Name: Uso de Zinc sináptica histoquímica para revelar las diferentes regiones y láminas en el cerebro en desarrollo y adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprende histoquímica de zinc sináptico para distinguir regiones y capas cerebrales en cerebros de hurón en desarrollo y adultos. Esta técnica simple permite identificar patrones de tinción únicos en neurociencia.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del centro nacional para recursos de investigación (2G12RR03060-26A1); El Instituto Nacional de salud de minorías y disparidades en la salud (8G12MD007603-27) de los institutos nacionales de salud; Profesional personal Universidad de Congreso-ciudad de Nueva York (PSC-CUNY); y Facultad investigación Grant (RFA II) de la Universidad Americana de Sharjah. Agradecemos a Vidyasagar Sriramoju para introducirnos a estos métodos.

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Los autores no tienen nada que revelar.

El presente estudio emplea una técnica histoquímica basada en una versión modificada de la Danscher (1982) método10, por el que localización sináptica cinc puede ser detectado y visualizado en el cerebro. Esencialmente, este método funciona mediante la inyección el animal con el selenito de sodio quelante cinc (Na2SeO3) (15 mg/kg). Después de la inyección, la selenita viaja al cerebro y se une al zinc libre que se localiza en las vesículas presinápticas de zinc que contienen ...

Manchas histológicas se han utilizado tradicionalmente para ayudar en la identificación de áreas corticales en varias especies por revelar las diferencias en características arquitectónicas. El uso combinado de técnicas histoquímicas como gránulos de Nissl, citocromo oxidasa (CO) reactividad o mielina puede resultar fructífero como revelan límites áreas similares en el cerebro adulto. Sin embargo, estas manchas histoquímicas no revelan siempre adecuadamente límites claros entre áreas corticales y las capas del cerebro inmaduro.
En el sistema nervioso central, zinc tiene varias funciones esenciales que incluyen estabilización de la estructura del ADN, actuando como un cofactor enzimático, participa en numerosas funciones reguladoras y actúan como un neuromodulador a través de su presencia en vesículas sinápticas 1. zinc sináptica es única ya que puede visualizarse mediante métodos histológicos, mientras que el cinc protein-bound se puede visualizar2. Esta característica ha sido aprovechada para revelar el patrón de cinc sináptica en diferentes regiones corticales, e histoquímica de zinc sináptica se ha utilizado en varios estudios. Un subconjunto de neuronas glutamatérgica en la corteza cerebral contiene zinc en las vesículas presinápticas en su axon terminales3,4. Estudios histoquímicos han revelado una distribución heterogénea de zinc sináptica en la corteza cerebral5,6,7. Parece haber una distribución areal y laminar diferentes de zinc histochemically reactiva en diferentes regiones corticales (p. ej., visual y Corteza somatosensorial), o en capas (por ejemplo, los niveles de zinc en el supragranular y infragranular capas de la corteza visual primaria son substancialmente más altas que en la capa de entrada talamocorticales IV con niveles relativamente bajos de zinc sináptica)5,8,9. La heterogeneidad en zinc sináptica la coloración observada en la corteza es especialmente ventajosa como facilita la identificación areal y laminar.
Aquí presentamos una descripción detallada de un procedimiento histoquímico de zinc sináptica, que es una versión modificada del Danscher 1982 método10. Este método utiliza selenio inyectado por vía intraperitoneal (IP) en los animales como un agente quelante. La selenita viaja al cerebro a reaccionar con piscinas de zinc libre encuentran en las vesículas de un subconjunto de las sinapsis glutamatérgica en el cerebro. Esta reacción produce un precipitado que se puede ampliar posteriormente el desarrollo plata2,10,11.
Este procedimiento revela patrones laminares y areal de tinción sináptica zinc. Análisis densitométricos pueden utilizarse para evaluar estos patrones cualitativa y cuantitativamente en el cerebro adulto y no maduro para estudiar efectos de otras intervenciones, como manipulaciones sensoriales, ambientales, farmacológicas o genéticas. Además, uno también puede desear evaluar potenciales cambios de desarrollo en la distribución de zinc sináptica en otras estructuras corticales o subcorticales en otros sistemas del modelo. La información cuantitativa que proporciona análisis densitométrico en este método puede ser ventajosa para el siguiente desarrollo del cerebro en el tiempo. Este protocolo proporciona un compañero y otras inmuno - marcadores histoquímicos para revelar los límites laminares y areal.

<table><tbody><tr><td>Euthasol (solución de eutanasia)</td><td>Henry Schein</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214485</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Ketaved)</td><td>Henry Schein</td><td>48858</td><td>100 mg/ml inyectables</td></tr><tr><td>Xilacina (Anased)</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td>100 mg/ml inyectables</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Diluido hasta 4%</td></tr><tr><td>Goma arábiga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Hidroquinona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>Lactato de plata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de pescado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td> <td>(Tipo III, de corazón equino)</td></tr><tr><td>Catalse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C10</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Domino</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406-20</td><td>Se utiliza para la deshidratación antes del montaje de la corredera</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3660-1</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos esmerilados sin subcamas</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3875-FR</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>American Optical Company</td><td>860</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX-60</td><td></td></tr><tr><td>Adope Photoshop</td><td>Adobe Systems, San José, CA</td><td></td><td>Para ensamblar imágenes</td></tr>, <tr><td>el</td><td>software ImageJ Free se puede descargar en http://rsb.info.nih.gov/ij/</td><td></td> <td>Para mediciones densométricas</td></tr>: <tr><td>Bandeja de plástico</td><td>Se puede utilizar</td><td></td> cualquier bandeja de plástico estándar <td>para sumergir los portaobjetos en la solución de revelador</td></tr>. <tr><td>Placa calefactora</td> Se <td>puede utilizar</td><td></td><td></td> cualquier placa calefactora estándar</tr></tbody></table>

uso de zinc sináptica histoquímica para revelar las diferentes regiones y láminas en el cerebro en desarrollo y adulto

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Caracterización de la organización anatómica y funcional del cerebro y desarrollo requiere la identificación precisa de circuitos neuronales distintos y regiones en el cerebro inmaduro y adulto. Aquí describimos un procedimiento de tinción histoquímica de cinc que revela las diferencias en los patrones de tinción entre los diferentes estratos y regiones del cerebro. Otros han utilizado este procedimiento no sólo para revelar la distribución de las neuronas que contienen cinc y circuitos en el cerebro, sino también para delinear correctamente límites areal y laminares en el cerebro en desarrollo y adultos en varias especies. Aquí ilustramos esto procedimiento con imágenes del desarrollo de la coloración y los cerebros de adultos ferret. Revelan un patrón de coloración de zinc que sirve como un marcador anatómico de las zonas y capas y puede usarse confiablemente para distinguir áreas visuales corticales en la corteza visual en desarrollo y adultos. El objetivo principal de este protocolo es presentar un método histoquímico que permite la identificación exacta de las capas y regiones en el cerebro en desarrollo y adultos donde otros métodos no lo hacen. En segundo lugar, en combinación con el análisis densitométrico de la imagen, este método permite evaluar la distribución de zinc sináptica para revelar posibles cambios a lo largo de desarrollo. Este protocolo describe en detalle los reactivos, herramientas y pasos necesarios para teñir sucesivamente secciones del cerebro congelado. Aunque este protocolo es descrito usando tejido de cerebro de ferret, fácilmente puede ser adaptado para su uso en roedores, gatos o monos, así como en otras regiones del cerebro.

Los pasos principales implicados en este protocolo de tinción de secciones del cerebro para zinc sináptica se presentan en un diagrama de flujo en la figura 1. El protocolo puede dividirse en tres fases: 1) perfusión y colección de tejido, preparación de tejido 2) coloración e histoquímica 3) Zinc. Brevemente, durante la primera fase del Protocolo, el animal está anestesiado e inyectado IP con la dosis apropiada de selenito de sodio. Después de un período de ...

Describimos un procedimiento histoquímico que revela características zinc laminar y areal manchas patrones en regiones diferentes del cerebro. El patrón de coloración de zinc puede utilizarse en conjunto con otros marcadores anatómicos distinguir confiablemente las capas y regiones en el cerebro en desarrollo y adultos.

Uso de Zinc sináptica histoquímica para revelar las diferentes regiones y láminas en el cerebro en desarrollo y adulto

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

El objetivo general de este método es realizar la tinción histoquímica en secciones de cerebro congeladas de hurones para ilustrar la utilización de los patrones de tinción sináptica de zinc en la distinción de diferentes regiones y capas en el cerebro en desarrollo y adulto. Este método puede ayudar a responder preguntas clave como las diferencias cualitativas y cuantitativas en el patrón de tinción sináptica de zinc entre diferentes regiones y capas cerebrales. La principal ventaja es que esta técnica es sencilla y fiable, lo que permite identificar diferentes regiones y capas en el cerebro en desarrollo y adulto basándose en patrones de tinción únicos.Aunque este método se ha utilizado para proporcionar información sobre la demarcación de áreas y capas en la corteza visual salvaje, también se puede utilizar para diferenciar capas en diferentes regiones del cerebro de roedores, gatos o primates. Para preparar 200 mililitros de la solución del revelador, agregue 40 gramos de goma arábiga lentamente a 120 mililitros de agua caliente y siga revolviendo con una varilla de vidrio para que se disuelva por completo. Luego se deja enfriar durante unos minutos, luego se filtra a través de seis a ocho capas de tela de gasa en un embudo.A continuación, agregue 5,04 gramos de ácido cítrico y 4,7 gramos de citrato de sodio en 20 mililitros de agua destilada y disuelve para hacer el tampón de citrato. A continuación, añade 1,7 gramos de hidroquinona a 30 mililitros de agua destilada caliente. Agregue 0,22 gramos de lactato de plata a 30 mililitros de agua para hacer una solución de lactato de plata.En el siguiente orden, mezcle las soluciones de goma arábiga, tampón de citrato, hidroquinona y, finalmente, lactato de plata para preparar la solución del revelador y mantenerla en la oscuridad. Para iniciar este procedimiento, inyecte una dosis de 15 miligramos por kilogramo de peso corporal de solución de selenito de sodio, un quelante de zinc, por vía intraperitoneal en el hurón anestesiado. Luego espere de 60 a 90 minutos para que la solución de selenito de sodio llegue al cerebro.A continuación, inyectar una sobredosis de fenobarbital de 100 miligramos por kilogramo por vía intraperitoneal para eutanasiar al animal y esperar varios minutos a que el euthasol actúe. Realizar la perfusión transcárdica en el hurón eutanasiado primero con solución salina normal durante un minuto, y luego con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos. A continuación, utilice un fijador con sacarosa para completar el procedimiento de fijación total en una hora.Use un bisturí para hacer una incisión en la línea media desde la nariz hasta el cuello para exponer el cráneo. Retire delicadamente el cerebro y luego use una hoja de bisturí para separar los hemisferios. A continuación, corte y separe la parte posterior del resto del cerebro y post-fijación durante dos a cuatro horas.Deje que el cerebro se hunda manteniendo el tejido en una solución de sacarosa al 30% en tampón de fosfato 0,1 molar. Después de que el cerebro se hunda, use un micrótomo deslizante de congelación para hacer secciones semitangenciales de 40 micrómetros de grosor a través de la corteza visual. Use un pincel para recoger todas las secciones del cerebro y colóquelas en una caja de aparejos llena de solución salina tamponada con fosfato.Luego, monte rápidamente una o dos series de secciones de cerebro en portaobjetos recubiertos de clara de huevo. Mantenga los portaobjetos a temperatura ambiente durante la noche para que se sequen. Después de que los portaobjetos se hayan secado, sumérjalos en alcohol absoluto durante 15 minutos.A continuación, espere una hora para que los portaobjetos se sequen completamente a temperatura ambiente. Sumerja rápidamente las secciones en una solución de gelatina al 1% durante 10 segundos y luego escurra con cuidado. Mantenga las secciones a temperatura ambiente para que se sequen durante la noche.Use una bandeja de plástico para colocar los portaobjetos uno al lado del otro. A continuación, vierta sobre la solución de revelado y asegúrese de que las diapositivas estén completamente sumergidas en ella. Recuerde revisar las secciones cada 30 minutos para el desarrollo de la reacción.Si los portaobjetos se han manchado adecuadamente, retire las secciones montadas en los portaobjetos de la bandeja y manténgalos en un estante para portaobjetos. Use un plato grande para teñir de vidrio para lavar los portaobjetos dentro de la rejilla de portaobjetos con agua corriente tibia durante 10 minutos para lavar la capa de gelatina y el depósito de plata exterior. Después de secar los portaobjetos a temperatura ambiente, deshidratarlos durante cinco minutos en etanol al 100% y aclararlos durante cinco minutos en xileno.Finalmente, coloque un cubreobjetos con medios de montaje en la guía. Use un microscopio de campo claro para examinar las secciones y tomar fotografías de las áreas de interés. Seleccione secciones teñidas con zinc de fotomicrografías de regiones de interés para elegir aleatoriamente columnas corticales de aproximadamente 450 micrómetros de ancho.En cada región de interés, elija un número adecuado de columnas de muestra de varias secciones cerebrales diferentes. A continuación, transfiera las imágenes de la columna a un software de procesamiento de imágenes. En el software, utilice la herramienta de sección rectangular para abarcar toda la columna cortical.A continuación, utilice la herramienta de inversión para invertir el contraste de la imagen. A continuación, utilice la herramienta Trazar perfil para crear un gráfico bidimensional de las intensidades de píxeles a lo largo de la línea para producir perfiles de densidad óptica a partir de las imágenes. Por último, utilice las opciones de perfil de trazado para convertir el gráfico de perfil de trazado en un perfil vertical.A continuación, haga clic en el perfil de la parcela una vez más. Las fotomicrografías de secciones semitangenciales teñidas con zinc de cerebro de hurón juvenil muestran la caracterización de tejidos sobreteñidos e infrateñidos. El tejido sobreteñido desarrolla un color marrón muy oscuro con una variación laminar inadecuada y una materia blanca densamente teñida.Por el contrario, los tejidos poco manchados desarrollan un color marrón claro con materia blanca mínimamente manchada. Las fotomicrografías de secciones semitangenciales muestran tinción sináptica de zinc en citocromo oxidasa en áreas corticales visuales de un hurón adulto. La intensidad de la tinción sináptica de zinc es alta en las capas supragranular e infragranular de las áreas 17 y 18, mientras que la capa cuatro tiñe ligeramente.Por el contrario, la capa cuatro, de área de 17 y 18, está muy teñida cuando se tiñe para la reactividad de la citocromo oxidasa. Las fotomicrografías columnares muestran la distribución laminar del zinc sináptico en todas las capas corticales con sus valores de densidad óptica normalizados complementarios. Para reflejar los cambios en la tinción sináptica de zinc según la profundidad cortical, se generaron gráficos normalizados de los valores de densidad óptica en cada área cortical visual.El canal presente en los perfiles de las parcelas muestra una baja tinción sináptica de zinc en la capa cuatro de las áreas 17 y 18. Este procedimiento puede ayudar a explicar si hay cambios en el desarrollo y la intensidad de las tinciones en regiones particulares del cerebro a lo largo del tiempo. Esta técnica demostró ser útil para que los investigadores de neuroanatomía exploraran cómo las manipulaciones sensoriales, ambientales, farmacológicas o genéticas pueden afectar la distribución de la tinción sináptica de zinc en el cerebro adulto e inmaduro en una variedad de especies.Gracias por mirar. Buena suerte con tus experimentos.

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Investigación

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Neurociencia

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Recuperación de biocitina y reconstrucciones 3D de interneuronas lleno Hippocampal CA2

La combinación de microscopía electrónica de transmisión y transducción de señales en el útero es un poderoso enfoque para estudiar los cambios morfológicos en la ultraestructura fina del sistema nervioso durante el desarrollo. Este método combinado permite penetraciones profundas en cambios en los detalles estructurales subyacentes de neuroplasticidad con respecto a su representación topográfica.

Evaluación de parámetros de neuroplasticidad ultraestructurales después en la transducción de útero de cerebro de ratón en desarrollo y a la médula espinal

Describimos procedimientos para el procesamiento de tejido cerebral de rata recién nacida para obtener micrografías electrónicas de alta resolución para el análisis morfolométrico de la distribución de vesículas sinápticas en los terminales nerviosos. Los micrográficos obtenidos con estos métodos también se pueden utilizar para estudiar la morfología de un número de otros componentes celulares y sus relaciones estructurales dimensionales.

Preparación del tejido cerebral de rata recién nacida para el análisis Morfolométrico ultraestructural de la distribución de vesículas sinápticas en los terminales nerviosos

La disección crioseccional permite la preparación fresca y congelada del nicho neurogénico más grande en el cerebro murino para un análisis profundo del proteoma cuantitativo. El método es preciso, eficiente y causa una perturbación tisular mínima. Por lo tanto, es ideal para estudiar el microambiente molecular de este nicho, así como otros órganos, regiones y especies.

Disección crioseccional de la zona subependimaria adulta para un análisis cuantitativo preciso y profundo del proteoma

El protocolo presentado describe el uso de microscopía electrónica de transmisión (TEM) para cuantificar los cambios circadianos en la corteza del barril del ratón, centrándose principalmente en el número de sinapsis y la morfología de la columna dendrítica.

Microscopía electrónica de transmisión como técnica de visualización para el análisis de la plasticidad sináptica circadiana en la corteza del barril del ratón

Aprende histoquímica de zinc sináptico para distinguir regiones y capas cerebrales en cerebros de hurón en desarrollo y adultos. Esta técnica simple permite identificar patrones de tinción únicos en neurociencia.

Uso de Zinc sináptica histoquímica para revelar las diferentes regiones y láminas en el cerebro en desarrollo y adulto

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