS): un nuevo método para analizar la interacción de proteínas y lípidos

Este video demuestra la activación de proteínas caspasas en macrófagos humanos utilizando proteínas reporteras de complementación de fluorescencia bimolecular. Los prodominios de la caspasa-1 se fusionan con fragmentos no fluorescentes de las proteínas de Venus, que se reclutan para los complejos de inflamasoma. La proximidad de los inflamasomas induce el repliegue y la fluorescencia de los fragmentos de Venus, lo que confirma la activación de las caspasas en los macrófagos.

Visualización de la activación de caspasas en macrófagos derivados de monocitos humanos

Este video muestra la evaluación de múltiples activaciones de caspasas en macrófagos derivados de la médula ósea a través de la estimulación con el virus de la influenza. Tras la lisis de macrófagos, la inactivación térmica del lisado y la centrifugación, se recogen caspasas intracelulares para su posterior análisis inmunológico.

Evaluación de la activación de múltiples caspasas en macrófagos

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de eventos de señalización intracelular inducidos en células viables por interacción física con células muertas o moribundas adyacentes. El protocolo se centra en los eventos de señalización inducidos por el reconocimiento de las células muertas mediado por receptores, en contraposición a su captación fagocítica o liberación de mediadores solubles.

Identificación de eventos de señalización intracelular inducida en células viables por la interacción con las células vecinas sometidos a la célula apoptótica de la muerte

Este protocolo permite un investigador aislar y caracterizar tejido residente macrófagos en varios sello inflamado los tejidos extraídos de modelos inducida por la dieta de los trastornos metabólicos.

Aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad

Describimos la detección de la activación de inflammasome NLRP3 en bases celulares mediante microscopía de fluorescencia y la coloración para activa caspasas-1 y el adaptador, ASC. Un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa se presenta para detectar lisis pyroptotic sobre una base de población. Estas técnicas se pueden adaptar para estudiar muchos aspectos de la biología de inflammasome.

Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

Este protocolo describe el flujo de trabajo para obtener macrófagos derivados de monocitos (MDM) a partir de muestras de sangre humana, un método simple para introducir eficientemente reporteros de complementación de fluorescencia bimolecular de caspasa inflamatoria (BiFC) en MDM humanos sin comprometer la viabilidad y el comportamiento celular, y un enfoque basado en imágenes para medir la activación de la caspasa inflamatoria en células vivas.

Visualización de la proximidad inducida por caspasas inflamatorias en macrófagos derivados de monocitos humanos

Este protocolo describe un método integral para evaluar la activación de caspasas (caspasa-1, caspasa-3, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-11) en respuesta a modelos de infección, insultos estériles y cáncer tanto in vitro como in vivo (en ratones) para determinar el inicio de vías de muerte celular, como piroptosis, apoptosis, necroptosis y PANoptosis.

Evaluación de la activación de la caspasa para evaluar la muerte celular inmune innata

Este protocolo se basa en la muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Utilizamos la citometría de flujo para analizar la tinción doble de anexina V y 7-AAD para detectar la muerte celular, utilizando toda la célula y empleando microscopía electrónica de barrido para observar la morfología de la membrana celular.

Muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA y su validación

Mediadas por células linfocitotoxicidad (LMC) los ensayos se pueden utilizar para evaluar las respuestas autorreactivas y los mecanismos de estudio de la muerte celular in vitro. Sin embargo, utilizando células vivas, las técnicas de microscopía confocal microscópicos con tintes fluorescentes, el tipo y la cinética de muerte celular, así como las rutas utilizadas se pueden estudiar con mayor detalle.

Métodos para evaluar la Beta mediada por la muerte celular por linfocitos T citotóxicos

Aprende a preparar macrófagos primarios de médula ósea y conjugados de ácido graso-BSA para estudiar la muerte celular inducida por ácidos grasos saturados y su relación con los niveles de ceramida.

Ácidos grasos saturados inducir muerte celular de macrófago asociado de ceramida

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