Visualización de axón talamocorticales ramificación y sinapsis formación en Organotypic Cocultures
28 de marzo de 2018
Este protocolo describe un método para la proyección de imagen simultánea de talamocorticales axon ramas y sinapsis formación en organotypic cocultures del tálamo y corteza cerebral. Axones individuales talamocorticales y sus terminales presinápticos se visualizan mediante una técnica de electroporación unicelular con DsRed y synaptophysin tagged GFP.
El objetivo general de este método es estudiar los cambios morfológicos dinámicos de la ramificación de los axones y la formación de sinapsis en la proyección talamocortical. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, como la formación de nuevos circuitos neuronales. La principal ventaja de esta técnica es la observación simultánea del crecimiento de los axones y la formación de sinapsis en células vivas individuales.
Este método puede proporcionar información sobre la relación entre la ramificación de los axones y la formación de sinapsis en las proyecciones talamocorticales. También se puede aplicar a otros circuitos neuronales, como la conexión intrínseca en la corteza cerebral. Para comenzar este procedimiento, esterilice todos los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70% durante 10 minutos o más.
A continuación, diseccione rápidamente todo el cerebro de una rata del segundo día posnatal bajo anestesia helada. Luego, coloque el cerebro en una placa de Petri de 100 milímetros que contenga 40 mililitros de solución fría de sal equilibrada de Hank. Bajo un microscopio binocular, extraiga la materia pia cuidadosamente con pinzas finas y corte la corteza visual y somatosensorial primaria en rodajas de 300 a 400 micras de grosor con tijeras microquirúrgicas.
A continuación, transfiera las rodajas corticales al filtro de membrana del inserto de cultivo utilizando una pipeta de plástico desechable. Ajuste las posiciones de las rodajas cerca del centro del inserto de cultivo con la pipeta de plástico desechable y elimine el exceso de medio del inserto. Mantenga las rodajas en el medio de cultivo que contiene suero a 37 grados centígrados y cultívelas solas durante un día antes de colocar un bloque talámico de un embrión E15 junto a él.
Ajuste el nivel del medio ligeramente por debajo de la superficie de la rebanada, de modo que las rebanadas puedan recibir un suministro suficiente tanto del gas como del medio. Esto es crucial para la viabilidad de las lonchas. En este paso, haga los capilares de vidrio con un extractor de electrodos.
A continuación, rompa las puntas de los capilares de vidrio para la inyección de plásmidos. Para las pipetas de electrodos, esmerile y pula las puntas de los capilares de vidrio con papel de lija. Y luego pulirlos al fuego para lograr un diámetro interior de 50 a 200 micras.
A continuación, coloque la pipeta de electrodos y la pipeta de expulsión en los manipuladores. Transfiera cinco microlitros de solución de plásmido a una placa de Petri. A continuación, introduzca la solución en la pipeta de electrodos con acción capilar.
Inserte el electrodo de 0,2 milímetros de diámetro en la pipeta de electrodos. Después de conectar la pipeta de expulsión a una jeringa de un mililitro con un tubo de plástico, vuelva a transferir cinco microlitros de solución plásmida a una placa de Petri. A continuación, introduzca lentamente la solución en la pipeta de expulsión con la jeringa.
A continuación, transfiera el cocultivo a la etapa de electroporación e inserte el electrodo de un milímetro de diámetro en el medio de cultivo. A continuación, coloque la pipeta de expulsión en el bloque talámico cultivado. Empuje la jeringa manualmente después de que la punta toque la superficie del bloqueo talámico.
Coloque la pipeta de electrodos en el bloque talámico inmediatamente después de la retracción de la pipeta de expulsión. Ahora, entrega los pulsos eléctricos. Controle la amplitud y el número de trenes en el osciloscopio.
A continuación, retraiga la pipeta de electrodos y devuelva la placa a la incubadora. Para observar la muestra, coloque la placa de cultivo en la platina de un microscopio confocal vertical equipado con dos juegos de filtros para EGFP y DsRed. A continuación, tome imágenes de 10 a 25 secciones ópticas, en pasos de uno a siete micras, con un objetivo de larga distancia de trabajo de 20x.
Seleccione axones marcados que se distingan individualmente, que expresen tanto DsRed como Syp-EGFP. Aquí se muestra un cocultivo organotípico de cortes talámicos y corticales después de 12 DIV. Aquí hay una imagen ampliada de la región en caja.
Y aquí hay una célula talámica marcada con DsRed que extiende un axón hacia el corte cortical y forma ramas en las capas superiores. Estas imágenes muestran el axón talamocortical marcado con DsRed y los puntos Syp-EGFP. Se observó una acumulación discreta de Syp-EGFP a lo largo de un solo axón talamocortical.
Los plásmidos DsRed más Syp-EGFP se introdujeron en células talámicas cultivadas en un DIV mediante electroporación. Este axón fue fotografiado diariamente durante cuatro días. La ramificación de los axones y la formación de sinapsis fueron dinámicas, con adición y eliminación.
Siguiendo estos procedimientos, se puede realizar electroporación con genes interesantes junto con Syp-EGFP y DsRed para investigar el papel del gen en la ramificación de los axones y la formación de sinapsis. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiología exploren los mecanismos de los cambios dinámicos de los circuitos neuronales.
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Resumen
Este estudio presenta un protocolo para la obtención simultánea de imágenes del crecimiento axonal y la formación de sinapsis en cultivos coorganotípicos del tálamo y la corteza cerebral. Se centra en los cambios morfológicos dinámicos de la proyección talamocortical, aportando información sobre la formación de nuevos circuitos neuronales y la relación entre el crecimiento axonal y el desarrollo sináptico.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Neurobiología
- Biología celular
Antecedentes
- Las proyecciones talamocorticales desempeñan un papel fundamental en el procesamiento sensorial.
- Comprender la ramificación axonal y la formación de sinapsis es esencial para obtener conocimientos sobre la formación de circuitos neuronales.
- Los métodos actuales tienen limitaciones para observar simultáneamente estos cambios a nivel celular.
- El estudio mejora las técnicas de imagen en contextos de células vivas.
Objetivo del estudio
- Investigar los cambios morfológicos dinámicos durante la formación de ramificaciones axonales y la creación de sinapsis.
- Proporcionar un método que permita la observación de células individuales vivas en cultivo conjunto.
- Evaluar la relación entre el crecimiento axonal y el desarrollo sináptico en neuronas talamocorticales.
Métodos Utilizados
- Se utilizaron cultivos cocultivos organotípicos de cortes talámicos y corticales.
- Se empleó tejido de rata del día postnatal dos para crear el modelo biológico.
- Se realizó electroforesis para introducir marcadores fluorescentes destinados a la obtención de imágenes.
- Los cultivos se mantuvieron a 37 grados Celsius y se observaron en puntos temporales específicos del desarrollo.
- La obtención de imágenes se llevó a cabo mediante un microscopio confocal para capturar la dinámica axonal.
Resultados principales
- Se observaron cambios dinámicos en la ramificación axonal y la formación de sinapsis, destacando la plasticidad en las proyecciones talamocorticales.
- Se notó una acumulación discreta de marcadores sinápticos a lo largo de los axones, lo que indica un desarrollo sináptico en curso.
- La técnica permitió la observación en tiempo real de cambios morfológicos en células individuales.
- Los hallazgos enfatizan el potencial para investigar los roles de los genes en la dinámica de axones y sinapsis.
Conclusiones
- Este estudio demuestra un método novedoso para explorar la dinámica y plasticidad de los circuitos neuronales.
- Proporciona información sobre el acoplamiento entre el crecimiento axonal y la formación de sinapsis.
- Los hallazgos tienen implicaciones para comprender los mecanismos de conectividad neuronal y plasticidad en la salud y la enfermedad.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la visualización simultánea del crecimiento axonal y la formación de sinapsis en circuitos neuronales vivos, abordando una brecha mecanicista clave en la validación de dianas en el desarrollo neurológico. Al proporcionar datos dinámicos con resolución a nivel de célula individual sobre la plasticidad estructural, este método respalda la confianza predictiva en las primeras etapas del descubrimiento, donde la reducción de riesgos mecanicistas de dianas sinápticas es fundamental. El enfoque ofrece continuidad traslacional desde la comprensión mecanicista hasta la evaluación preclínica de fenotipos a nivel de circuito en modelos de enfermedades neuropsiquiátricas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas que relacionan la morfología axonal con la conectividad sináptica en las vías talamocorticales.
- Valor operativo: Conserva la arquitectura laminar y la viabilidad neuronal para la observación longitudinal de cambios estructurales dinámicos.
- Valor científico: Facilita la reducción de riesgos biológicos al aclarar las relaciones causales entre el crecimiento estructural y la sinaptogénesis funcional.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas y multiplexadas de la ramificación axonal y la acumulación de marcadores presinápticos para la estandarización de ensayos.
- Valor operativo: Permite la preparación de sistemas biológicos validados para cribados de compuestos posteriores en vías del desarrollo neurológico.
- Valor operativo: Facilita flujos de trabajo de imagen escalables y reproducibles, compatibles con lecturas fluorescentes multiplexadas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con sistemas relevantes para la enfermedad en los que la disconectividad tálamo-cortical contribuye a fenotipos sensoriales y cognitivos.
- Valor operativo: Proporciona continuidad desde la detección mecanicista en fase de descubrimiento hasta la validación preclínica de la recuperación a nivel de circuito.
- Valor científico: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de la dinámica estructural con resultados sinápticos funcionales.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir la observación directa de la plasticidad estructural previa a los resultados de los ensayos funcionales en modelos de circuitos neuronales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre genes que regulan la dinámica de ramificación axonal y la formación de sitios sinápticos en circuitos vivos.
- Selección: Proporciona datos morfológicos y de púntos fluorescentes cuantitativos listos para ensayos, para el perfilado de efectos de compuestos.
- Análisis: Permite la comparación estadística de la frecuencia de ramificación y la densidad de sinapsis entre condiciones experimentales a lo largo del tiempo.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos mecanicistas con modelos preclínicos de trastornos del neurodesarrollo que presentan alteraciones en las vías talamocorticales.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de imagenología reutilizable para la evaluación multiparamétrica de la neuritogénesis y la sinaptogénesis en diversos modelos neuronales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad en las relaciones entre estructura y función durante el ensamblaje de circuitos neuronales.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de imágenes de doble canal para un seguimiento consistente y longitudinal de la dinámica axonal y sináptica.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar evidencia mecanicista sobre la interacción con las vías de plasticidad estructural.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en efectos validados sobre el acoplamiento axón-sinapsis en circuitos relevantes para humanos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el mantenimiento de cultivos cocultivos organotípicos, electroforesis y microscopía confocal.
- Depende de instrumentos quirúrgicos estériles, preparación de micropipetas y calidad del ADN plasmídico para una transfección eficiente.
- Necesita control ambiental a 37°C y medio con suero para preservar la viabilidad del corte durante varios días.
- La adaptación a circuitos neuronales alternativos requiere validación de la compatibilidad del tejido y de la eficiencia de la electroforesis.
- Las limitaciones prácticas incluyen la variabilidad en la eficiencia de transfección y la necesidad de análisis de imágenes posterior para cuantificar la dinámica de ramificaciones y puntos.
