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La microscopía electrónica de barrido, o SEM, es una potente técnica utilizada en química y análisis de materiales que utiliza un haz de electrones escaneado para analizar la estructura de la superficie y la composición química de una muestra.
Los microscopios ópticos modernos están limitados por la interacción de las ondas de luz visible con un objeto, llamada difracción. La distancia resoluble más pequeña entre dos objetos, o la resolución lateral, varía según el tamaño del patrón de difracción en comparación con el tamaño del objeto. Como resultado, los microscopios ópticos tienen un aumento máximo de hasta 1.000X y una resolución lateral de hasta 200 nm en situaciones ideales.
El SEM no está limitado por la difracción, ya que utiliza un haz de electrones en lugar de luz. Por lo tanto, un SEM puede alcanzar aumentos de hasta un millón de X con una resolución lateral subnanométrica. Además, la SEM no se limita a las características de imagen solo en el plano focal, como ocurre con la microscopía óptica. Por lo tanto, los objetos fuera del plano focal se resuelven, a diferencia de la microscopía óptica, donde aparecen borrosos. Esto proporciona una profundidad de campo hasta 300 veces mayor con SEM.
Los químicos utilizan ampliamente el SEM para analizar la composición de la superficie, la estructura y la forma de las entidades a nanoescala, como las partículas de catalizadores.
? Este video describirá los principios del instrumento SEM y demostrará los conceptos básicos de la preparación y operación de muestras SEM en el laboratorio.
En SEM, las muestras deben ser conductoras para la obtención de imágenes convencionales. Las muestras no conductoras están recubiertas con una fina capa de metal, como el oro. A continuación, se generan imágenes mediante el escaneo de un haz enfocado de electrones de alta energía a través de la muestra.
El haz de electrones utilizado en SEM es generado por un cañón de electrones, equipado con un cátodo de filamento de tungsteno. Los electrones son impulsados hacia el ánodo, en la dirección de la muestra, por un campo eléctrico.
A continuación, el haz de electrones se enfoca en las lentes del condensador y entra en la lente del objetivo. La lente del objetivo debe ser calibrada por el usuario para enfocar el haz de electrones en una posición fija en la muestra. A continuación, el haz enfocado se escanea en ráster a través de la muestra.
Cuando los electrones primarios interactúan con la muestra, hacen un túnel a una profundidad que depende de la energía del haz de electrones. Esta interacción con la superficie da como resultado la emisión de electrones secundarios y retrodispersados, que luego son medidos por sus respectivos detectores.
La intensidad de la señal de los electrones secundarios emitidos varía en función del ángulo de la muestra. Las superficies perpendiculares al haz liberan menos electrones secundarios y, por lo tanto, parecen más oscuras. En el borde de las superficies, se liberan más electrones y el área parece más brillante. Este fenómeno produce imágenes con una apariencia 3D bien definida, como se muestra en este escaneo SEM de asbesto.
Por el contrario, los electrones retrodispersados se reflejan en la dirección opuesta al haz de electrones. La intensidad de detección aumenta con el aumento del número atómico de la muestra, lo que permite la adquisición de información de composición de una superficie, como se muestra en esta imagen de retrodispersión de inclusiones en vidrio.
Ahora que se han esbozado los principios del instrumento SEM, se demostrará en el laboratorio el funcionamiento básico de un SEM.
Para comenzar, cubra la muestra con pulverización catódica colocándola en un trozo de muestra. Asegúrese de que la muestra esté completamente seca y desgasificada. Si es necesario, se puede usar cinta de carbono conductora de doble cara para adherir la muestra al talón. Coloque la muestra en un sistema de pulverización catódica. Esparce unos pocos nanómetros de oro sobre la muestra. El grosor de la capa de oro variará dependiendo de si el recubrimiento interfiere con la morfología de la muestra.
Retire la muestra del sistema de pulverización catódica. Asegúrese de que haya un puente conductor desde la superficie de la muestra hasta el trozo de metal.
Una vez que la muestra ha sido recubierta, está lista para ser fotografiada. Para ello, primero ventile la cámara de muestras SEM y permita que la cámara alcance la presión nominal.
Abra el compartimento de muestras SEM y retire la etapa de muestras. Coloque el talón en la platina de muestra y apriételo en su lugar.
Si el software no puede controlar la distancia entre la lente y la muestra, llamada distancia de trabajo, asegúrese de que la platina y el muñón tengan la altura adecuada para obtener una imagen.
Coloque la etapa de muestra en la cámara de muestras y cierre el compartimento.
Encienda las bombas de vacío y deje que el sistema bombee.
Para comenzar a crear imágenes, abra el software SEM. Seleccione la tensión de funcionamiento deseada entre 1 y 30 kV. Con materiales de alta densidad, se deben utilizar voltajes de aceleración más altos. Seleccione un voltaje de aceleración bajo para materiales de baja densidad.
La mayoría de los programas de SEM incluyen una función de enfoque automático. Esto adquirirá un enfoque de la muestra para usarlo como punto de partida.
Ajuste la ampliación al nivel de zoom mínimo de 50X.
SEM tiene diferentes modos de escaneo, como escaneo rápido y escaneo lento. El modo de escaneo más rápido proporciona una frecuencia de actualización más rápida de la pantalla con menor calidad. Seleccione el modo de escaneo rápido para comenzar, con el fin de encontrar la muestra y comenzar el enfoque grueso.
Ajuste el enfoque del curso hasta que la imagen se vuelva más nítida. A continuación, ajuste la posición del escenario para que la región de interés se pueda ver en la pantalla.
En primer lugar, enfoque con el aumento más bajo utilizando el enfoque grueso. A continuación, aumente el nivel de aumento hasta que se observe la característica deseada. Ajuste el enfoque del curso para enfocar aproximadamente la imagen con esta ampliación. Si es necesario, ajuste un enfoque grueso cuando aumente el aumento.
A continuación, ajuste el enfoque fino para mejorar aún más la imagen. Repita estos pasos de enfoque cada vez que se aumente la ampliación.
Las distorsiones asimétricas del haz pueden causar un desenfoque de la imagen, llamado astigmatismo, incluso cuando la muestra está bien enfocada. Para disminuir este efecto, aumente la ampliación al nivel máximo y enfoque la imagen con el enfoque fino. A continuación, ajuste la estigmatización en las direcciones x e y para remodelar el haz.
Siga ajustando la configuración de enfoque y estigmatización hasta que la imagen esté lo más enfocada posible con el mayor nivel de ampliación.
A continuación, vuelva al nivel de aumento deseado.
La imagen SEM se puede adquirir en modo "foto lenta" o "foto rápida". El modo de "foto rápida" crea una imagen de menor calidad, pero se adquiere más rápido. El modo de "foto lenta" crea una imagen de mayor calidad, pero puede saturar la superficie con electrones.
Para medir las características dentro de la imagen capturada, utilice las herramientas de medición del software.
La mayoría de los instrumentos incluyen opciones de medición como longitud, área y ángulo.
Para determinar la longitud, seleccione la distancia que se medirá en la imagen SEM. Haga clic en la imagen para crear los puntos de referencia que serán analizados por el software.
Cuando termine, apague el SEM de acuerdo con las pautas del fabricante.
La microscopía electrónica de barrido se utiliza para obtener imágenes de una amplia gama de muestras.
El SEM se puede utilizar para obtener imágenes de materiales complejos y altamente estructurados, como una membrana de fibra de carbono.
La muestra mostró un alto grado de porosidad y estructura tridimensional, una propiedad que es altamente deseable para aplicaciones como la catálisis.
El SEM también se puede utilizar para obtener imágenes de muestras biológicas, como las bacterias. En este ejemplo, se obtuvieron imágenes de los apéndices en forma de pelo, o pili, de las bacterias intestinales con SEM.
Helicobacter pylori se cultivó en placas de agar sangre y las bacterias se sembraron en cubreobjetos de vidrio.
Se montaron muestras completamente secas y se recubrieron con 5 nm de paladio-oro para hacer que la muestra fuera conductora.
Finalmente, la muestra fue fotografiada mediante SEM. H. pylori fue fácilmente visible, con pili medibles a nanoescala.
Este ejemplo describe cómo el tejido cerebral puede incrustarse en una resina estable y luego obtener imágenes en tres dimensiones utilizando un haz de iones enfocado y SEM.
Primero, el tejido cerebral se fijó e incrustó en resina. A continuación, se identificó la región de interés y se cortó con un micrótomo.
A continuación, la muestra se insertó en el microscopio electrónico de barrido de haz de iones focalizado para obtener imágenes tridimensionales. A continuación, se utilizó el haz de iones enfocado para eliminar secuencialmente las capas finas de la muestra. Se tomaron imágenes de cada capa antes de su eliminación mediante SEM de retrodispersión.
Acabas de ver la introducción de JoVE a la microscopía electrónica de barrido. Ahora debe comprender los principios operativos básicos de SEM y cómo preparar y analizar una muestra de SEM.
¡Gracias por mirar!
