Name: Visualización de axón talamocorticales ramificación y sinapsis formación en Organotypic Cocultures (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Aprende a visualizar la ramificación axonal talamocortical y la formación de sinapsis en cocultivos organotípicos de rata. Este método permite observar cambios morfológicos dinámicos en células vivas individuales.

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También agradecemos a Gabriel Hand para lectura crítica.

Todos los experimentos se realizaron según las pautas establecidas por los comités de bienestar animal de la Universidad de Osaka y de la sociedad de Neurociencia de Japón.
1. Organotypic cocultures del tálamo y corteza cerebral
Nota: Para el procedimiento detallado, consulte las publicaciones originales7,8,13. Todos los procedimientos deben realizarse bajo condiciones estériles. Las ratas de Sprague-Dawley (SD) se utilizan para cultivos neuronales.
<ol><li>
Preparaciones de reactivos Nota: Volúmenes de los reactivos siguientes son para el cerebro de una rata.<ol>
<li>
Preparación 10 x suplemento modificado de N2 13: insulina (50 μg/mL), progesterona (200 nM), hidrocortisona (200 nM), selenito de sodio (300 nM), transferrina (1 mg/mL), putrescina (1 mM), glucosa (60 mg/mL)</li>
		<li>
Preparar medio de cultivo que contiene suero (10 mL): 85% DMEM/F12, suplemento de N2 de 10 x modificado de 10%, 5% de suero bovino fetal (FBS)</li>
		<li>
Preparar medio de cultivo libre de suero (20 mL): 90% DMEM/F12, 10% x 10 modificado N2 suplemento</li>
		<li>Preparar la solución de colágeno de cola de rata (0,5 mL). En Resumen, tomar fibras sensibles de una cola de rata bajo condiciones estériles e incubar durante una noche en solución de ácido acético. Después de la centrifugación, el sobrenadante (unos pocos mg/mL) de recoger y almacenar en un refrigerador13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de platos típicos de la cultura
	<ol>
<li>Coloque una membrana en una placa de Petri de 35 mm.</li>
		<li>Añadir 40-50 μL de solución de colágeno de cola de rata a la membrana y distribuir la solución de colágeno alrededor del centro.</li>
		<li>Secar la membrana totalmente en una mesa de trabajo limpia.</li>
		<li>Poner 1.5-2 mL de medio de cultivo que contiene el suero en el plato, para que la membrana se empapa con el medio.</li>
		<li>Coloque la placa de cultivo en un incubador (37 ° C, aire humidificado de 95% y 5% CO2) antes de la galjanoplastia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de láminas corticales
	<ol>
<li>Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70% durante 10 minutos o más.</li>
		<li>Diseccionar el cerebro entero rápidamente de un día postnatal (P) 2 rata bajo anestesia helada (inmersa en pedacitos de hielo por unos minutos).</li>
		<li>Lugar del cerebro en un 100 mm plato de Petri que contiene 100 mL de frío Hanks había equilibrada solución de sal.</li>
		<li>Saque el asunto de pia el cerebro con pinzas finas y cortar rebanadas corticales (300-400 μm de espesor) de la corteza visual y somatosensorial con tijeras de microcirugía (para detalles, ver figura 1). Nota: El espesor de las láminas corticales se estima aproximadamente por la escala de redes bajo un microscopio binocular. Nota: Alternativamente, se pueden hacer rebanadas corticales con un vibratome bajo condiciones estériles.</li>
		<li>La transferencia de unas láminas corticales en la inserción de la membrana con una pipeta de plástico desechable.</li>
		<li>Ajustar las posiciones de las láminas cerca del centro de la cultura de inserción con una pipeta Pasteur fuego pulido (para más detalles, vea8,13) y quitar exceso medio de la inserción. Nota: Ajuste el nivel del medio ligeramente por debajo de la superficie de las rodajas para que las láminas pueden recibir un suministro suficiente del gas y el medio. Esto es crucial para la viabilidad celular.</li>
		<li>Mantener las rebanadas en el medio de cultivo que contiene el suero a 37 ° C en un ambiente humidificado 95% aire y 5% CO2y cultura solo para un día antes de un bloque talámico se toma y se coloca junto a él.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de bloques talámicos
	<ol>
<li>Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70% durante 10 minutos o más.</li>
		<li>Anestesiar una rata embarazada (embrionario día 15) por inyección intraperitoneal de pentobarbital (50 mg/kg) que contiene anestésico.</li>
		<li>Diseccionar cada embrión de los cuernos uterinos y coloque los embriones en una placa de Petri que contiene 100 mL de solución salina equilibrada fría madejas de 100 mm.</li>
		<li>Microscopio binocular, quitar el cerebro de cada embrión y cortar bloques talámicos que contienen principalmente el ventrobasal núcleo articulado lateral y complejo (aproximadamente 0,5 mm x 3)7 con unas tijeras de microcirugía (ver figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
La cultura y mantener organotypic cocultures
	<ol>
<li>Con una pipeta Pasteur, colocar el bloque talámico junto a la superficie ventricular de la laminar cortical que se ha colocado en el filtro de membrana.</li>
		<li>Mantener las cocultures en el medio de cultivo que contiene el suero a 37 ° C en un ambiente de aire humidificado de 95% y 5% CO2.</li>
		<li>La mitad del medio con el medio de cultivo libre de suero de intercambio después de dos días en la cultura. Después de eso, cambiar el medio cada 2-3 días. Nota: El nivel del medio debe medirse después del cambio de medio, ya que es importante para la supervivencia de la célula.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. electroporación
Todos los procedimientos deben realizarse bajo condiciones estériles.
Nota: Realizar electroporación un día después de la preparación de los bloques talámicas para evitar desprendimiento de los bloques.
<ol><li>
Plásmidos
	<ol>
<li>Hacer una mezcla de plásmidos como sigue: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL. Nota: Purificar el ambos plásmidos utilizando el kit de Maxiprep libre de endotoxinas y se disuelven en una solución salina equilibrada de Hanks.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Instalación de equipos de electroporación Los instrumentos eléctricos tales como un estimulador y un aislador deben conectarse como se indica en la figura 2.<ol>
<li>Conectar el estimulador para el aislador bifásico.</li>
		<li>Conectar un electrodo (un alambre de plata 0,2 mm de diámetro) a la terminal negativa del seccionador.</li>
		<li>Un electrodo (un alambre de plata 1 mm de diámetro) se conectan en serie a un resistor Ω 100 y el terminal positivo de su aislador.</li>
		<li>Conectar el amplificador al osciloscopio para monitorear si las corrientes eléctricas pasan a través de la resistencia mediante la medición de la tensión con el amplificador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de pipetas de vidrio Nota: Se utilizan dos tipos de pipetas de vidrio para la eyección de la solución de plásmido y la aplicación de pulsos eléctricos.<ol>
<li>Hacer las pipetas de Capillares de vidrio de con un tirador de electrodo.</li>
		<li>Romper la punta de la pipeta de la eyección (el diámetro de la punta debe ser 20-50 μm).</li>
		<li>Moler y para pulir la punta de la pipeta de electrodo con papel de lija seguido fuego pulido (el diámetro interior debe ser de 50-200 μm). Nota: La punta del electrodo debe ser plana y lisa, ya que toca directamente el tejido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedimiento de la electroporación
	<ol>
<li>Conecte las pipetas de la eyección y el electrodo a los manipuladores.</li>
		<li>Inserte un alambre de plata (0,2 mm de diámetro) con la pipeta de electrodo.</li>
		<li>Coloque la pipeta de expulsión a una jeringa de 1 mL con un tubo de plástico.</li>
		<li>Tomar > 5 μL de solución de plásmido en la pipeta de la eyección por la succión de la jeringa.</li>
		<li>Poner el cocultivo en la etapa de electroporación e Inserte el electrodo de diámetro de 1 mm en el medio de cultivo.</li>
		<li>Coloque la pipeta de eyección en el explante talámica.</li>
		<li>Empujar la jeringa manualmente después de que la punta toque la superficie del bloque talámica. Nota: Acerca de 0,5 μL del plásmido solución se utiliza generalmente por un bloque talámico.</li>
		<li>Coloque la pipeta del electrodo en el bloque talámico inmediatamente después de la retracción de la pipeta de expulsión.</li>
		<li>Entregar pulsos eléctricos (50-400 μA, trenes de 3 a 5 de 200 pulsos cuadrados de 1 ms de duración a 200 Hz). Controlar la amplitud y el número de trenes en el osciloscopio. Nota: La amplitud de las corrientes eléctricas depende del diámetro interior de un electrodo pipeta13.</li>
		<li>Retraiga la pipeta de electrodo y vuelva el plato a la incubadora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Observación microscópica
	<ol>
<li>Poner la placa de cultivo en una etapa microscópica de un microscopio confocal vertical equipado con dos conjuntos de filtro para la EGFP (excitación, 488 nm, emisión, 515 nm) y DsRed (excitación, 514 nm, emisión, 565 nm).</li>
		<li>Tomar imágenes de secciones ópticas de 10-25 en tamaños de 1 a 7 μm-paso con un 20 X trabajo larga distancia objetivo. Seleccione individualmente distinguibles etiquetados axones que expresan DsRed y SYP-EGFP. Nota: El área observado es aproximadamente de 0,7 x 0,7 mm (correspondiente a 1024 x 1024 píxeles, es decir, 0.68 μm/píxeles).</li>
		<li>Capturar imágenes cada 24 h para la proyección de imagen de diario. Completa en 10 min a temperatura ambiente y retomar las culturas de la incubadora. Para la proyección de imagen de lapso corto intervalo de tiempo, conservar el cultivo en un compartimiento de la cultura, que mantiene que el ambiente de humidificado 95% aire y 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kageyama, G. H., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+geniculocortical+projections+to+visual+cortex+in+rat%3A+evidence+early+ingrowth+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis.</a> J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).</li>
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<li>Espinosa, J. S., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of the primary visual cortex.</a> Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biol. 3 (8), 272(2005).</li>
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<li>Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+laminar+specificity+and+activity-dependent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching.</a> J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).</li>
<li>Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+method+for+axon+tracing+in+cultured+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices.</a> Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).</li>
<li>Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-dependent+and+independent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching+are+regulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity.</a> Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).</li>
<li>Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282233732_Electroporation_Method_for_Mammalian_CNS_Neurons_in_Organotypic_Slice_Cultures">Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures.</a> Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).</li>
<li>Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regional+specificity+for+connections+formed+between+thalamus+and+cortex+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture.</a> Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+mechanism+by+polysialic+acid+for+lamina-specific+branch+formation+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons.</a> J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+factors+regulating+lamina-specific+growth+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons.</a> J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).</li>
<li>Ohnami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RhoA+in+activity-dependent+cortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching.</a> J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).</li>
<li>Yamada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pre-+and+postsynaptic+activity+in+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo actual es también una poderosa herramienta para el estudio de aspectos del desarrollo del crecimiento de axones que de la proyección de TC11. Por ejemplo, una combinación de cultura sector cortical y la técnica de electroporación permite visualizar cada morfología axonal de neuronas corticales y larga observación9,18.
Mediante el protocolo actual, el papel de genes interesantes en la formación de ra...

La proyección talamocorticales (TC) en el cerebro mamífero es un sistema conveniente para investigar la dirección del axon y mecanismos de focalización. Durante el desarrollo, en la placa cortical y ramas de forma y sinapsis preferentemente en capa IV de las áreas sensoriales primarias en la corteza cerebral1,2crecen axones sensoriales de TC. Incluso después del establecimiento de las conexiones fundamentales, cenadores axonales y terminales sinápticos son remodelados según cambios ambientales3,4. Sin embargo, cómo dinámicamente se altera la morfología de axon de TC es mal entendida. Una de las principales razones es la falta de una adecuada técnica para observar los cambios estructurales a nivel unicelular. Aunque los acontecimientos recientes en microscopía, tales como microscopia de dos fotones, han permitido la observación directa de las neuronas corticales de vivo en vivo, hay limitaciones todavía técnicas para capturar el total TC trayectorias5, 6. por lo tanto, en vitro métodos para la proyección de imagen viva de axones de TC serían proporcionar herramientas poderosas para el análisis estructurales de la formación de ramas y sinapsis axón.
Nuestro grupo por primera vez estableció un método de cultura estática de la rebanada con membrana permeable7. Usando este método, una porción cortical de la rata fue morfología con un bloque sensorial talámico, y conexiones de TC de lámina específica fueron recapituladas en este organotypic cocultures7,8. Etiquetado escasa con una proteína fluorescente más nos permitió observar crecimiento del axon de TC y rama formación9,10,11. Recientemente, hemos desarrollado un novedoso método para la proyección de imagen simultánea de ramificación y formación de sinapsis de axones individuales de TC en el organotypic cocultures12. Para visualizar simultáneamente TC axones y sitios presinápticos, DsRed y synaptophysin tagged EGFP (SYP-EGFP) fueron co transfected en un pequeño número de neuronas talámicas por electroporación de la organotypic cocultivo. El método actual facilita el análisis morfológico de los axones de TC y permite la observación a largo plazo, que puede utilizarse para demostrar la relación causal entre formación de ramas y sinapsis axón.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)</td><td>Nissui</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396-03</td><td>Hyclone</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma& nbsp;</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sodio</td><td>Wako Pure Industrias Químicas</td><td>192-10843</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>16806-25</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri de 35 mm</td><td>Inserto Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Millicell-CM</td><td>Millipore</td><td>PICMORG50</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri de 100 mm</td><td>BIO-BIK</td><td>I-90-20</td><td>placa de Petri estéril</td></tr><tr><td>HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>K210006</tr><tr><td>Pipetas de plástico estériles</td><td></td> desechables <td>202-IS</td><td>pipetas de transferencia estériles</td></tr><tr><td>Capilar de vidrio: OD 1,2 mm</td><td>Narishige</td><td>&nbsp; G-1,2</td><td>diámetro interior, 1,2 mm</td></tr><tr><td>Alambre de plata: 0,2 y 1 mm&nbsp;</td><td>Nilaco</td><td>AG-401265 (diámetro, 0,2 mm), AG-401485 (diámetro, 1,0 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador&nbsp;</td><td>A.M.P.I</td><td>Master 8</td><td></td></tr><tr><td>Aislador bifásico&nbsp;</td>Amplificador <td>BSI-2</td><td></td>de <td>BAK ELECTRONICS</td></tr><tr><td>&NBSP;</td>Osciloscopio <td>modelo 1800</td><td></td>de <td>A-M Systems</td></tr><tr><td></td><td>Manipulador Hitachi</td><td>VC-6723</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Micromicroscopio</td><td>estereoscópico Narishige</td><td>MO-10</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td>Soporte universal&nbsp;</td><td>Sistema</td> de iluminación de luz <td>Olympus SZ-STU2</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>LG-PS2, LG-DI, HLL301</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de electrodos&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Nikon</td><td>Digital eclipse C1 láser</td><td></td></tr><tr><td>x20 objetivo</td><td>Nikon</td><td>ELWD 20x/0.45</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de cultivo</td><td>Tokai Hit</td><td>UK A16-U</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley (SD) rata</td><td>Japón SLC y Nihon-Dobutsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de microcirugía</td><td>Natsume&nbsp;</td><td>MB-54-1</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de axón talamocorticales ramificación y sinapsis formación en organotypic cocultures

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Formación de ramas y sinapsis axón son procesos cruciales para el establecimiento de circuitos neuronales precisos. Durante el desarrollo, los axones sensoriales talamocorticales (TC) forman ramas y sinapsis en capas específicas de la corteza cerebral. A pesar de la evidente correlación espacial entre formación de ramas y sinapsis axón, se entiende mal la relación causal entre ellos. Para solucionar este problema, recientemente se desarrolló un método para la proyección de imagen simultánea de formación de ramas y sinapsis de axones individuales de TC en organotypic cocultures.
Este protocolo describe un método que consiste en una combinación de un cocultivo organotypic y electroporación. Cocultures Organotypic del tálamo y corteza cerebral facilitan la manipulación de genes y la observación de procesos axonales, preservar estructuras características tales como configuración laminar. Dos distintos plásmidos codifican DsRed y synaptophysin tagged EGFP (SYP-EGFP) fueron co transfected en un pequeño número de neuronas talámicas por una técnica de electroporación. Este método permitió visualizar las morfologías individuales axonales de neuronas del TC y sus sitios presinápticos simultáneamente. El método también permitió la observación a largo plazo que reveló la relación causal entre formación de ramas y sinapsis axón.

El experimento descrito aquí tiene como objetivo revelar la relación entre formación de ramas y sinapsis de axones TC. Para visualizar simultáneamente axonales trayectorias y ubicaciones de los sitios presinápticos, sola o algunas células talámicas en organotypic cocultures fueron transfectadas con dos plásmidos codifican SYP-EGFP y DsRed mediante electroporación. Durante la segunda semana de la cultura, axones TC individualmente distinguibles claramente fueron etiquetados por DsRed (<str...

Este protocolo describe un método para la proyección de imagen simultánea de talamocorticales axon ramas y sinapsis formación en organotypic cocultures del tálamo y corteza cerebral. Axones individuales talamocorticales y sus terminales presinápticos se visualizan mediante una técnica de electroporación unicelular con DsRed y synaptophysin tagged GFP.

Visualización de axón talamocorticales ramificación y sinapsis formación en Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

El objetivo general de este método es estudiar los cambios morfológicos dinámicos de la ramificación de los axones y la formación de sinapsis en la proyección talamocortical. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, como la formación de nuevos circuitos neuronales. La principal ventaja de esta técnica es la observación simultánea del crecimiento de los axones y la formación de sinapsis en células vivas individuales.Este método puede proporcionar información sobre la relación entre la ramificación de los axones y la formación de sinapsis en las proyecciones talamocorticales. También se puede aplicar a otros circuitos neuronales, como la conexión intrínseca en la corteza cerebral. Para comenzar este procedimiento, esterilice todos los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70% durante 10 minutos o más.A continuación, diseccione rápidamente todo el cerebro de una rata del segundo día posnatal bajo anestesia helada. Luego, coloque el cerebro en una placa de Petri de 100 milímetros que contenga 40 mililitros de solución fría de sal equilibrada de Hank. Bajo un microscopio binocular, extraiga la materia pia cuidadosamente con pinzas finas y co

visualization-thalamocortical-axon-branching-synapse-formation

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Un método para generar cortes organotípicos del cerebro medio E12.5 embrionarias murinas se describe. Las culturas rebanada organotípicos se puede utilizar para observar el comportamiento de las neuronas dopaminérgicas o neuronas del cerebro medio ventral.

Culturas organotípicos rebanada de mesencéfalo ventral embrionario: Un sistema para estudiar el desarrollo neuronal dopaminérgica In vitro</em

Fuente: Winkle, C. C., et al. Utilización de metodologías combinadas para definir el papel de la administración de membrana plasmática durante la ramificación de axones y la morfogénesis neuronal. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra una técnica de imágenes en vivo que utiliza microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) para observar la ramificación axonal en tiempo real en las neuronas corticales. Los videos de lapso de tiempo capturan los efectos del tratamiento con...

Imágenes in vitro en tiempo real de la ramificación axonal en neuronas corticales de ratón

El cocultivo de cortes de cerebro organotípicos con células de carcinoma permite visualizar cambios morfológicos por fluorescencia, así como de campo brillante (vídeo) microscopía durante el proceso de la invasión de células de carcinoma de tejido cerebral. Este sistema modelo también permite enfoques de cambio de células y de reposición y ofrece una amplia variedad de manipulaciones y análisis.

Sistema Coculture con un cerebro rebanada organotípicos y 3D esferoide de células de carcinoma

El uso de múltiples ángulos para cortar el cerebro pup ratón, mejoramos sobre una rebanada cerebral agudo descrito previamente-que captura las conexiones entre la mayoría de las principales estructuras del mesencéfalo y el prosencéfalo auditivas.

Modificación de un Colliculo-tálamo-cortical del ratón Cerebro Loncha, incorporación de la impresión 3-D de la Cámara Componentes e Imagen óptica multi-escala

Aquí se presenta un protocolo que se basa en rebanadas de la médula espinal cultivadas en matrices de electrodos múltiples para estudiar la regeneración funcional de conexiones propioespinal in vitro.

La investigación de la regeneración funcional en organotípicos médula espinal Co-culturas cultivadas en Arrays Multi-electrodos

Este artículo describe una metodología detallada para obtener secciones tangenciales aplastadas de cortezas mamíferas y visualizar los módulos corticales mediante histoquímica y métodos inmunohistoquímicos.

Visualización de módulos corticales en cortezas mamíferos aplanados

En este protocolo, nuestro objetivo es describir un método reproducible para combinar disociado humanas pluripotentes células madre derivadas neuronas y astrocitos juntos en 3D esfera cocultures, mantener estas esferas en condiciones flotantes libres y posteriormente medición de la actividad de circuito sináptico de las esferas con inmunoanálisis y matriz micropozo-microcanal grabaciones.

Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

Las interacciones neurona-glial en la neurodegeneración no se comprenden bien debido a herramientas y métodos inadecuados. Aquí, describimos protocolos optimizados para obtener neuronas inducidas, células precursoras de oligodendrocitos y oligodendrocitos a partir de células madre pluripotentes humanas y proporcionamos ejemplos de los valores de estos métodos para comprender las contribuciones específicas del tipo de célula en la enfermedad de Alzheimer.

Generación de neuronas humanas y oligodendrocitos a partir de células madre pluripotentes para modelar las interacciones neuronal-oligodendrocitos

Presentamos protocolos detallados para la generación y caracterización de modelos de desarrollo neocortical basados en células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC) 2D y 3D, así como metodologías complementarias que permiten el análisis cualitativo y cuantitativo de la biogénesis y función del cilio primario (PC).

Modelos 2D y 3D basados en células madre pluripotentes inducidas por humanos para diseccionar la participación del cilio primario durante el desarrollo neocortical

Este protocolo demuestra un método sencillo y robusto para estudiar el crecimiento del axón in situ y la dinámica del cono de crecimiento. Describe cómo preparar cortes cerebrales agudos fisiológicamente relevantes ex vivo y proporciona una tubería de análisis fácil de usar.

In situ Visualización del crecimiento de axones y la dinámica de los conos de crecimiento en cultivos agudos de cortes cerebrales embrionarios ex vivo

Las áreas sensoriales primarias en el neocórtex exhiben actividades espontáneas únicas durante el desarrollo. Este artículo describe cómo visualizar las actividades neuronales individuales y las áreas sensoriales primarias para analizar las actividades sincrónicas específicas del área en ratones neonatos in vivo.

Visualización in vivo de la actividad espontánea en la corteza sensorial del ratón neonatal con una resolución de una sola neurona

Aprende a visualizar la ramificación axonal talamocortical y la formación de sinapsis en cocultivos organotípicos de rata. Este método permite observar cambios morfológicos dinámicos en células vivas individuales.

Visualización de axón talamocorticales ramificación y sinapsis formación en Organotypic Cocultures

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