3D ultraestructura mitocondrial del músculo de vuelo indirecto de Drosophila revelado por tomografía electrónica serie-sección

El objetivo general de este video es determinar la aplicación de la tomografía electrónica de sección seriada para estudiar la ultraestructura mitocondrial del músculo de vuelo indirecto de Drosophila. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular de la estructura, como la estructura y la relación funcional con las mitocondrias. La principal ventaja de esta técnica es que la ultraestructura celular se revela en tres dimensiones.

Para comenzar el experimento, anestesiar cinco especímenes de Drosophola en hielo y sumergir cada mosca en un mililitro de agarosa de bajo punto de fusión al 4% en tampón de fosfato. Deje que la agarosa se solidifique en hielo. A continuación, utilice un micrótomo de cuchilla vibratoria para dividir el Drosophola incrustado en gel de agarosa en rodajas de 100 micrómetros de grosor.

Sumerja las rodajas en una solución fijadora que contenga un 2,5% de glutaraldehído en tampón de fosfato molar punto cero. Lave las secciones de tejido con tres gotas de tampón de fosfato y luego siga con un lavado con dos gotas de tampón de fosfato con 20% de BSA. Coloque las secciones en portadores de oro para congelación a alta presión, o HPF, llenos de tampón y 20% BSA.

A continuación, cargue la muestra que contiene los portadores en un congelador de alta presión de acuerdo con el manual del usuario. Después de la congelación, suelte los portadores del soporte bajo nitrógeno líquido y transfiéralos a un dispositivo de sustitución libre enfriado a menos 140 grados centígrados. Realice el protocolo de sustitución libre con el cóctel FS que contiene 2% de glutaraldehído, 2% de tetróxido de osmio, 0,1% de acetato de uranilo en acetona.

Incrusta los especímenes en resina a temperatura ambiente. A continuación, polimeriza la resina a 65 grados centígrados durante 16 horas. Recorte los bloques de muestras para exponer la cara del bloque deseada que contiene tejido.

A continuación, pretrate las partículas de oro de 10 nanómetros con 1%BSA durante 30 minutos. Lave y suspenda las partículas de oro en solución salina tamponada con fosfato, o PBS. Superponga las partículas de oro en rejillas deslizantes de cobre recubiertas con película de carbono para crear marcadores de referencia.

Corte secciones en serie de 200 a 250 nanómetros de grosor con un ultramicrótomo. Luego, recoja las secciones en serie en cuadrículas de ranuras usando un bucle perfecto para secciones delgadas. Tiñe las secciones con citrato de plomo Reynolds durante 10 minutos.

Superponga una segunda capa de partículas de oro fiducial en la parte superior de las secciones. Cargue la rejilla en un soporte de tomografía de doble eje e insértela en el microscopio electrónico de transmisión que funciona a 200 kilovoltios. Alinee el microscopio en el foco eucéntrico.

Configure el software de recopilación automática de datos, ajuste y alinee el haz de electrones en la configuración de imágenes multiescala, adquiera referencias oscuras y brillantes de la cámara en un área vacía sin película de carbono en la configuración de recopilación de tomografía. A continuación, recopile un atlas de cuadrícula con un aumento bajo. Seleccione las mitocondrias en secciones seriadas como objetivos para la recolección de tomografías, adquiera una serie de inclinación de menos 60 grados a 60 grados positivos con incrementos de dos grados en el eje A para cada objetivo.

Finalmente, recoja la segunda serie de inclinación. Gire el portamuestras 90 grados. Adquirir un nuevo atlas.

Seleccione las posiciones correspondientes y adquiera la serie de inclinación en el eje B para cada objetivo. Utilizando este método, se generaron micrografías 2D y tomografías 3D a partir de secciones seriadas que cubren todo el volumen de una mitocondria. Los tomogramas de sección en serie unidos se proyectan para crear una sección longitudinal con el eje z mostrado verticalmente.

Se aplicó la tomografía electrónica de sección en serie para analizar las características estructurales de las crestas mitocondriales que reflejan su estado energético y envejecimiento. Los cortes de las reconstrucciones de tomografía electrónica mitocondrial revelan cambios entre membranas laminares a través del eje z. Segmentación tomográfica que ilustra una espiral levada a la izquierda en 3D.

Se analizaron los patrones de cambio de crestas y se representó el color en el modelo de segmentación. Un corte tomográfico muestra la confluencia de la matriz lateral a través de las membranas de las crestas. Se generó un modelo de segmentación del tomograma en el que se muestra la confluencia lateral de la matriz y las crestas representativas.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la tomografía electrónica de sección seriada, que se puede adaptar para estudiar cualquier estructura celular en tres dimensiones.