Lente libre Video microscopia para la dinámica y el análisis cuantitativo del cultivo de células adherentes

El objetivo general de esta metodología es adquirir y analizar la dinámica de una gran población de células adherentes monitorizadas mediante microscopía de vídeo sin lentes. Por lo tanto, creemos que esta técnica es interesante en muchos campos de la biología y para estudiar la proliferación celular o la cistitis celular o el cribado de fármacos, o diferentes bioprocesos de monitorización. Así que esta técnica no tiene etiquetas y es muy sencilla.

Pero es muy eficaz en el estudio de grandes poblaciones de células. ¿Qué idea tuvo este método, cuando pasamos del campo de la detección de bacterias al campo de la obtención de imágenes de células de mamíferos? Entonces fue de utilidad que el biólogo, necesitarán la adquisición de lapso de tiempo de los circuitos directamente en la incubadora.

Luego construimos un microscopio de video personalizado sin lentes que es compatible con la incubadora y desarrollamos un algoritmo de reconstrucción holográfica para obtener la imagen de miles de células que están presentes en un campo de visión muy grande. Comience este procedimiento cubriendo una placa inferior de vidrio de 6 pocillos con fibronectina a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de 1 hora, retire el exceso de fibronectina y enjuague la placa inferior de vidrio de 6 pocillos con PBS.

En esta demostración se utilizan células de hela, cultivadas en DMEM, más medio glutamina, suplementadas con un 10% de calor en suero de ternero fetal activado, y un 1% de penicilina y estreptomicina. Siembra veinte mil células por placa de cultivo. Es importante utilizar un recipiente con fondo de cristal.

Por la calidad de la adquisición sin lentes. Coloque la placa de cultivo en la incubadora encima del microscopio de vídeo sin lentes. El microscopio de vídeo sin lentes utilizado para esta adquisición de lapso de tiempo está disponible comercialmente.

Tiene un sensor de imagen semiconductor de óxido metálico con un área de imagen de 29,4 milímetros cuadrados y un paso de píxeles de 1,67 micrómetros. La iluminación de múltiples longitudes de onda es proporcionada por un dispositivo de diodo emisor de luz de múltiples chips ubicado sobre un orificio de 150 micrómetros a una distancia de aproximadamente 5 centímetros de las celdas. Antes de iniciar la adquisición del time-lapse, es importante comprobar que no haya condensación en la placa de cubierta.

Porque la condensación degradará la calidad de la imagen de la adquisición. Si se ha producido condensación en la cubierta de la placa de cultivo, limpie la cubierta. Controle el microscopio de vídeo sin lentes con un software de adquisición disponible en el mercado.

Que realiza tanto la adquisición de time-lapse como la reconstrucción holográfica. Introduzca los parámetros de entrada necesarios en la interfaz del software. Establezca la velocidad de fotogramas en 1 adquisición cada 10 minutos, el tipo de cultivo celular en adherente y la duración del experimento en 3 días.

Inicie la adquisición de lapso de tiempo. Esta imagen muestra un ejemplo del campo de visión completo de una adquisición en bruto en el canal azul en un área de 29,4 milímetros cuadrados en un fotograma. El panel B es el detalle del panel A, y el panel C es el detalle del panel B. El algoritmo de reconstrucción holográfica procesará automáticamente la adquisición sin lentes para obtener la imagen de fase del cultivo celular.

Se muestra una imagen de ejemplo de las celdas antes del desenvolvimiento de fase, seguida de una imagen después del desenvoltura de fase. El seguimiento de células se realiza mediante el algoritmo TrackMate, un complemento de código abierto de Fiji para el seguimiento automatizado de partículas individuales. Después de cargar, la adquisición completa de lapso de tiempo en Fiji y configurar los algoritmos como se describe en el protocolo de texto, establezca los parámetros de entrada.

Establezca el diámetro estimado del blob en 15 píxeles, el umbral del detector en 0,25, la distancia máxima de vinculación en 15 píxeles, la distancia máxima de cierre de espacio en 15 píxeles y el número de puntos en la pista en 3,5. El primer paso en el algoritmo de seguimiento de células es la detección de células en la adquisición sin lentes. Se muestran los resultados del algoritmo de seguimiento de celdas, con todas las pistas de celdas mostradas en cincuenta fotogramas, o aproximadamente 8 horas.

Con un código de colores correspondiente a la velocidad mediana. El panel inferior es una imagen detallada del rectángulo amarillo del panel superior. Aquí se muestra un clip de video representativo del seguimiento de celulares.

Al final del proceso de seguimiento de celdas, seleccione el botón de análisis para generar los resultados en forma de 3 archivos de texto. Sobre la base de estos datos, realice la segmentación celular y detecte las divisiones celulares utilizando algoritmos dedicados, como se detalla en el protocolo de texto y los archivos de código complementarios. La compilación de todas las mediciones de una sola celda durante la adquisición de lapso de tiempo completo, produce diagramas de dispersión de varias métricas en función del tiempo.

El número total de células en el campo de visión completo aumenta de dos mil a quince mil en 2,7 días. Multiplicado por el número de puntos de tiempo, esto conduce a un gran conjunto de datos de celdas detectadas. Cada uno se caracteriza por sus coordenadas y características morfológicas, como la masa seca, el área, el espesor promedio, la longitud de acceso principal y la relación de aspecto.

La combinación de algoritmos de seguimiento y segmentación de células permite mediciones cinéticas a nivel de una sola célula. Este ejemplo muestra el análisis de la pista celular que dura aproximadamente sesenta y seis horas, y exhibe 4 divisiones celulares en los puntos de tiempo marcados con un círculo amarillo. Se calcularon varias métricas en función del tiempo: área de superficie de la celda, masa seca, espesor promedio y motilidad de la celda.

La distribución de la duración del ciclo celular para la observación de 2,7 días fue cercana a la agouziana. Con una media de 16,5 horas. Las longitudes de los ciclos celulares, medidos automáticamente, están bien correlacionados con los medidos manualmente.

También se examinaron otros parámetros, como la masa seca inicial de la célula, la masa seca final y la tasa de crecimiento promedio durante el ciclo celular. Una vez dominado, el análisis completo de los datos de la adquisición de time-lapse, se puede realizar en unas pocas horas, dependiendo de la configuración de la CPU y el rendimiento del hardware. Al intentar este procedimiento, es muy importante tener cuidado con la concentración celular inicial.

Si la concentración celular inicial es demasiado grande, el algoritmo de seguimiento de celdas fallará al definir correctamente las trayectorias celulares. Pero, si la concentración celular es demasiado baja, las estadísticas del análisis completo también serán demasiado bajas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar análisis automatizados de seguimiento celular para responder a otras preguntas en los campos de: biología, biología fundamental o quimiotaxis.

Esta nueva técnica también allana el camino para el seguimiento del linaje celular que, con suerte, aportará una visión interesante para estudiar el ciclo celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la adquisición de lapso de tiempo por medio de la microscopía de video sin lentes y cómo analizar una gran población de células.