Aplicación de sistema de cultivo de explantes de Aorta-gónada-mesonefros en hematopoyesis del desarrollo
3 de noviembre de 2017
Este protocolo describe el uso cultivadas Aorta-gónada-mesonefros para análisis de expresión, unidades formadoras de colonias en la cultura y el bazo y la reconstitución a largo plazo para determinar el efecto de factores reguladores y vías de señalización de vástago de hematopoietic desarrollo de la célula. Esto ha sido demostrado como un sistema eficaz para el estudio de la función y biología de células madre hematopoyéticas.
El objetivo general de este experimento es utilizar un cultivo de explante de aorta-gónada-mesonephros para investigar los reguladores críticos del desarrollo de células madre hematopoyéticas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología y la función de las HSC sobre cómo identificar los factores involucrados en la regulación del desarrollo de las HSC en los mamíferos. La principal ventaja de esta técnica es que estos reguladores se pueden verificar a través del análisis de la expresión del ADN y la capacidad de formación de colonias y la capacidad de reconstitución de las HSC.
Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la separación precisa de AGM de los tejidos circundantes en la región del tronco requiere práctica para dominarla. Antes de comenzar el procedimiento, coloque las mallas de acero inoxidable en pocillos individuales de una placa de seis pocillos que contenga dos mililitros de medio suplementado con fluoxetina recién preparado por pocillo. Coloque un filtro de 0,65 microlitros esterilizado por UV por pocillo experimental en una placa de cultivo de células de vidrio que contenga agua hirviendo fresca durante dos lavados de tres minutos, sumergiendo los filtros en un recipiente de PBS a temperatura ambiente durante dos minutos después de cada lavado.
A continuación, coloque un filtro en cada malla de acero en la interfaz aire-líquido de cada pocillo. A continuación, utilice las tijeras de disección para extraer el útero de un ratón embrionario embarazada del día 11 y extraer los embriones del útero. Con unas tijeras de disección, retire el saco vitelino, el cordón umbilical y las vísceras del cuerpo del embrión.
Y retire con cuidado los tejidos nerviosos dorsales y los tejidos musculares circundantes. Con pinzas, extraiga los tejidos de las extremidades anteriores y traseras. Y separar la región AGM del cuerpo del embrión.
A continuación, coloque cada AGM en un solo filtro en la interfaz aire-líquido de cada pozo. Coloque los cultivos en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Después de dos o tres días, transfiera las muestras de AGM a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contengan 200 microlitros de colagenasa para su disociación a 37 grados centígrados durante unos 20 minutos con agitación cada cinco minutos.
Al final de la digestión se detienen las reacciones con 200 microlitros de suero por explante. Transfiera todo el contenido de cada tubo a pocillos individuales de una placa de fijación ultrabaja de 24 pocillos que contiene de 500 a 600 microlitros de medio M3434 por pocillo. Mezcle las células de cada pocillo con una jeringa de un mililitro sin aguja.
Coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares. El número de unidades formadoras de colonias dentro de cada pozo se puede determinar después de siete a 10 días de cultivo. Para el trasplante de explante AGM in vivo después de dos a tres días de cultivo de AGM, como se acaba de demostrar, se radican letalmente ratones machos C57 de ocho a 10 semanas de edad con nueve grises de radiación.
Cuatro a cinco horas después disociar los explantes cosechados en 200 microlitros de colagenasa por muestra como se ha demostrado. Carga de 0,5 a un embrión equivalente de las suspensiones unicelulares resultantes en una jeringa de un mililitro por animal receptor. Coloque el primer ratón irradiado en un retenedor y limpie la cola con un hisopo de algodón empapado en etanol al 75% para promover la vasodilatación de las venas de la cola.
Inyecte por vía intravenosa todo el contenido de una jeringa en una vena de la cola dilatada. Use un hisopo antiséptico para detener el sangrado después de retirar la aguja. Luego regrese al animal a su jaula e inyecte al siguiente animal.
11 días después de la transferencia adoptiva, los bazos se pueden fijar en la solución de Bouin para la enumeración macroscópica de las colonias de bazo visibles. Los cultivos AGM suplementados con fluoxetina demuestran un aumento de la expresión de Runx1, un gen fundamental para el desarrollo de HSC a nivel de expresión de ARNm y proteínas. La fluoxetina también puede aumentar significativamente la capacidad de formación de colonias de HSC en el AGM, incluidos los eritroides de la unidad formadora de ráfagas, los monocitos granulares de la unidad formadora de colonias y los granulocitos de la unidad formadora de colonias, eritrocitos, macrófagos y megacariocitos.
Además, el trasplante in vivo de HSC tratadas con fluoxetina aisladas de explantes AGM da como resultado un aumento en el número de colonias en el bazo de los animales receptores adultos irradiados. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar el AGM y realizar un cultivo de explantes AGM para la identificación de los reguladores críticos del desarrollo de HSC dentro del AGM.
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Descripción general
Este protocolo describe el uso de cultivos de aorta-gónada-mesonéfrico (AGM) para análisis de expresión y unidades formadoras de colonias con el fin de estudiar el desarrollo de las células madre hematopoyéticas (HSC). Es un sistema eficaz para investigar los factores reguladores y las vías de señalización implicadas en la biología de las HSC.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Biología de las células madre hematopoyéticas
- Técnicas de cultivo celular
- Factores reguladores en el desarrollo
Antecedentes
- La región AGM es crucial para el desarrollo de las CTH en los mamíferos.
- Comprender la regulación de las CTH puede conducir a avances en la medicina regenerativa.
- Los ensayos de formación de colonias son esenciales para evaluar la funcionalidad de las CTH.
- La separación de la región AGM de los tejidos circundantes requiere habilidad y práctica.
Objetivo del estudio
- Investigar reguladores clave del desarrollo de las CPH.
- Identificar factores implicados en la regulación de las CPH.
- Mejorar la comprensión de la biología y función de las CPH.
Métodos Utilizados
- Técnicas de cultivo de explantes de AGM.
- Análisis de expresión de ADN para la verificación de factores reguladores.
- Ensayos de formación de colonias para evaluar la capacidad de las CTH.
- Estudios de reconstitución a largo plazo.
Resultados principales
- Identificación de factores reguladores clave que afectan el desarrollo de las CTH.
- Verificación de los factores mediante análisis de expresión de ADN.
- Demostración exitosa de la capacidad formadora de colonias en CTH cultivadas.
- Conocimientos sobre las vías de señalización implicadas en la biología de las CTH.
Conclusiones
- El sistema de cultivo de AGM es eficaz para estudiar el desarrollo de las CTH.
- Comprender los factores reguladores puede orientar estrategias terapéuticas.
- Este método proporciona una plataforma para investigaciones futuras en hematopoyesis.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El sistema de cultivo de explantes de AGM aborda un cuello de botella clave en la investigación de las células madre hematopoyéticas (HSC) al permitir estudios mecanicistas sin necesidad de modelos de eliminación en la línea germinal. Este enfoque apoya la validación de dianas y la reducción de riesgos en las fases iniciales del descubrimiento, al permitir experimentos farmacológicos o de rescate genético en un nicho embrionario fisiológicamente relevante. Mejora la confianza predictiva para identificar reguladores esenciales del desarrollo de HSC, aportando información para decisiones estratégicas en áreas terapéuticas centradas en la hematopoyesis.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la comprobación de hipótesis terapéuticas mediante la evaluación de la participación de factores en la regulación de las CTH a través de experimentos de rescate en fondos KO.
- Valor operativo: Proporciona un sistema reproducible para verificar los cambios en la expresión de ADN y los resultados funcionales, como la formación de colonias, reduciendo la dependencia de modelos in vivo costosos.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al vincular perturbaciones moleculares con resultados funcionales de las CTH, tales como la capacidad de reconstrucción.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas multicelulares, incluyendo colonias CFU-E, CFU-GM y megacariocitos, para evaluar los efectos del compuesto en la diferenciación de las CTH.
- Valor operativo: Estandariza la evaluación funcional de las CTH mediante la cuantificación de unidades formadoras de colonias tras 7–10 días, permitiendo la escalabilidad del ensayo en bibliotecas de compuestos.
- Valor traslacional: Prepara poblaciones validadas de CTH para estudios posteriores de trasplante, conectando el descubrimiento con la validación preclínica.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor Científico: Mantiene la relevancia para la enfermedad al preservar el nicho hematopoyético embrionario, permitiendo el estudio de los mecanismos de desarrollo de las CSH mamíferas.
- Valor Operativo: Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta el trabajo preclínico mediante la generación de CSH transplantables con potencial de reconstitución demostrado en receptores irradiados.
- Reducción de Riesgos: Permite la validación funcional de dianas antes de realizar estudios in vivo costosos, mejorando la confianza en las decisiones de avance o interrupción.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El cultivo de explantes de la región aórtica-genital (AGM) se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la identificación de dianas hasta la optimización de fármacos y la validación preclínica, especialmente en programas de hematopoyesis y medicina regenerativa.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la prueba de hipótesis sobre vías de señalización y reguladores transcripcionales que afectan la aparición y expansión de las CPH.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos basados en fluorescencia o microscopía que permiten el análisis de respuesta a dosis y la confirmación de resultados positivos.
- Análisis: Permite evaluaciones multiparamétricas mediante la expresión de ARNm/proteínas (por ejemplo, Runx1), la morfología de colonias y las unidades de repoblación in vivo.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos mecanicistas con la continuidad preclínica mediante la demostración de reconstrucción a largo plazo en modelos de trasplante competitivo.
- Reutilización Empresarial: Sirve como una plataforma reutilizable para la validación iterativa de objetivos en múltiples proyectos dentro de las áreas terapéuticas de células madre y trastornos sanguíneos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en el blanco al vincular intervenciones moleculares con fenotipos funcionales de CTH en un sistema acorde con el desarrollo biológico.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de aislamiento, cultivo y disociación de explantes, reduciendo la variabilidad en los ensayos funcionales.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la reducción temprana de riesgos en blancos de CTH, minimizando fracasos en fases avanzadas por falta de comprensión mecanicista.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos funcionales sobre la capacidad de autorrenovación y diferenciación de CTH para la clasificación de blancos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disección embrionaria y técnicas microquirúrgicas para aislar la región AGM sin contaminación por tejidos circundantes.
- Depende de una infraestructura estéril para cultivo celular, incluyendo incubadoras de CO2, placas con baja adherencia y filtración estéril para medios y reactivos.
- Necesita estandarización entre los equipos en cuanto a la colocación de los explantes, el tiempo de digestión con colagenasa y los criterios de cuantificación de colonias, para garantizar la comparabilidad de los datos.
- La adaptación a modelos no murinos puede verse limitada por el momento embrionario y la accesibilidad del tejido específicos de cada especie, lo que requiere validación en cada sistema.
- Las limitaciones prácticas incluyen la breve ventana embrionaria (E10.5–E11.5 en ratones) para el aislamiento de la AGM, lo que afecta el rendimiento y la programación en campañas de descubrimiento.
