Desarrollo de un Biosensor de ADN electroquímico para la detección de un patógeno de transmisión alimentaria

Los patógenos transmitidos por los alimentos contribuyen a una gran proporción de problemas de salud pública en todo el mundo, que afectan significativamente la tasa de mortalidad y morbilidad humana. Los métodos convencionales para la detección de patógenos transmitidos por los alimentos requieren un manejo complicado de las muestras y requieren mucho tiempo. Recientemente, los biosensores han demostrado ser un método de detección prometedor y completo con las ventajas de una detección rápida y práctica.

El desarrollo de biosensores se basa en electrodos modificados con nanopartículas de oro estabilizadas con ácido poliláctico. El electrodo de carbono serigrafiado se modificó para aumentar el área de superficie activa del electrodo de trabajo. El azul de metileno utilizado como complejo redox tiene un fuerte enlace con el ADN monocatenario del ADN de la sonda inmovilizado.

Esta relación de alta afinidad representada por una corriente pico alta. La hibridación del ADN monocatenario con su secuencia complementaria reemplaza las moléculas de azul de metileno enlazadas, lo que reduce la corriente de la voltamperometría de pulso diferencial. Esto puede deberse a una menor cantidad de azul de metileno acumulado en la superficie del electrodo modificado con ADN bicatenario complementario, que fue causado por una interacción inalcanzable entre las bases de guanina.

El color de las soluciones preparadas cambia comenzando de amarillo a negruzco y finalmente a rojo rubí oscuro. Esto indica que la sal de oro ha sido reducida por los iones de citrato. El ácido poliláctico disuelto se mezcló con la solución de nanopartículas de oro previamente preparada y luego se agitó homogéneamente a temperatura ambiente, lo que luego se denotó como nanopartículas de oro estabilizadas con ácido poliláctico.

Se utilizaron espectroscopía ultravioleta visible, difracción de rayos X, microscopía electrónica de transmisión y microscopía electrónica de barrido por emisión de campo con espectrometría de rayos X de dispersión de energía para caracterizar las nanopartículas de oro estabilizadas con ácido poliláctico. Alrededor de 25 microlitros de la solución homogénea de nanopartículas de oro estabilizadas con ácido poliláctico se pipetearon rápidamente en el electrodo de carbono serigrafiado y se secaron al aire durante 24 horas antes de su uso. Luego, los electrodos modificados se caracterizaron electroquímicamente en ferrocianuro de potasio para medir el área de superficie activa, la espectroscopia de impedancia electroquímica, la repetibilidad, la reproducibilidad y la estabilidad.

La optimización de la condición de inmovilización se determinó utilizando tres factores, la concentración de ADN monocatenario que varió de 0,2 a 1,4 micromolares, el tiempo que osciló entre 30 y 220 minutos y la temperatura que osciló entre 25 y 75 grados Celsius. Por otro lado, la optimización de la condición de hibridación se determinó a través de dos factores, que son el tiempo que varía de cinco a 35 minutos y la temperatura que oscila entre 25 y 75 grados centígrados. Posteriormente, los electrodos modificados tratados se sumergieron en azul de metileno de 20 micromolares durante 30 minutos.

El ADN no absorbido específicamente y el exceso de azul de metileno se eliminaron lavando con tampón de acetato salino pH 4.5 y luego se enjuagaron con agua desionizada. La corriente máxima de reducción del azul de metileno se midió utilizando la técnica de voltamperometría de pulso diferencial. La medición de voltamperometría de pulso diferencial se ejecutó utilizando solución salina de tampón fosfato pH 7.0 que no contenía indicador.

Se llevó a cabo un procedimiento similar para todas las interacciones. En este estudio, se emplearon Vibrio parahaemolyticus como cepas de referencia y otras ocho cepas bacterianas, a saber, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus y Vibrio alginolyticus del patógeno común transmitido por los alimentos. Cada dos semanas se llevó a cabo un subcultivo rutinario de cepas bacterianas en su respectivo agar para mantener su viabilidad.

La cantidad de células de Vibrio parahaemolyticus se determinó mediante la técnica de placa extendida. Un milímetro del cultivo celular de bacterias se transfirió a nueve milímetros de caldo de soja tripticasa, que contenía cloruro de sodio al 3%, para obtener un factor de dilución de 10. A continuación, se esparcieron 0,1 mililitros de cada factor de dilución a partir de un factor de dilución de 10 a 10 veces el factor de dilución de 10 en una placa de CHROMagar Vibrio para el recuento de colonias, respectivamente.

Los berberechos se obtuvieron del mercado húmedo y luego se llevaron rápidamente al laboratorio en una caja de enfriador de hielo para su análisis. Los berberechos se dividieron en dos grupos, a saber, el grupo tratado y el no tratado, asumiendo que los berberechos se cosecharon de manera uniforme desde el inicio de la cosecha hasta su colocación en almacenamiento frigorífico en el mercado. Los berberechos del grupo tratado se trataron previamente almacenándolos a menos 20 grados centígrados durante 24 horas, seguido de la exposición a luz ultravioleta a 20 grados centígrados durante cuatro horas antes de la extracción del ADN.

Se esperaba que la temperatura de congelación y la exposición a los rayos ultravioleta utilizados para el grupo de control lo mataran o al menos limitaran la acumulación natural de patógenos transmitidos por los alimentos en los berberechos. No se aplicó un régimen de pasteurización superior a 70 grados centígrados, ya que el objetivo de la condición controlada en este estudio fue imitar la situación real de los berberechos frescos. Mientras tanto, las muestras del grupo no tratado se analizaron directamente sin ningún tratamiento previo tan pronto como llegaron al laboratorio.

Los berberechos se lavaron en agua destilada y se limpiaron antes de retirar los tejidos de las cáscaras utilizando pinzas estériles y una cabina de flujo laminar. Se homogeneizaron alrededor de 10 gramos de muestras de tejido de berberecho con el homogeneizador en 19 mililitros de caldo de soja tripticasa estéril que contenía cloruro de sodio al 3% durante 60 segundos. A continuación, se añadió una cantidad conocida de patógenos transmitidos por los alimentos a nueve milímetros del caldo de muestra homogeneizado para las muestras enriquecidas.

Las muestras sin espiga se utilizaron como control negativo. Alrededor de un mililitro de muestras se pipetearon en un tubo Eppendorf para la extracción de muestras de ADN, que se utilizarían para el biosensor y el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa. A continuación, se extrajo el ADN genómico del patógeno transmitido por los alimentos de las muestras con y sin espiga.

El ADN genómico se extrajo siguiendo un procedimiento de lisis hervida modificado. El ADN genómico se centrifugó a 12.000 rotaciones por minuto durante tres minutos a cuatro grados centígrados para obtener una suspensión transparente y el sobrenadante se mantuvo a menos 20 grados centígrados para su uso posterior. Se utilizó un biofotómetro para determinar la concentración y pureza del ADN genómico extraído.

A continuación, se determinó la identidad de todas las cepas mediante ensayos bioquímicos estándar y se verificó mediante la secuenciación de 16 genes de ARN SR. Finalmente, el ADN genómico se desnaturalizó a 92 grados centígrados durante dos minutos y se enfrió rápidamente en agua helada antes de la aplicación del biosensor. La confirmación adicional de los patógenos transmitidos por los alimentos se realizó mediante la reacción en cadena de la polimerasa dirigida al gen respectivo.

El producto amplificado y sus tamaños se determinaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Las imágenes de gel se capturaron utilizando un sistema de documentación de gel. La generación de nanopartículas de oro estabilizadas con ácido poliláctico se confirmó a partir de los espectros ultravioleta visibles, cuyo crecimiento del plasma superficial y el pico de resonancia se encontraron alrededor de 540 nanómetros.

La formación y existencia de nanopartículas de oro estabilizadas con ácido poliláctico se indicó en rangos de longitud de onda de 500 a 600 nanómetros, dependiendo del tamaño de partícula. Todos los picos cristalinos de nanopartículas de oro estabilizadas con ácido poliláctico se observaron en los dos teatros a 31,7, 38,2, 44,4, 64,7 y 77,7 grados. Las intensidades máximas del cristalito también aumentaron a medida que los picos de difracción más amplios entraron a 31,7 grados, lo que implica que las nanopartículas frías estaban incrustadas en el ácido poliláctico y sugiere la formación de nanoestructuras polifásicas de oro.

A partir de la curva de distribución de partículas de microscopía electrónica de transmisión y las imágenes de nanopartículas de oro estabilizadas con ácido poliláctico, se pudo ver que las nanopartículas de oro tienen forma casi esférica. El tamaño de las nanopartículas estaba en el rango de unos 37 nanómetros, que es ligeramente mayor que el obtenido de la fórmula de Scherrer, lo que sugiere una naturaleza policristalina de las nanopartículas sintetizadas. El tamaño principal de las nanopartículas de oro estabilizado con ácido poliláctico se calculó utilizando la ecuación de Sherrer determinando el ancho de la reflexión de Bragg de 100.

A partir de la tabla, se calculó el tamaño del cristalito de las nanopartículas de oro estabilizadas con ácido poliláctico en 27 nanómetros. A partir de las imágenes de microscopía electrónica de barrido de emisión de campo y con espectros de rayos X de dispersión de energía, el electrodo de carbono serigrafiado modificado tenía el mayor porcentaje de peso de oro, la mayor densidad y la mayor estructura de cobertura de nanopartículas. El espectro de rayos X de dispersión de energía confirmó que las nanopartículas de oro estabilizadas con ácido poliláctico producidas estaban compuestas únicamente de oro y no mostraban ningún otro elemento, excepto el pico correspondiente al carbono y al oxígeno.

Los potenciales de pico anódicos y catódicos fueron consistentes a diferentes velocidades de escaneo, lo que sugiere que la reacción electroquímica fue reversible en función de la separación de picos. El área superficial activa de los electrodos modificados se calculó como 0,26 centímetros cuadrados y 0,41 centímetros cuadrados para el electrodo desnudo y el electrodo modificado, respectivamente. Este resultado confirmó que la mejora ofrecida por las nanopartículas de oro estabilizadas con ácido poliláctico en la superficie activa fue relativamente mayor en comparación con el electrodo desnudo.

El valor de la resistencia de transferencia de carga para el electrodo desnudo fue de 1.932 ohmios, mientras que el electrodo modificado disminuyó a 1.444 ohmios. La disminución del valor de la resistencia a la transferencia de carga en el electrodo modificado puede haber sido el resultado de una disminución en la constante dieléctrica local y / o un aumento en el espesor de la doble capa eléctrica, lo que sugiere que el ferrocianuro de potasio funcionó por absorción en la interfaz del metal o la solución. Las corrientes máximas aumentaron progresivamente con la modificación del electrodo desnudo utilizando nanopartículas de oro estabilizadas con ácido poliláctico, lo que demostró que una mayor sensibilidad era inversa a la menor resistencia a la transferencia de carga.

La desviación estándar relativa del electrodo modificado se derivó como 4.26%La modificación del electrodo con nanopartículas de oro estabilizadas con ácido poliláctico dio una mejor desviación estándar relativa después de varias mediciones. Valores de desviación estándar relativa de 4,05% para electrodos modificados que indican una mejor reproducibilidad de la fabricación de electrodos para nanopartículas de oro estabilizadas con ácido poliláctico. La concentración optimizada del ADN fue de 1,2 micromolares de ADN monocatenario.

El tiempo óptimo de inmovilización del ADN monocatenario fue de 180 minutos. La temperatura óptima de inmovilización del ADN monocatenario fue de 55 grados centígrados. El tiempo óptimo de hibridación del ADN bicatenario fue de 10 minutos.

La temperatura óptima de hibridación del ADN bicatenario fue de 35 grados centígrados. El ADN complementario exhibió la corriente máxima más baja de 0,73 microamperios entre el ADN sondeado, el ADN no complementario, el ADN no coincidente de tres bases y el ADN no coincidente de una base. Es obvio que la alta corriente del ADN al que se dirigió es menor que la corriente de las otras secuencias de oligonucleótidos.

Este resultado indicó que el biosensor podría ser utilizado para discriminar con alta sensibilidad y especificidad. El biosensor de ADN construido tenía una selectividad de detección de hibridación a través de ADN de sonda inmovilizado en la superficie del electrodo modificado. La disminución continua de la corriente máxima de voltamperometría de pulso diferencial del azul de metileno en el electrodo modificado se desencadenó como resultado de un aumento en la concentración de ADN complementario.

Se representa una correlación lineal entre el logaritmo de varias concentraciones de ADN objetivo de 0,2 picomolar a 0,02 milimolar y el logaritmo de la corriente máxima de reducción de azul de metileno con un coeficiente de regresión lineal de 0,96. El porcentaje de recuperación del biosensor de ADN fabricado disminuyó lentamente a no menos del 80% de su señal inicial después de seis meses de almacenamiento, lo que indica que la sonda de ADN monocatenario en la superficie del electrodo modificado es altamente estable. La buena estabilidad a largo plazo a una temperatura inferior a 45 grados centígrados podría ser la razón de la fuerte reacción entre las nanopartículas de oro estabilizadas con ácido poliláctico y el ADN monocatenario.

Se examinaron los productos de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa para nueve especies diferentes de bacterias, que fueron Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Vibrio alginolyticus, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae y Vibrio parahaemolyticus. La corriente pico de voltamperometría de pulso diferencial obtenida después de una evaluación de reactividad cruzada muestra una detección muy clara de Vibrio parahaemolyticus en comparación con otras especies de bacterias. Se puede ver disminuyendo el número de pares de bases, la señal de voltamperometría de pulso diferencial observada aumenta.

Esto está relacionado con la mayor cantidad de moléculas de azul de metileno hasta las sondas. A partir del análisis de la reacción en cadena de la polimerasa, se encontró Vibrio parahaemolyticus tanto en las muestras enriquecidas tratadas como en las no tratadas, como se muestra en los carriles siete, ocho, nueve, 10, 11 y 12. Mientras que las muestras tratadas y no tratadas sin pinchos en los carriles uno, dos, tres, cuatro, cinco y seis estaban desprovistas de Vibrio parahaemolyticus.

Los resultados de la detección se utilizaron el biosensor de ADN desarrollado, que determinó con éxito la presencia de Vibrio parahaemolyticus en el grupo tratado, formado por muestras con y sin espiga. Estos resultados se correlacionan positivamente con los resultados de la reacción en cadena de la polimerasa discutidos anteriormente. La aplicación de nanopartículas de oro estabilizadas con ácido poliláctico tiene un gran potencial de aplicación como modificación para un mayor sentido de fabricación.

Se podría lograr una alta selectividad cuando el complejo redox se une más fuertemente con la molécula de biorreconocimiento no hibridada, lo que puede ser una innovación que valga la pena seguir.