Name: Lente libre Video microscopia para la dinámica y el análisis cuantitativo del cultivo de células adherentes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprende a usar microscopía sin lentes para analizar dinámicas de células adherentes como HeLa en incubadora. Este método libre de etiquetas permite estudios de proliferación y cribado de fármacos con alta eficiencia.

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Los autores no tienen nada que agradecer.

1. célula cultura control adquisición
<ol><li>Cultivar células HeLa en DMEM + glutamina (p. ej., GlutaMAX) suplementado con 10% (v/v) ternera fetal inactivado por calor del suero y el 1% penicilina y estreptomicina.</li>
	<li>Capa 6-pozo cristal placas inferior con fibronectina (25 μg/mL) durante 1 hora. Entonces la semilla 2 x 104 células por pocillo.</li>
	<li>Durante la adquisición, cambiar el medio cada 3 días.</li>
	<li>Para la adquisición de Time-lapse, utilizar el microscopio lente gratis video (disponible comercialmente). Nota: Esto se basa en la técnica de imagen Computacional libre lente descrito por Ozcan et al. 16 que fue modificado para llevar a cabo un monitoreo continuo en una incubadora a una temperatura controlada de 37 ° C12,15. Cuenta con un sensor de imagen de semiconductor (CMOS) de óxido de metal complementario con una echada del pixel de 1,67 μm y una superficie de proyección de imagen de 6.4 x 4.6 mm2. Múltiples de longitud de onda iluminación es proporcionada por un multichip luz emitiendo diodo (LED) dispositivo que proporciona iluminación de roja, verde y azul. Las longitudes de onda están centradas, en 636, 521 y 452 nm respectivamente, con un ancho de banda espectral de 25, 45 y 25 nm respectivamente. El rojo, verde y azul (RGB) LED se encuentra por encima de una 150 μm del agujero de alfiler a una distancia de aproximadamente 5 cm de las células. La potencia de luz mide cerca de lo LED es tan baja como 10 μW en cada longitud de onda y el tiempo de iluminación es sólo un segundo por adquisición. Por lo tanto, no hay problemas de toxicidad de la foto esperan cuando cultivos de células se observan bajo el microscopio lente libre de vídeo.</li>
	<li>Poner el contenedor de la cultura de célula ponerse en contacto con el sensor CMOS (figura 1). Utilice un recipiente con un cubreobjetos de vidrio en la parte inferior, que es importante para la calidad de la adquisición gratuita de lentes. También pueden utilizar envases de plástico pero se degradará la adquisición libre de lentes debido a la mala calidad óptica de estos contenedores.</li>
	<li>Control de video gratis lente de microscopio con el software de adquisición (disponible comercialmente), que realiza la adquisición de Time-lapse y la reconstrucción holográfica. Los parámetros que necesitan ser introducidos por el usuario en la interfaz del software son la velocidad de fotogramas, la duración de la experiencia y el tipo de cultivo celular, células por ejemplo, adherentes o flotante.</li>
	<li>Establecer los parámetros de software de adquisición de la entrada. Establecer la velocidad de fotogramas establece que una adquisición cada 10 minutos y el tipo de cultivo celular en 'adherente'. Nota: Una velocidad de adquisición de una cada 10 minutos es un buen compromiso, como asegura un celular confiable de seguimiento mientras que el tamaño del conjunto de datos resultante a analizar es todavía razonable. La velocidad de fotogramas más rápida con esta configuración de microscopía lente-libre es una adquisición cada 5 minutos. Aumentando la velocidad de fotogramas se traduce en calentamiento del sensor CMOS que puede afectar la viabilidad de las células en cultivo.</li>
	<li>Iniciar la adquisición de Time-lapse, y el algoritmo de reconstrucción holográfica (disponible comercialmente) procesará automáticamente la adquisición gratuita de lentes para obtener la imagen de la fase de cultivo celular. El algoritmo de reconstrucción holográfica se basa en una onda fase recuperación algoritmo17 y proporciona una imagen de fase reconstruido de RGB en el rango de [-π, + π] para cada celda individual en un gran campo de visión de 29,4 mm2. El principio de la holografía en línea libre de la lente es iluminar una muestra delgada (en z = 0) con una onda de plano (de amplitud 1 después de normalización) y detectar en un sensor CMOS de la imagen de la intensidad de difracción posterior a una corta distancia z = Z, normalmente 1 mm después de la muestra. En nuestra configuración, la iluminación se conecta secuencialmente a 3 longitudes de onda (λ1= 0.450 μm, λ2= 0.540 μm, λ3= 0,647 μm) para medir tres patrones de difracción de la muestra misma.</li>
</ol>2. célula cultura análisis de datos
<ol><li>Para el rastreo de celulares, utilizan el algoritmo Trackmate, un plugin de Fiji de código abierto para el seguimiento automatizado de partículas solo18. En cargar en primer lugar, la adquisición completa de Time-lapse en Fiji (comando de secuencia de imagen de carga). Debido al gran tamaño de los conjuntos de datos, que incluye típicamente 400 marcos de RGB de 29,7 Mb, es más rápido cargar en formato de 8 bits. A continuación el plugin Trackmate Fiji guía al usuario a través de varias etapas del algoritmo de rastreo de celulares, es decir, una etapa de detección de células, una etapa de rastreador de celulares y varios filtros aplicados a las detecciones de la célula y las pistas computadas. En cada etapa, configurar los algoritmos y ver los resultados inmediatamente para que, si es necesario, uno puede fácilmente navegar hacia adelante y hacia atrás para reajustar la configuración. Los distintos menús de la interfaz Trackmate se muestran en la figura 2 con los ajustes reales utilizados para el experimento de las células HeLa.</li>
	<li>Establecer los parámetros de software de adquisición de la entrada como la siguiente (ver figura 2). Establece el diámetro de gota estimada en 15 píxeles, el umbral del detector a 0.25, la distancia máxima de enlace en 15 píxeles, la distancia máxima de cierre de la brecha a 15 píxeles y el número de puntos en las pistas a 3.5. Nota: Estos valores obviamente serán diferente de un experimento a otro, especialmente el 'blob Estimado diámetro' que se corresponde con el tamaño de la celda (aquí dado en píxeles de 1,67 μm). La misma observación se aplica a la 'distancia máxima vinculación' que representan la distancia máxima recorrida por una celda de dos fotogramas consecutivos (aquí dada en píxeles de 1,67 μm). Su valor óptimo dependerá de motilidad celular sino también de la densidad celular.</li>
	<li>Al final del proceso de seguimiento de la célula, genera los resultados en forma de tres archivos de texto ('Análisis' botón, ver figura 2). El archivo más útil, denominado estadísticas de pistas puntos, consiste en una tabla todo detectadas células con sus posiciones respectivas (x, y) en la adquisición, su número y su número de pista. Sobre la base de datos, realizar segmentación de células y detectar divisiones celulares utilizando algoritmos dedicados (ver archivos de código complementario). Los dos archivos se denominan 'Enlaces en las estadísticas de pistas' y 'Pista estadísticas' y son todos los resultados relacionados con pistas, por ejemplo, duración de la pista, número de deficiencias detectadas, pista marco inicial, etcetera.</li>
	<li>Utilizar el algoritmo de segmentación de la célula (véase código complementario archivo) para extraer automáticamente varias métricas que describen la morfología de la célula de la imagen de la fase de reconstrucción. Estas métricas son la superficie de la célula (S), la longitud del eje mayor de la célula (L), la longitud del eje menor de la célula (l) y la relación de aspecto de la célula (L/l). La fase de microscopía lente libre es proporcional a la densidad y el espesor de la capa de la muestra según lo discutido previamente15.</li>
	<li>Además de las características morfológicas de la célula, extracto seco medidas de (MDL) masa celular cuantitativa de la fase reconstruido13,19,20 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq1v3.jpg">Ecuación (1) donde φ(x,y) es el cambio de fase reconstruido19, λ la longitud de onda y α = 1,8 x 10-4 m3/kg el índice de refracción específico relacionado con la variación del índice de refracción para secar la masa1, 19.</li>
	<li>Evaluar el espesor de la célula mediante una estimación de la diferencia entre el índice de refracción de la célula y de los medios de cultivo. Se da la relación entre la célula de espesor h(x,y) y el desplazamiento de fase medido por20: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq2v3.jpg">Ecuación (2.1) <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq3v3.jpg">Ecuación (2.2) Δn(x,y) = nde lacelda (x,y) - medio de n (x,y), la diferencia de índice de refracción entre la célula y los medios de cultivo. En el siguiente, asume un valor constante de Δn = 0.025, que se calcula por el índice de refracción medido en los núcleos de célula HeLa (n = 1.35511) y la de medios de cultivo de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (n = 1.33). Aunque el valor de espesor de célula es sólo indicativo ya que se basa en una asunción, sus variaciones relativas son significativos y pueden ser aprovechados para detectar células divisorias.</li>
	<li>Utilizar el algoritmo dedicado (ver código complementario archivo) para detectar la ocurrencia de divisiones celulares y luego extraer las pistas de células que se asocian a las divisiones de célula detectadas, con el fin de detectar una división de célula, las células con un espesor medido más grande que 8 μm primero se identifican a continuación, compruebe si una nueva célula aparece estrechamente en espacio y tiempo. De esta manera, la detección de las divisiones de célula se basa en dos criterios robustos. Alternativas y métodos más elaborados para la detección de la división de célula pueden aplicarse a la adquisición de Time-lapse de lensfree21,22,23.</li>
</ol>

<ol><li>Zangle, T. A., Teitell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+mass+profiling%3A+an+emerging+approach+in+quantitative+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics.</a> Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).</li>
<li>Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+technologies+for+measuring+single+cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">New technologies for measuring single cell mass.</a> Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).</li>
<li>Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+massively+parallel+single-cell+drug+response+measurements+via+live+cell+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry.</a> Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).</li>
<li>Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).</li>
<li>Girshovitz, P., Shaked, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+cell+morphological+parameters+based+on+interferometric+phase+microscopy+and+their+application+to+cell+life+cycle+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization.</a> Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).</li>
<li>Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+cell+division+monitoring+of+endothelial+cells+by+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy.</a> J Biomed Opt. 15 (3), (2010).</li>
<li>Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+quantitative+imaging+for+monitoring+single+cancer+cell+growth+kinetics+and+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response.</a> PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).</li>
<li>Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+detection+and+measurement+of+living+cell+morphometric+features+with+single-shot+quantitative+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy.</a> J Biomed Opt. 17 (7), (2012).</li>
<li>Aknoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+cell+dry+mass+measurement+usinq+quantitative+phase+imaging+with+quadriwave+lateral+shearing+interferometry%3A+an+accuracy+and+sensitivity+discussion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion.</a> J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).</li>
<li>Cotte, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker-free+phase+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Marker-free phase nanoscopy.</a> Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).</li>
<li>Choi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic phase microscopy.</a> Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).</li>
<li>Kesavan, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+monitoring+of+major+cell+functions+by+means+of+lensfree+video+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy.</a> Sci Rep. 4, 1-11 (2014).</li>
<li>Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ePetri+dish%2C+an+on-chip+cell+imaging+platform+based+on+subpixel+perspective+sweeping+microscopy+%28SPSM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM).</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).</li>
<li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+single-cell+motility+analysis+on+a+chip+using+lensfree+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy.</a> Sci Rep. 4, 4717(2014).</li>
<li>Allier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+dense+cell+cultures+by+multiwavelength+lens-free+video+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+Part+A%22%5BJournal%5D)">Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy.</a> Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).</li>
<li>Su, T. -W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+lensfree+imaging+and+characterization+of+a+heterogeneous+cell+solution+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip.</a> Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).</li>
<li>Delacroix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+lens-free+microscopy%3A+a+new+tool+for+the+laboratory+diagnosis+of+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis.</a> Sci Rep. 7, 39893(2017).</li>
<li>Tinevez, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+an+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2016).</li>
<li>Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).</li>
<li>Liu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+refractive+index+for+cell+biology+and+disease+diagnosis%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future.</a> Lab Chip. 16, 634-644 (2016).</li>
<li>Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+validation+algorithm+allows+for+automated+cell+tracking+and+the+extraction+of+biologically+meaningful+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters.</a> PLoS One. 6 (11), e27315(2011).</li>
<li>Al-Kofahi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cell+lineage+construction%3A+A+rapid+method+to+analyze+clonal+development+established+with+murine+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells.</a> Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).</li>
<li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+in+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking in cell and developmental biology.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).</li>
<li>Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+growth+and+division+during+the+cell+cycle+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells.</a> J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).</li>
<li>Zocchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD38+Increases+Intracellular+Calcium+Concentration+and+Reduces+Doubling+Time+in+HeLa+and+3T3+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells.</a> J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).</li>
<li>Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+glutamine%2C+not+sugar%2C+is+the+major+energy+source+for+cultured+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells.</a> J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).</li>
<li>Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Antisense+RNA+against+Initiation+Factor+eIF-4E+mRNA+in+HeLa+Cells+Results+in+Lengthened+Cell+Division+Times%2C+Diminished+Translation+Rates%2C+and+Reduced+Levels+of+Both+eIF-4E+and+the+p220+Component+of+eIF-4F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F.</a> Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).</li>
<li>Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+G1+phase+duration+and+enhancement+of+c-myc+gene+expression+in+HeLa+cells+at+hypergravity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity.</a> J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).</li>
<li>Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+being+the+right+%28cell%29+size%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">On being the right (cell) size.</a> Science. 348 (6236), 1245075(2015).</li>
<li>Mathieu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+lens-free+imaging+of+cell+migration+in+diverse+physical+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments.</a> Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este trabajo, mostramos que microscopía lente libre de vídeo puede utilizarse dentro de una incubadora para capturar la cinética de miles de células. Para describir la metodología global nos explicó cómo una adquisición de Time-lapse de 2,7 días de células HeLa en cultura puede ser analizada con algoritmos estándar de seguimiento de la célula. El resultado es un conjunto de datos con 2,2 x 106 células medidas y 10.584 pistas de ciclo celular. Las adquisiciones se realizaron en un cultivo de células Hela con...

Monitoreo de células de mamíferos cultivadas a lo largo de varios ciclos de la célula y medir con precisión la célula tamaño y célula masa seca es una tarea difícil. Varias técnicas de etiqueta-libre ópticas son capaces de realizar esta tarea1,2: desfasaje interferometría3, microscopia holográfica digital (DHM)4,5,6, 7, quadriwave lateral corte interferometría8,9 y fase cuantitativa tomografía10,11. Estos métodos han conducido a muchas nuevas perspectivas en la comprensión del ciclo celular de células de mamíferos. Sin embargo rara vez se juntan con algoritmos de seguimiento automático de la célula y su rendimiento sigue siendo limitada cuando medición de células trayectorias masa1 (N < 20 respectivamente3,4,5 , 6). por lo tanto es necesario un novedoso método óptico para medir trayectorias masa celular con estadísticas grandes (N > 1000).
En este trabajo demostramos la capacidad de microscopía lente libre de vídeo imagen simultáneamente miles de células directamente dentro de la incubadora, y luego cuantificar métricas de unicelular a lo largo de miles de pistas de cada ciclo celular. Lente libre la microscopia es una fase cuantitativa, técnica que permite la adquisición de la imagen de la fase de células densamente sobre un gran campo de visión de la proyección de imagen (normalmente varias decenas de mm2, aquí 29,4 mm2)12,13 ,14,15. Se determinan varias métricas a nivel unicelular, por ejemplo, área de la célula, celular de masa seca, espesor de célula, célula eje mayor longitud y proporción12,15, de cada imagen de la célula. Luego, mediante la aplicación de un algoritmo de seguimiento de la célula, se pueden trazar estas características para cada célula individual en función del experimento tiempo14,15. Además, mediante la detección de la ocurrencia de divisiones celulares en las pistas de la célula, es posible extraer información importante tales como la celda inicial seca masa (justo después de la división de célula), la masa seca de la célula final (justo antes de la división de célula) y la célula ciclo de duración, es decir, el tiempo entre dos divisiones consecutivas15. Todas estas mediciones se pueden computar con muy buenas estadísticas (N > 1000) ya que el gran campo de visión por lo general permitiría el análisis de 200 a 10.000 células en una sola adquisición libre de lentes.
Para explicar esta metodología basada en microscopía lente libre de vídeo, se describe el protocolo para controlar y cuantificar un cultivo celular HeLa de 2,7 días. Análisis de datos es un proceso de cuatro pasos, basado en reconstrucción holográfica de la multi-longitud de onda, seguimiento de células, segmentación de la célula y algoritmos de la división celular. Aquí se demuestra que la resolución espacial y la velocidad de fotogramas relativamente rápido (una adquisición cada 10 minutos) con esta configuración de microscopía lente libre de vídeo es compatible con estándar algoritmos de seguimiento de la célula. El análisis completo de este conjunto de resultados en la medición de 10.584 celular pistas sobre ciclos celulares completos.
Para resumir, microscopía lente libre de vídeo es una herramienta poderosa para monitorizar automáticamente miles de sincronización, sin etiqueta y sin modificar las células por experimento; cada célula rastrean varios ciclos de la célula. Nuestras mediciones ofrecen el valor medio de varios parámetros de la celda, pero más importante aún, la variabilidad inter-célula sobre una gran población de células.

<table><tbody><tr><td>Microscopio de vídeo sin lentes Cytonote&nbsp;</td>Software de adquisición <td>Iprasense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horus Placas</td> de cultivo con fondo de <td>vidrio Iprasense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 6 pocillos</td><td>Corporación MatTek Nº</td> de <td>pieza: P06G-0-14-F&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX medio&nbsp;</td>Suero de pantorrilla fetal inactivado por calor <td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eurobio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>penicilina y estreptomicina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab, caja de herramientas de procesamiento de imágenes&nbsp;</td><td>Obras</td><td></td><td></td> matemáticas</tr></tbody></table>

lente libre video microscopia para la dinámica y el análisis cuantitativo del cultivo de células adherentes

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Aquí, demostramos que video gratis lente microscopía nos permite capturar simultáneamente la cinética de miles de células directamente dentro de la incubadora y que es posible supervisar y cuantificar las células a lo largo de varios ciclos de la célula. Describimos el protocolo completo usado para monitorear y cuantificar un cultivo celular HeLa de 2,7 días. En primer lugar, se realiza adquisición de cultura de célula con un microscopio de lente-libre de vídeo, y luego los datos son analizados siguiendo un proceso de cuatro pasos: detección de segmentación y división celular de celular rastreo de celular, reconstrucción holográfica de la multi-longitud de onda, algoritmos. Como resultado, mostramos que es posible reunir un conjunto de datos cuenta con más de 10.000 pistas de ciclo celular y las mediciones de más de 2 x 106 células morfológica.

Para el proceso de reconstrucción holográfica, el campo de la luz se describe por un campo escalar A (donde <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq4v3.jpg"> es el complejo valor de A en el plano de la distancia z de la posición de la muestra y el lateral <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq5v3.jpg"> y en la longitud de onda λ). Propagación de la luz es modelada por la teoría de Huygens-Fresnel que proporciona un núcleo pr...

Microscopía lente libre de vídeo nos permite supervisar cultivos celulares directamente dentro de la incubadora. Aquí describimos el protocolo completo utilizado para adquirir y analizar una adquisición largo 2,7 días de cultivos de células HeLa, conduce a un conjunto de datos de 2.2 x 106 mediciones de morfología de la célula individual y ciclo celular 10584 pistas.

Lente libre Video microscopia para la dinámica y el análisis cuantitativo del cultivo de células adherentes

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

El objetivo general de esta metodología es adquirir y analizar la dinámica de una gran población de células adherentes monitorizadas mediante microscopía de vídeo sin lentes. Por lo tanto, creemos que esta técnica es interesante en muchos campos de la biología y para estudiar la proliferación celular o la cistitis celular o el cribado de fármacos, o diferentes bioprocesos de monitorización. Así que esta técnica no tiene etiquetas y es muy sencilla.Pero es muy eficaz en el estudio de grandes poblaciones de células. ¿Qué idea tuvo este método, cuando pasamos del campo de la detección de bacterias al campo de la obtención de imágenes de células de mamíferos? Entonces fue de utilidad que el biólogo, necesitarán la adquisición de lapso de tiempo de los circuitos directamente en la incubadora.Luego construimos un microscopio de video personalizado sin lentes que es compatible con la incubadora y desarrollamos un algoritmo de reconstrucción holográfica para obtener la imagen de miles de células que están presentes en un campo de visión muy grande. Comience este procedimiento cubriendo una placa inferior de vidrio de 6 pocillos con fibronectina a temperatura ambiente durante 1 hora. Despué

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Lensfree en el chip de imagen y caracterización de las células se ilustra. Este enfoque de células en el chip de imagen proporciona una herramienta compacta y rentable para el diagnóstico médico y de alto rendimiento de aplicaciones de la biología celular, por lo que es especialmente adecuado para entornos de escasos recursos.

Sin cristalino en el chip de imagen de las células proporciona una nueva herramienta de alto rendimiento Biología celular y el diagnóstico médico

Este método permite la monitorización de las células en tiempo real y las mediciones cuantitativas de los diferentes parámetros de la migración, como la velocidad, el desplazamiento y la velocidad. A diferencia de los métodos tradicionales, este enfoque en tiempo real no se basa en las mediciones cuantitativas de migración de punto final, sino que permite el seguimiento y el cálculo de diferentes parámetros de forma continua.

Análisis cuantitativo de la migración desordenada de las células mediante microscopía de Time-lapse vídeo

La autofagia es un proceso ubicuo que permite a las células para degradar y reciclar las proteínas y orgánulos. Aplicamos microscopía de fluorescencia avanzada para visualizar y cuantificar la pequeña, pero, cambios físicos esenciales asociados con la inducción de la autofagia, incluyendo la formación y distribución de autofagosomas y lisosomas, y su fusión en autolisosomas.

Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

Se demuestra un ensayo basado en microfluídica para medir la escala de tiempo de tránsito para las células a través de una secuencia de constricciones a escala micrométrica.

Una técnica de microfluidos investigará Deformabilidad Cell

Un microscopio avanzado que permite rápido y de alta resolución de imagen de la membrana plasmática aislada y el volumen intracelular circundante, se presentará. La integración de microscopía de fluorescencia de reflexión interna disco y total en una configuración de giro permite energizados experimentos de imagen a precios de adquisición alto hasta 3.5 s por grupo imagen.

Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco

Debido a la baja relación señal-ruido (SNR) inherente de los sensores basados en transferencia de energía de resonancia Fӧrster (FRET), la medición de señales cAMP ha sido un desafío, especialmente en tres dimensiones espaciales. Aquí, describimos una metodología de imagen y análisis FRET hiperespectral que permite la medición de la distribución de cAMP en tres dimensiones espaciales.

Medición de distribuciones de cAMP tridimensionales en células vivas utilizando imágenes y análisis FRET hiperespectrales de 4 dimensiones (x, y, z y λ)

La plataforma Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) automatiza el proceso de medición simultánea de una amplia variedad de señales químicas y mecánicas en células adherentes. iTACS está diseñado para facilitar el desarrollo impulsado por la comunidad y permitir a los investigadores utilizar todas las características de la plataforma, independientemente de su formación académica.

Kit de herramientas integradoras para analizar señales celulares: fuerzas, movimiento, morfología y fluorescencia

Este manuscrito describe el diseño y operación de un microscopio microtensómetro/confocal para realizar mediciones simultáneas de tensión interfacial y reología dilatacional superficial mientras visualiza la morfología interfacial. Esto proporciona la construcción en tiempo real de relaciones estructura-propiedad de interfaces importantes en tecnología y fisiología.

Microtensómetro para microscopía confocal Visualización de interfaces dinámicas

El protocolo presentado describe el desarrollo y uso de una técnica de tinción de actina filamentosa basada en faloidina con microscopía de barrido láser confocal (CLSM) para visualizar la estructura de la capa celular adherente en canales de cultivo dinámico microfluídico y cámaras tradicionales de cultivo estático de pozo fijo. Este enfoque ayuda a evaluar la confluencia de la capa celular, la formación de monocapa y la uniformidad del espesor de la capa.

Preparación y evaluación estructural de monocapas de células epiteliales en un dispositivo de cultivo microfluídico de tamaño fisiológico

Los protocolos actuales describen nuevas imágenes de montaje completo para la visualización de estructuras periféricas en el cristalino ocular con métodos para la cuantificación de imágenes. Estos protocolos se pueden utilizar en estudios para comprender mejor la relación entre las estructuras a microescala del cristalino y el desarrollo/función del cristalino.

Imágenes de montura completa para visualizar y cuantificar la estructura, la morfología y la organización de las lentes periféricas

En este trabajo se describen diferentes métodos de formación de esferoides multicelulares para realizar un seguimiento de la microscopía multiparamétrica de células vivas. Mediante el uso de microscopía de imágenes de fluorescencia (FLIM), autofluorescencia celular, colorantes de tinción y nanopartículas, se demuestra el enfoque para el análisis del metabolismo celular, la hipoxia y la muerte celular en cáncer tridimensional vivo (3D) y esferoides derivados de células madre.

Microscopía de imagen de por vida (FLIM) de fluorescencia de células vivas multiparamétricas y producción de esferoides multicelulares

Aprende a usar microscopía sin lentes para analizar dinámicas de células adherentes como HeLa en incubadora. Este método libre de etiquetas permite estudios de proliferación y cribado de fármacos con alta eficiencia.

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