Análisis de las células inmunes en solo de los nervios ciático y de ganglio de raíz Dorsal de un ratón mediante citometría de flujo

El objetivo general de este procedimiento es obtener suficientes células de los ganglios de la raíz dorsal y los nervios ciáticos de un ratón individual para poder realizar el análisis de citometría de flujo de las células. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el material neuronal periférico genera grandes cantidades de desechos cuando se digiere. La principal ventaja de este método es que se pueden utilizar varios marcadores simultáneamente para identificar varios tipos de células.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de la inflamación y la inmunopatología durante la neuropatía. Si bien este método puede proporcionar información a los modelos murinos, también se puede aplicar a otros organismos, como los nervios humanos y de cerdos, con pequeñas modificaciones. Generalmente, las personas nuevas en el método, tendrán dificultades debido a las grandes cantidades de desechos generados por las digestiones.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de disección y disociación celular son difíciles de realizar porque el material neuronal por ratón es limitante. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando vimos un protocolo que aislaba la célula de cisne del nervio ciático del laboratorio de Steve Lacroix. Para comenzar, prepare el ratón como se describe en el protocolo de texto adjunto y colóquelo con el lado ventral hacia abajo mientras estira las extremidades inferiores.

A continuación, utilice un par de pinzas para diseccionar bilateralmente todos los nervios ciáticos. Comience separando el tejido muscular de la parte superior dorsal del muslo y siga el nervio a lo largo de la columna vertebral. Corta el nervio donde sale de la columna vertebral e inmediatamente por encima de la rodilla en el otro extremo.

A continuación, transfiera los nervios extirpados a un tubo de 1,5 mililitros que contenga 1 mililitro de PBS helado. Guarda los nervios en hielo. A continuación, aísla el ganglio de la raíz dorsal.

Comience cortando las costillas paralelas y cerca de la columna vertebral en ambos lados. A continuación, corte transversalmente la columna vertebral a nivel de los fémures en la cara posterior y cerca del cráneo en la cara anterior. Retire la columna vertebral y use unas tijeras de iris para cortar todo el músculo, la grasa y otros tejidos blandos de la columna vertebral.

A continuación, coloque la columna vertebral con el lado ventral hacia arriba y ábrala comenzando por el extremo caudal deslizando una punta de las tijeras en el canal vertebral en la posición de las 12 en punto y cortando el hueso. Continuando hasta que se corte todo el lomo, repita este procedimiento en la posición de las seis en punto hasta que el lomo se corte por la mitad. Separe las dos mitades de la columna vertebral y luego coloque la muestra bajo un microscopio de disección.

Retire la médula espinal para exponer los nervios espinales, luego localice y extraiga los ganglios de la raíz dorsal lumbar tirando suavemente de la raíz dorsal para llevarla a los canales vertebrales. A continuación, utilice unas tijeras de iris para cortar los nervios y el tejido conectivo alrededor del ganglio de la raíz dorsal. Con pinzas, transfiera los ganglios de la raíz dorsal a un tubo de 1,5 mililitros y guárdelos en hielo.

Localizar los ganglios de la raíz dorsal, extraerlos sin dañarlos y liberarlos del nervio espinal, requiere ejercicio y habilidad. Prepare un medio de digestión, compleméntelo con cien microgramos por mililitro de desoxirribonucleasa y guárdelo en hielo. Luego, agregue 500 microlitros de medio de digestión en cada uno de los tubos con los nervios ciáticos y los ganglios de la raíz dorsal.

Para los nervios ciáticos, corte el material de 15 a 20 veces con un par de tijeras de resorte y luego incube las suspensiones de tejido en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados durante 20 minutos con una agitación suave. Después de la incubación, triture repetidamente la suspensión de las células a través de una punta de pipeta de 1.000 microlitros para disociar mecánicamente cualquier tejido digerido incompletamente. Repita la trituración a través de una punta de pipeta de 1.000 microlitros.

A continuación, incubar la muestra durante 10 minutos adicionales a 37 grados centígrados con una suave agitación. Prepare el tampón FACS helado y utilícelo para enjuagar y remojar una pantalla de acero inoxidable con un tamaño de malla de 140 micras en una placa de Petri de 60 milímetros sobre hielo. Luego, use pinzas romas para sostener el filtro de pantalla de 140 micrones sobre la placa de Petri y pase repetidamente las suspensiones de tejido a través del filtro.

Recoja la suspensión celular de la placa de Petri y transfiérala al mismo tubo de 1,5 mililitros almacenado en hielo. Empuje cualquier tejido digerido incompletamente que permanezca en el filtro mediante trituración repetida con una punta de pipeta de 1.000 microlitros. A continuación, enjuague el filtro de malla dos veces con 500 microlitros de tampón FACS y combínelo con la suspensión celular en el tubo de 1,5 mililitros.

Si una gran cantidad de la muestra se digiere de forma incompleta y pasa a través de la malla metálica, puede producirse una pérdida de células y ser imposible el análisis por citometría de flujo. Centrifugar las suspensiones celulares y desechar el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el pellet de la célula en un mililitro de tampón FACS.

Repita este paso de lavado una vez, volviendo a suspender el pellet de celda final en 150 a 350 microlitros de tampón FACS. Las células ya están listas para la tinción. En la computadora, seleccione los canales apropiados para la detección de los fluoróforos de interés, el caudal apropiado de las muestras y el número total de eventos que se recolectarán por muestra.

El número mínimo de eventos debe ser de un millón. A continuación, cree diagramas de dispersión bajo una hoja de trabajo global de la dispersión lateral A frente a la dispersión directa A, así como para cada fluoróforo de interés frente a la dispersión directa A. Además, cree una vista estadística que mostrará el número de eventos y la intensidad fluorescente media para los fluoróforos seleccionados. Determine la puerta principal, P1, en función del diagrama de dispersión de los controles de tinción solo DAPI.

Adjunte la muestra a la citometría de flujo y haga clic en adquirir. Observe el gráfico DAPI frente a FSC y reduzca el voltaje del canal azul del Pacífico de ADN hasta que la población DAPI+ se haga visible. Con la herramienta de compuerta rectangular, dibuje un cuadro alrededor de DAPI+population.

Esto representa la puerta P1. Seleccione los diagramas de dispersión para cada uno de los fluoróforos y muestre solo los eventos DAPI+. Esto representa la fluorescencia de fondo para cada uno de los fluoróforos.

Usando también la compuerta rectangular, dibuje un cuadro en los diagramas de dispersión para cada uno de los fluoróforos, comenzando en 103 en el eje y. Esta puerta representa la región en la que se deben encontrar eventos positivos para cada uno de los marcadores indicados. Ajuste los voltajes para cada uno de los fluoróforos utilizando los controles de tinción DAPI solamente.

Adjunte la muestra a la citometría de flujo y haga clic en adquirir. Observe la posición de la población DAPI+ para cada uno de los fluoróforos y ajuste los voltajes respectivos de modo que las poblaciones queden fuera de la puerta rectangular. Una vez que se haya configurado el citómetro de flujo, ejecute las muestras y exporte los archivos de dispersión directa para su posterior análisis.

El lavado de la tinción de DAPI antes del análisis por citometría de flujo disminuyó la intensidad fluorescente de los restos no nucleados. Esto permitió que el material en el extremo superior del eje de dispersión directa, que contiene tejido digerido incompletamente, se excluyera en la selección de la población de singletes. En total, se pueden obtener regularmente más de 30.000 singletes de dos nervios ciáticos completos y más de 200.000 singletes de los ganglios de la raíz dorsal.

De los nervios ciáticos, aproximadamente el 5% de los singletes expresaron CD45 en su superficie, mientras que aproximadamente el 5% al 10% lo expresaron en los ganglios de la raíz dorsal, definiendo así a estas células como leucocitos de origen hematopoyético. La mayoría de los singletes CD45 positivos también expresaron MHC clase II de manera gradual. Sin embargo, en los ganglios de la raíz dorsal, CD11b se puede usar para detectar células similares a las microgliales; Esta población de microglía está ausente de los nervios ciáticos.

En el nervio ciático y el ganglio de la raíz dorsal, entre el 2% y el 5% de los singletes expresaron CD68. En los nervios ciáticos, aproximadamente el 60%80% de los macrófagos CD68 positivos expresaron CD206. Mientras que una menor proporción de los CD68 positivos coexpresaron CD206 en el ganglio de la raíz dorsal.

Al realizar este procedimiento, es importante mantener una temperatura constante para garantizar un resultado consistente. Después de su desarrollo, esta técnica permitió a los investigadores en el campo de la diabetes explorar los efectos tóxicos de la estreptozotocina utilizada para inducir diabetes en ratones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la citometría de flujo en el tejido neuronal periférico.

No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes y gafas de seguridad.