Buscando vías de controlador de adquirir resistencia a la terapia dirigida: sensibilidad restaurar por Gene Knock-down y generación Subclone resistente a los medicamentos

El objetivo general de esta plataforma preclínica es proporcionar un procedimiento estándar para identificar y caracterizar los mecanismos que impulsan la resistencia adquirida a las terapias dirigidas. Este método puede ayudar a implementar la unidad genómica en oncología, en particular, abordar preguntas clave sobre la heterogeneidad tumoral y los múltiples mecanismos responsables de la resistencia adquirida a la terapia dirigida. La principal ventaja de esta técnica es el enfoque rentable y en tiempo que permite la investigación in vitro de los mecanismos de resistencia a la terapia dirigida.

Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia contra el cáncer, ya que la resistencia pulmonar sigue siendo un desafío para las terapias dirigidas emergentes. Este método puede proporcionar información sobre el mecanismo implicado en la resistencia a la terapia dirigida, pero también se puede utilizar para estudiar la eficacia de los agentes quimioterapéuticos convencionales. Por lo general, los operadores que utilizan este método se tambalean con una generación de subclones resistentes a los medicamentos, el paso más difícil de estandarizar.

Concebimos por primera vez la idea de este método cuando caracterizamos el mecanismo de resistencia adquirida al trastuzumab en líneas celulares de cáncer gástrico HER positivo. La demostración visual de este método es fundamental, ya que se necesitan varias técnicas para la generación y validación de modelos resistentes a fármacos in vitro, incluida la restauración de la sensibilidad mediante la eliminación de genes. Para comenzar este procedimiento, siembre las células NCI N87 en matraces de cultivo de 25 centímetros cuadrados.

Añadir 10 microgramos por mililitro de trastuzumab al medio de cultivo en cada matraz. Exponga las células a esta dosis inicial hasta que reanuden su crecimiento. Después de que se haya reanudado el crecimiento celular en aproximadamente dos semanas, exponga las células a una dosis de concentración de cien microgramos por mililitro de trastuzumab.

Continúe aumentando gradualmente la concentración de trastuzumab esperando hasta que las células reanuden el crecimiento antes de cada exposición, hasta alcanzar una concentración de 400 microgramos por mililitro. Una línea celular puede exhibir una sensibilidad diferente a diferentes medicamentos. Una solución a este problema es exponer las células a dosis de fármaco que aumentan gradualmente, comenzando desde una dosis de aproximadamente diez veces por hora de la concentración máxima plasmática hasta que las células sigan creciendo.

A continuación, siembre las células en 24 placas de cultivo de pocillos múltiples. Exponga las células sembradas a concentraciones crecientes de inhibidores de la terapia dirigida de 100 microgramos por mililitro a 400 microgramos por mililitro. Incubar en una incubadora de CO2 a 37 grados centígrados durante 15 días.

Después de esto, retire el medio y enjuague las celdas con 10 mililitros de PBS-1X. Retire el PBS-1X y añada entre dos y tres mililitros de solución de fijación. Después de 20 minutos, retire la solución de fijación y agregue dos mililitros de solución de violeta cristalina al 0,5% a cada pocillo.

Incubar a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, utilice una pipeta para aspirar cuidadosamente la solución de violeta cristalina. Sumerja los platos en agua del grifo para enjuagar los residuos restantes.

Secar al aire a temperatura ambiente durante un máximo de dos días. A continuación, utilice un microscopio invertido con un aumento de 4X para contar las colonias que contengan más de 50 células. Calcule la relación de resistencia relativa IC50 como se describe en el protocolo de texto.

Para comenzar, prepare una suspensión de una sola célula por tripsinización como se describe en el protocolo de texto. Con un hemocitómetro y una tinción con azul de tripano, cuente las células. A continuación, siembra 2,5 veces 10 a cinco células en un matraz T-25 para cada condición.

A continuación, diluya 12,5 microlitros de cada oligonucleótido de siRNA dirigido a genes u oligonucleótido de siRNA de control negativo en un medio de transfección esencial mínimo. Añadir un reactivo de transfección de liposomas catiónicos en una proporción de 1:1 con los oligonucleótidos. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Después de esto, agregue 700 microlitros de la mezcla de transfección a cada matraz T-25. Incubar a 37 grados centígrados durante uno a tres días. Utilice la RT-PCR y el análisis Western Blot para verificar la eliminación de genes.

A continuación, siembre las células en 24 placas de cultivo de pocillos múltiples. Exponga las células a concentraciones crecientes de inhibidor de terapia dirigida de 100 microgramos por mililitro a 400 microgramos por mililitro. Para la eficacia de la eliminación de genes, los oligonucleótidos de siRNA deben ser específicos para reducir la expresión diana.

Las herramientas diseñadas y la medida del siRNA fue el mismo gen diana son útiles para este propósito. Incubar en una incubadora de CO2 a 37 grados centígrados durante 15 días. Retire el medio y enjuague las células con 10 mililitros de PBS-1X.

Después de retirar el PBS, agregue de dos a tres mililitros de solución de fijación. A continuación, retire la solución de fijación y añada una solución de violeta cristalina al 0,5%. Incubar a temperatura ambiente durante dos horas.

Con una pipeta, aspire cuidadosamente la solución de violeta cristalina. A continuación, sumerja los platos en agua del grifo. Secar al aire a temperatura ambiente durante un máximo de dos días.

Después de esto, use un microscopio invertido con un aumento de 4X para contar las colonias que contienen más de 50 células. En este estudio, tres líneas celulares de cáncer gástrico que expresan un alto nivel de HER2 y son sensibles al trastuzumab se cultivan en un medio de cultivo que contiene los agentes terapéuticos dirigidos. A partir de esto, se obtienen tres subclones caracterizados por un fenotipo resistente estable.

De los subclones, HR NCI N87 es el más resistente, alcanzando una resistencia relativa IC50 de 28.57. El análisis de la expresión de proteínas y genes apoya la hipótesis de que el gen IQGAP1 desempeña un papel fundamental en el fenotipo de resistencia de la sublínea HR NCI N87. Como se muestra aquí, el nivel de proteína IQGAP1 es cinco veces mayor en el subclon resistente que en las células parentales.

Y la expresión génica de IQGAP1 es 2,5 veces mayor en la sublínea HR NCI N87 que en el subclon original. A continuación, se realiza el silenciamiento del gen IQGAP1 para evaluar su papel en el desarrollo del fenotipo de resistencia al trastuzumab. Un ensayo clonogénico confirma aún más la hipótesis de la importancia de IQGAP.

Como se ve aquí, el silenciamiento génico restaura la sensibilidad de la célula al trastuzumab, reduciendo el valor de IC50 a siete microgramos por mililitro. Lo que pienso de este procedimiento es importante tener en cuenta que, por lo general, no es fácil obtener subclones de células resistentes a los medicamentos. Y que este método conlleva un riesgo potencial de fracaso.

A través de este procedimiento es posible obtener varias células de clones caracterizadas por diferentes mecanismos que impulsan la resistencia adquirida a las terapias dirigidas. El desarrollo de un procedimiento estándar para el modelado in vitro de la resistencia a la terapia diana debería permitir a un investigador oncológico investigar una nueva diana habilitada para superar la resistencia a los fármacos, que es la mayor crítica a las terapias de última generación.