Asignación simultánea y la cuantificación de ribonucleótidos en el ADN mitocondrial humano

El objetivo general de este experimento es mapear la ubicación de los ribonucleótidos incorporados a nivel de resolución de un solo nucleótido y cuantificar el número de ribonucleótidos presentes en el ADN mitocondrial humano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la integridad del ADN, los mecanismos de replicación del ADN, los mecanismos de reparación del ADN y cómo los defectos en cualquiera de estos mecanismos causan enfermedades. La principal ventaja de este método es que tanto la ubicación como el número de ribonucleótidos incorporados en el ADN mitocondrial se pueden determinar en un solo experimento.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el contenido de ribonucleótidos en el ADN mitocondrial humano, también se puede aplicar para estudiar el ADN nuclear y el contenido de ribonucleótidos en genomas secuenciales de otros organismos modelo. En este experimento se utiliza ADN genómico previamente aislado de células HeLa y descrito en las secciones dos y tres del protocolo de texto. Para digerir el ADN, mezcle cuidadosamente lo siguiente en un tubo de microfuga.

Un microgramo de ADN, cinco microlitros de tampón 10X 3.1, un microlitro de HincII y agua sin nucleasas hasta un volumen final de 50 microlitros. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Cuando se complete la digestión, agregue 1,8 volúmenes de perlas paramagnéticas a cada muestra, cuidadosamente mezcladas por pipeteo, e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Coloque los tubos en una rejilla magnética durante cinco minutos para pellet las cuentas, y luego retire y deseche el sobrenadante. Lave el pellet con 150 microlitros de etanol al 70% durante unos 30 segundos, luego retire y deseche el sobrenadante. Repita el lavado con 200 microlitros de etanol al 70% durante otros 30 segundos.

Seque las muestras a temperatura ambiente durante unos 15 a 20 minutos. A continuación, retire los tubos de la rejilla magnética. Eluir cada gránulo en 45 microlitros de tampón de elución, mezclado mediante pipeteo cuidadoso, e incubar durante cinco minutos.

Granule las perlas en el estante magnético y transfiera 45 microlitros de cada muestra de ADN a un nuevo tubo. A cada 45 microlitros de ADN aislado o purificado, agregue cinco microlitros de hidróxido de potasio de tres molares o cinco microlitros de cloruro de potasio de tres molares, creando un volumen total de 50 microlitros. Las ocho reacciones se resumen en esta tabla.

Incubar en un horno de hibridación a 55 grados centígrados durante dos horas, luego incubar las muestras en hielo durante cinco minutos. Precipitar el ADN añadiendo 10 microlitros de acetato de sodio de tres molares a pH 5,2, y 125 microlitros de etanol frío al 100% e incubar en hielo durante cinco minutos. Granular el ADN centrifugando a 21.000 veces G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante y lave cada gránulo de ADN con 250 microlitros de etanol frío al 70%, vuelva a centrifugar y deseche el sobrenadante. Deje que el pellet se seque en el tubo abierto durante unos cinco a 10 minutos, hasta que el líquido visible se haya evaporado. Por último, agregue 20 microlitros de tampón de elución y deje que la bolita de ADN se disuelva a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Comience este procedimiento preparando la mezcla de reacción para cada muestra como una mezcla maestra. Para cada muestra, agregue 2,5 microlitros de tampón de reacción de polinucleótido quinasa T4 10x, 2,5 microlitros de ATP y un microlitro de tres polinucleótidos quinasa T4 fosfatasa principal. Transfiera 19 microlitros de cada muestra de ADN a un nuevo tubo de 200 microlitros y desnaturalice a 85 grados centígrados en un termociclador durante tres minutos.

A continuación, enfríe las muestras de ADN en hielo y añada seis microlitros de la mezcla de reacción preparada a cada muestra. La incubación de las mezclas de reacción se produce a 37 grados centígrados durante 30 minutos, seguido de 65 grados centígrados durante 20 minutos para detener la reacción. Purifique el ADN usando perlas paramagnéticas, como se demostró anteriormente, pero eluya con 14 microlitros de tampón de elución.

Prepare la mezcla de reacción como una mezcla maestra de antemano, que contenga lo siguiente para cada muestra. Cinco microlitros de tampón de reacción de ARN ligasa T4 10x, cinco microlitros de cloruro de hexamminacobalto(III), 0,5 microlitros de oligonucleótido ARC140, 0,5 microlitros de ATP y 25 microlitros de PEG 8000 al 50%. Mezclar bien pipeteando.

Transfiera 13 microlitros de cada ADN purificado a un nuevo tubo de 200 microlitros y desnaturalice a 85 grados centígrados en un termociclador durante tres minutos. Enfríe el ADN en hielo y luego agregue 36 microlitros de mezcla de reacción a cada muestra, mezcle por pipeteo y centrifugue brevemente. Agregue un microlitro de ARN ligasa T4 a cada reacción, mezcle mediante pipeteo y centrifugue brevemente.

Incube las muestras a temperatura ambiente en la oscuridad durante la noche. Cuando se complete la ligadura de ADN de una sola hebra, purifique el ADN como se demostró anteriormente, pero use 0,8 volúmenes de cuentas paramagnéticas y granule las cuentas durante 10 minutos. Eluir en 20 microlitros de tampón de elución y transferir 20 microlitros de cada muestra de ADN a un nuevo tubo de 200 microlitros.

Repetir la purificación con 0,8 volúmenes de perlas paramagnéticas y eluir en 14 microlitros de tampón de elución. Para cada muestra, prepare la mezcla de reacción como una mezcla maestra que consta de dos microlitros de tampón de reacción de ADN polimerasa T7 10x, dos microlitros de ARC76/77, dos microlitros de dNTP y 0,8 microlitros de BSA. Transfiera 12,8 microlitros de ADN purificado a un nuevo tubo de 200 microlitros y desnaturalice a 85 grados centígrados en un termociclador durante tres minutos.

Enfríe el ADN en hielo y luego agregue 6,8 microlitros de mezcla de reacción a cada muestra, mezcle por pipeteo, centrifugue brevemente e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Añadir 0,4 microlitros de ADN polimerasa T7 a cada reacción e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de purificar el ADN con perlas paramagnéticas, eluir en 11 microlitros de tampón de elución.

Para comenzar la amplificación por PCR, prepare la mezcla de reacción por separado para cada muestra en un nuevo tubo de 200 microlitros que consta de 7,5 microlitros de ARC49, 7,5 microlitros de cebador de índice único y 25 microlitros de mezcla lista de inicio en caliente 2X. Agregue 10 microlitros de muestra de ADN a cada reacción. Amplíe la biblioteca utilizando las siguientes condiciones.

Desnaturalización a 95 grados centígrados durante 45 segundos, seguido de 18 ciclos de 98 grados centígrados durante 15 segundos, 65 grados centígrados durante 30 segundos, 72 grados centígrados durante 30 segundos y terminando con una elongación final a 72 grados centígrados durante dos minutos. Mantenga las muestras a cuatro grados centígrados después de la amplificación. Purifique las bibliotecas como se describe en el protocolo de texto y eluya en 20 microlitros de tampón TE.

Determine la calidad y el tamaño medio de los fragmentos de cada biblioteca mediante un sistema de electroforesis digital. Se muestran los resultados representativos de los perfiles de biblioteca adecuados después del tratamiento con hidróxido de potasio o cloruro de potasio. Después de calcular la concentración de cada biblioteca, extraiga cantidades molares iguales de hasta 24 bibliotecas amplificadas con diferentes cebadores de índice para la secuenciación, como se describe en las secciones nueve y 10 del protocolo de texto.

Añadir tampón TE hasta un volumen final de 25 microlitros y una concentración de 10 nanomolares. Después de la secuenciación, realice el análisis de datos bioinformáticos como se especifica en la sección 11 del protocolo de texto. Estos gráficos muestran las lecturas resumidas en todos los sitios de HincII en el ADN mitocondrial humano de hebra ligera y gruesa después del tratamiento con cloruro de potasio.

Alrededor del 70% de todos detectaron cinco extremos primarios localizados en los sitios de corte, lo que demuestra la alta eficiencia de la digestión de HincII. El tratamiento de las bibliotecas con hidróxido de potasio para hidrolizar el ADN en los ribonucleótidos incrustados disminuye el número de lecturas en HincII a aproximadamente el 40%El número relativo de lecturas en el ADN mitocondrial y nuclear revela diferencias en la cobertura e ilustra la importancia de una normalización adecuada para eliminar el sesgo de la hebra. La normalización de los recuentos de lecturas a HincII proporciona una medida cuantitativa del número de ribonucleótidos por genoma mitocondrial en la hebra pesada o ligera.

Las lecturas después del tratamiento con hidróxido de potasio para cada ribonucleótido, normalizadas a la composición de la secuencia de cada cadena, muestran una proporción diferente a uno, lo que indica una distribución no aleatoria de las lecturas y sugiere un patrón de ribonucleótidos distinto y una alta calidad de biblioteca. La normalización de las lecturas en los sitios de ribonucleótidos incrustados a las de los sitios HincII, así como al contenido de nucleótidos del genoma, genera una medida cuantitativa de la cantidad de cada ribonucleótido que se incorpora por cada 1.000 bases complementarias. Una vez dominado, este protocolo se puede hacer en dos días si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe mantener el ADN muy intacto y evitar introducir roturas de doble cadena durante la preparación de la biblioteca. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos para confirmar los datos de cuantificación de ribonucleótidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar bibliotecas para el mapeo y la cuantificación de ribonucleótidos y ADN mediante la secuenciación de próxima generación.

No olvide que trabajar con productos químicos como el hidróxido de potasio puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de protección para los ojos y guantes al realizar este procedimiento.