Método estandarizado para la esterilización de alto rendimiento de semillas de Arabidopsis

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar condiciones estandarizadas para la esterilización exitosa de semillas de un gran número de genotipos de Arabidopsis, al tiempo que se previene el crecimiento microbiano. Este método le permite esterilizar cientos de muestras de semillas a la vez, simplificando así un paso crítico de la preparación del material vegetal en los campos de la genómica, la proteómica, la metabolómica y otros estudios de alto rendimiento. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona condiciones en las que se combina una esterilización eficiente con una alta tasa de germinación para un gran número de muestras de semillas.

Para empezar, prepara una solución de lejía al 50% con agua destilada. A cada 200 mililitros de solución de lejía, agregue 50 microlitros de detergente TWEEN 20. La solución de lejía se puede almacenar hasta por un mes, siempre y cuando solo se abra en condiciones estériles.

A continuación, alícuota 100 semillas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Esto se puede hacer manualmente o mediante el uso de un robot de semillas hecho a medida. Ahora, en una campana de flujo laminar, agregue 500 microlitros de la solución de lejía al 50% a las semillas.

Luego, transfiera los tubos a un rotador e incube las semillas en la lejía con una agitación leve durante 10 minutos. Después de 10 minutos, aspire la solución de lejía de los tubos eliminando la mayor cantidad posible. Luego, agregue 500 microlitros de agua destilada estéril e invierta los tubos para mezclar.

Deje que las semillas se asienten, luego aspire el agua y reemplácela con otra alícuota para lavar las semillas nuevamente. Realice un total de seis lavados de este tipo con agua destilada esterilizada. Una vez que las semillas se hayan lavado a fondo con agua, suspenderlas en un mililitro de agua antes de colocarlas.

Antes de comenzar el proceso de esterilización, calcule los volúmenes de lejía y ácido clorhídrico necesarios para producir cloro gaseoso. Utilice la ecuación proporcionada para obtener el 6% de cloro gaseoso recomendado. Asegúrese de calcular con precisión el volumen de HCl necesario para garantizar una esterilización exitosa y evitar salpicaduras.

Asegúrese de usar guantes y una bata de laboratorio durante este protocolo y cambie los guantes cada vez que se humedezcan con ácido o lejía. Debajo de una campana extractora, transfiera los viales de semillas a una rejilla con las tapas abiertas. Luego, coloque la rejilla en un recipiente de plástico en el que se pueda realizar la esterilización y prepare tiras de película de parafina para sellar la tapa al recipiente.

Ahora, cargue el vaso con 100 mililitros de lejía y luego coloque un vaso de precipitados de 250 mililitros dentro. El uso de un exceso de lejía es una característica de seguridad y el vaso de precipitados debe tener al menos el doble del volumen total de la solución que contiene. Además, siempre manipule la lejía y los ácidos por separado.

A continuación, agregue tres mililitros de ácido clorhídrico al vaso de precipitados y, a continuación, cierre inmediatamente el recipiente y séllelo con parafilm. Monitoree el recipiente durante una hora para asegurarse de que el gas se acumule durante la esterilización. El gas de cloro debe ser visible como una tenue neblina amarilla dentro del recipiente o se puede verificar que la solución se vuelva amarilla.

Revise periódicamente el sello del recipiente. Si la tapa se desmonta o el sello de parafina comienza a aflojarse, vuelva a sellar herméticamente la tapa con una capa adicional de película de parafina. Después de la esterilización de una hora, abra una esquina del recipiente para ventilar el gas durante un período de tres horas.

Después de tres horas de ventilación, tape todos los tubos y almacene las semillas esterilizadas en condiciones secas hasta que estén plateadas. Ahora, neutralice la reacción agregando lentamente 1,5 gramos de polvo de bicarbonato de sodio mientras revuelve con una varilla de vidrio para disolver los sólidos. Siga agregando bicarbonato de sodio hasta que las burbujas de gas de dióxido de carbono hayan dejado de formarse.

Luego, mida el pH de la solución y, si es necesario, agregue bicarbonato de sodio adicional hasta que el pH sea neutro. Siempre que la solución no huela mal, se puede desechar. De lo contrario, espere hasta que todos los olores se disipen.

Agregue 500 microlitros de agua destilada esterilizada a cada tubo de semillas esterilizadas con gas. A continuación, vierta las semillas en una placa MS y extiéndalas uniformemente utilizando un asa de inoculación estéril de un solo uso o una punta de pipeta estéril. Después de tres días de estratificación de semillas a cuatro grados centígrados, transfiera las placas a 23 grados centígrados con 16 horas de exposición diaria a la luz.

Mantenga los párpados en la parte superior para que las raíces crezcan en el medio. Después de ocho días de crecimiento, marque la fracción de semillas que han germinado. La germinación se cuenta cuando el radical se ha proyectado fuera de la cubierta de la semilla y los dos cotiledones son visibles.

Además, cuente el número de semillas afectadas por el moho para determinar la efectividad de las condiciones de esterilización. Se probaron cuatro concentraciones diferentes de lejía en cinco tiempos de exposición diferentes en semillas de tipo silvestre Columbia. Las altas concentraciones de lejía afectaron negativamente la germinación con demasiada exposición.

Sin embargo, se observaron altas tasas de germinación con 40 y 50% de lejía en todos los tiempos de exposición. Las semillas esterilizadas con altas concentraciones de lejía tuvieron una alta mortalidad y a menudo mostraron defectos de crecimiento, pero por lo general estaban completamente libres de moho. Se determinó que la esterilización con lejía al 50% durante 10 minutos tenía el equilibrio óptimo entre la inhibición del moho y la germinación saludable.

Para optimizar las condiciones de esterilización del gas cloro, se utilizaron tres concentraciones diferentes de cloro gaseoso para esterilizar semillas de tipo silvestre Columbia durante dos períodos de tiempo diferentes. Hubo una interacción significativa entre el tiempo y la concentración de gases. A una hora, no hubo efecto sobre la germinación, mientras que la concentración más alta de gas fue perjudicial a las tres horas.

Por lo tanto, se eligió un período de esterilización de una hora. El crecimiento de moho se inhibió eficazmente con exposiciones a gases de tres horas o, para exposiciones de una hora, utilizando seis o 17% de gas. Por lo tanto, se determinó que una concentración de gas del 6% durante una hora era óptima para la germinación y la inhibición del moho.

Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para esterilizar con éxito cientos de líneas de semillas por día si se realiza correctamente. Las semillas esterilizadas con gas también se pueden almacenar durante un período prolongado de tiempo en condiciones secas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar las ecuaciones proporcionadas para calcular los volúmenes requeridos de HCl y lejía.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los estudios de asociación de todo el genoma, con el fin de vincular una variedad de genotipos diferentes y los fenotipos de interés. Buena suerte con tus experimentos.