Name: Método estandarizado para la esterilización de alto rendimiento de semillas de Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprende a esterilizar semillas de Arabidopsis con hipoclorito al 50% o gas cloro al 6% para estudios de alto rendimiento. Este método optimiza la germinación y previene la contaminación microbiana en investigación vegetal.

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Nos gustaría agradecer a Gauri Datta por su asistencia en la preparación de materiales experimentales. También estamos agradecidos a Bettina Wittler y James Mann por la revisión crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la NSF becas DBI-1049341 y MCB-1143813.

1. preparación de 1 x medio de Murashige y Skoog (MS) <ol><li>añadir 4.31 g de MS basal mezcla sal, sacarosa 10 g y 0,5 g de 2-(N-Morpholino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido (MES) a un vaso de precipitados que contiene 0,8 L de agua destilada y agitar para disolver. Comprobar y ajustar el pH a 5.7 utilizando 1 M hidróxido de potasio (KOH). Añadir agua destilada para hacer 1 L.</li>
	<li>Dividir los medios de comunicación en dos botellas de 1 L, 500 mL. Añadir 5 g de agar a cada botella. Mantenga la tapa suelta.</li>
	<li>Autoclave durante 20 min a 121 ° C, 15 psi con una barra de agitación magnética en la botella.</li>
	<li>Después de autoclavar, coloque las botellas en una placa de agitación a baja velocidad y el medio MS a enfriar a 45-50 ° C (hasta que la botella puede ser sostenida con las manos desnudas).</li>
	<li>a partir de este paso, realice todos los pasos en condiciones estériles en campana de flujo laminar. Añadir 500 μl Gamborg ' s solución de vitamina a cada botella y agitar el medio MS para distribuir uniformemente la solución de vitamina.</li>
	<li>Vierta suficiente medios en placas para cubrir aproximadamente la mitad de la profundidad de la placa de.</li>
	<li>Permitir que las placas se enfríe a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora permitir que el agar solidifique. 
	Nota: Si las placas no deben ser utilizadas inmediatamente, envuelva en plástico y guardar a 4 ° C (temperatura de heladera). Las placas de cubierta, cajas o tubos con agar solidificado pueden almacenarse durante varias semanas a 4 ° C en un recipiente hermético.</li>
</ol> 2. Esterilización de las semillas de Arabidopsis con Bleach <ol><li>preparar el MS placas conforme al artículo 1 del protocolo. 100 mL de agua destilada en el mismo tiempo que la Media MS del autoclave. Utilizar esto más adelante como agua de enjuague y a suspender las semillas para ayudar en la galjanoplastia de. 
	Nota: Si lo desea, mezcla de agar 0.8% (w/v) (p. ej. phytagar) también puede ser esterilizado en este paso. La mezcla de agar puede sustituirse por agua destilada durante galjanoplastia (paso 2.5.3.). La viscosidad adicional de la mezcla de agar facilita semillas del espacio en la placa o la planta en filas si es necesario.</li>
	<li>Prepare 50% (v/v) lejía solución a ser utilizado para esterilizar las semillas. Para diluir el cloro, añadir 100 mL de cloro en 100 mL de agua destilada. Añadir 50 μl de Tween 20 detergente para la solución de lejía. 
	Nota: La solución de blanqueador preparada puede almacenarse por hasta un mes como sólo se abre en condiciones estériles.</li>
	<li>Alícuota 100 semillas en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL.</li>
	<li>Esterilizar las semillas con una solución de lejía de 50%.
	<ol><li>En una campana de flujo laminar, Añadir 500 μl de la solución de lejía de 50% en el tubo de microcentrífuga que contienen las semillas. Toque en la parte inferior del tubo para suspender las semillas en la solución de lejía. 
		Nota: Como alternativa, un rotor o agitador de plataforma puede usarse para mantener las semillas suspendidas.</li>
	</ol></li> <li>Enjuagar la solución de blanqueador del tubo de.
	<ol><li>Después de 10 minutos, retire la solución de lejía con una pipeta o un aspirador equipado con una punta de la pipeta en el extremo del tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Añadir 500 μl de agua destilada estéril en el tubo. Cierre el tubo e invertir para mezclar. Permiten las semillas para instalarse en la parte inferior del tubo. Una vez que las semillas se han asentado en la parte inferior del tubo cuidadosamente retire la solución de blanqueador por pipeteo. Repita este lavado proceso 6 veces.</li>
		<li>Añada 1 mL de agua destilada esterilizada al tubo para suspender las semillas.</li>
	</ol></li> <li>Placa las semillas estériles en las placas de EM.
	<ol><li>En una campana de flujo laminar, etiqueta de la parte inferior de la placa MS con el nombre del stock y la fecha actual.</li>
		<li>Verter las semillas por el tubo de microcentrífuga en la placa MS. Extender las semillas alrededor de la placa MS utilizando un asa de inoculación estéril, desechable o una punta de pipeta estériles. 
		Nota: Si las semillas son sembradas en hileras, puede utilizarse una pipeta con una punta de 200 μL individualmente colocar las semillas en las posiciones deseadas. Para mejorar el flujo de semillas, el extremo de la punta de la pipeta puede recortarse por 3-5 mm con unas tijeras. Cualquier semillas fuera de lugar o racimos de semillas entonces puede cambiarse o separados utilizando un asa de inoculación estéril de un solo uso.</li>
		<li>Coloque la placa de MS en la parte posterior de la de la campana de flujo laminar con la tapa medio cerrados. Permitir que el exceso de agua se evapore de la placa MS.</li>
		<li>Coloque la tapa sobre la placa MS. Sello de la placa MS envolviendo la placa con el papel microporoso quirúrgica de la cinta (véase la Tabla de materiales).</li>
	</ol></li></ol> 3. Esterilización de las semillas de Arabidopsis con Gas de cloro <ol><li>preparar el MS placas conforme al artículo 1 del protocolo. Autoclave 100 mL de agua destilada en el mismo tiempo que la Media MS; Esto se utilizará más adelante para ayudar a suspender las semillas para ayudar en la galjanoplastia de. 
	Nota: Si lo desea, mezcla de agar 0.8% (w/v) (p. ej. phytagar) también puede ser esterilizado en este paso. La mezcla de agar puede sustituirse por agua destilada durante galjanoplastia (paso 3.6.2.). La viscosidad adicional de la mezcla de agar facilita semillas del espacio en la placa o la planta en filas si es necesario.</li>
	<li>Antes de comenzar la esterilización, calcular las cantidades de cloro y ácido clorhídrico (HCl) necesarias para producir cloro gas.
	<ol><li>Calcular la cantidad de HCl necesaria para producir el 6,1% Cl 2 requerido para la esterilización de.</li>
		<li>Utiliza la siguiente fórmula: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg"> con 7.000 mL el volumen del recipiente de esterilización y 6.1% Cl 2; el volumen de ácido clorhídrico se calcula en 3 mL. 
		Nota: Una hoja de cálculo programada para llevar a cabo el cálculo para diferentes volúmenes de contenedor y % Cl 2 se ofrece como suplemento tabla 1.</li>
	</ol></li> <li>Alícuota 100 semillas en el tubo de microcentrífuga de 0, 5 mL. Cerrar las tapas de cada frasco, coloque los frascos en un bastidor de plástico y dejar de lado. 
	Nota: Semillas pueden almacenarse por un período prolongado de tiempo en este momento mientras se almacenan en condiciones adecuadas. Condiciones de almacenamiento pueden encontrarse en el punto 3.3.2 del Protocolo por Rivero y sus colegas 4. también se puede utilizar el formato de la placa de 96 pozos.</li>
	<li>Preparar los materiales necesarios para llevar a cabo la esterilización con gas cloro.
	<ol><li>Obtener cloro y ácido clorhídrico de sus ubicaciones de almacenamiento de información.</li>
		<li>Corte una tira de parafina grande de la película (véase la Tabla de materiales) a utilizar en el paso 3.5.3. para sellar el recipiente de esterilización de.</li>
		<li>Colocar el envase de plástico con tapa en la cual la esterilización llevará a cabo dentro de una campana de humos. Abrir las tapas de todos los frascos de las semillas y coloque la rejilla de la semilla entera dentro del envase plástico.</li>
	</ol></li> <li>Realizar la esterilización con gas cloro a temperatura ambiente. 
	Atención: Trabajar con lejía y ácido por separado. No deje cualquier frasco destapado para reducir el riesgo de derrames. Utilice equipo de protección personal (EPP) incluyendo guantes y una bata de laboratorio. Si la lejía o ácido salpica en guantes, cambiar guantes antes de manipular otros materiales. Retire siempre guantes en la campana de humos en caso de contaminación de lejía o ácido.
	<ol><li>Coloque un vaso de precipitados de 250 mL en el contenedor y agregar 100 mL de lejía. 
		Nota: La reacción entre el HCl y el cloro requiere por lo menos 22 volúmenes de exceso de blanqueador. La reacción se consume el ácido clorhídrico y bleach por liberación de gas de 2 Cl con cloruro de sodio (NaCl) y agua como subproductos. Usando un exceso de cloro permite el consumo de d adicional de ácido clorhídricourante el período de ventilación, que disminuye la cantidad de bicarbonato de sodio (NaHCO 3) necesarios para neutralizar la solución para la eliminación de. 
		PRECAUCIÓN: El vaso debe ser al menos dos veces el volumen líquido total de bleach + HCl. Esto evitará salpicaduras de escapar el vaso durante el siguiente paso, que pueden dañar las semillas, blanqueador de ropa o quemar la piel expuesta.</li>
		<li>Añadir 3 mL de ácido clorhídrico en el vaso que contiene la lejía. 
		PRECAUCIÓN: La reacción inicial produce burbujas, especialmente en las concentraciones de gas superiores a 6,1%. Una bata de laboratorio manga larga es necesario para este paso.</li>
		<li>Cerrar el recipiente de esterilización y sellado con la película de parafina inmediatamente.</li>
		<li>Controlar el recipiente de esterilización durante el tiempo de esterilización para asegurar la acumulación de gas, la acumulación de gas de cloro debe verse como una débil neblina amarilla dentro del contenedor. 
		PRECAUCIÓN: Compruebe periódicamente el recipiente de esterilización para asegurar que la presión interior ha desbancó la tapa o película de parafina. Si la tapa ha sido destituida o la película de parafina se ha aflojado, cierre la tapa y envolver con cuidado el recipiente con una capa adicional de la película de parafina.</li>
		<li>Después de la 1 h-esterilización, abre el recipiente retirando la película de parafina y abrir la tapa en una esquina. Deje el recipiente ventilar durante 3 horas completar la reacción y eliminar el gas de cloro.</li>
		<li>Cerrar las tapas de los todos los tubos microcentrífuga en la canasta de semillas. 
		Nota: Esterilizar las semillas pueden almacenarse hasta el momento de como se almacenan en condiciones secas de la galjanoplastia.</li>
		<li>Retire la rejilla de la semilla y colocarla en una campana de flujo laminar.</li>
		<li>Neutralizar la reacción del gas cloro <ol><li>añadir 1,5 g NaHCO 3 polvo lentamente en el vaso que contiene la solución de lejía/HCl y agitar con una varilla de vidrio para disolver el NaHCO 3 en solución. Continuar agregando NaHCO 3 hasta que las burbujas de gas de dióxido de carbono (CO 2) han dejado de forma. 
			Atención: Añadir lentamente para evitar salpicaduras. Utilizar adecuado EPP incluyendo guantes y una bata de laboratorio.</li>
			<li>Prueba el pH de la solución utilizando las tiras de pH o un medidor de pH. Añadir más NaHCO 3 si es necesario hasta que el pH de la solución es neutra (pH 7.0). En este punto la solución se puede quitar de la campana y elimine de acuerdo con todas las pautas de eliminación aplicable. 
			PRECAUCIÓN: Si se nota cualquier olor durante la disposición, entonces la solución inmediatamente devuelva a la campana extractora.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Placa las semillas estériles en las placas de EM.
	<ol><li>En una campana de flujo laminar, etiqueta de la parte inferior de la placa MS con el nombre del stock y la fecha actual.</li>
		<li>Añadir 500 μl de agua destilada estéril a cada tubo de microcentrífuga para suspender las semillas. Verter las semillas en el plato MS y repartir las semillas uniformemente alrededor de la placa con un asa de inoculación estéril, desechable o una punta de pipeta estériles.</li>
		<li>Coloque la placa de MS en la parte posterior de la de la campana de flujo laminar con la tapa medio cerrados. Permitir que el exceso de agua se evapore de la placa MS.</li>
		<li>Coloque la tapa sobre la placa MS. Sellar la placa MS envolviendo la placa con cinta quirúrgica de papel microporoso.</li>
	</ol></li></ol> 4. Crecimiento de Arabidopsis en placas de MS <ol><li>Coloque las placas con la tapa en la parte superior por tres días a 4 ° c y humedad ambiente. 
	Nota: Este proceso se denomina estratificación y sirve para sincronizar la germinación de las semillas individuales.</li>
	<li>Las placas de transferencia al medio de crecimiento.
	<ol><li>Mantenga la temperatura a 23 ° C y la intensidad de la luz a 120-150 μmol/m 2 s con 16 h luz / 8 h oscuro fotoperiodo. Coloque placas plana en el ambiente de crecer con la tapa en la parte superior de modo que las raíces crecen en el medio.</li>
	</ol></li> <li>Dejar crecen las plántulas en las placas de 8 días. 
	Nota: Un período de 8 días de crecimiento permite tarde germinen semillas a germinar. Las placas pueden anotó antes de 8 días si todas las semillas han germinado.</li>
	<li>Anotar las tasas de germinación.
	<ol><li>Registro el número de semillas que han germinado y que no han germinado. Calcular la tasa de germinación dividiendo el número de semillas que germinó por el número total de semillas en la placa de. 
		Nota: La germinación se cuenta cuando la radícula ha proyectado fuera de la capa de semilla y los dos cotiledones son accesibles de forma.</li>
		<li>También contar el número de semillas afectadas por molde para determinar la efectividad de las condiciones de esterilización.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeigel%2C+D+%22Arabidopsis%3A+a+laboratory+manual%22">Arabidopsis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2002).</li>
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<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empirical+analysis+of+transcriptional+activity+in+the+Arabidopsis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Empirical analysis of transcriptional activity in the Arabidopsis genome.</a> Science. 302 (5646), 842-846 (2003).</li>
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<li>Ye, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+ovule+is+the+target+for+Agrobacterium+in+planta+vacuum+infiltration+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation.</a> Plant J. 19 (3), 249-257 (1999).</li>
<li>Kuromori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+collection+of+11+800+single-copy+Ds+transposon+insertion+lines+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A collection of 11 800 single-copy Ds transposon insertion lines in Arabidopsis.</a> Plant J. 37 (6), 897-905 (2004).</li>
<li>Fiers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+14-amino+acid+CLV3%2C+CLE19%2C+and+CLE40+peptides+trigger+consumption+of+the+root+meristem+in+Arabidopsis+through+a+CLAVATA2-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The 14-amino acid CLV3, CLE19, and CLE40 peptides trigger consumption of the root meristem in Arabidopsis through a CLAVATA2-dependent pathway.</a> Plant Cell. 17 (9), 2542-2553 (2005).</li>
<li>Stepanova, A. N., Alonso, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+screening+for+insertional+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">PCR-based screening for insertional mutants.</a> Methods Mol Biol. 323, 163-172 (2006).</li>
<li>O'Malley, R. C., Alonso, J. M., Kim, C. J., Leisse, T. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adapter+ligation-mediated+PCR+method+for+high-throughput+mapping+of+T-DNA+inserts+in+the+Arabidopsis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome.</a> Nat Protoc. 2 (11), 2910-2917 (2007).</li>
<li>López-Ribera, I., Vicient, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+ultrasonication+to+increase+germination+rates+of+Arabidopsis+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of ultrasonication to increase germination rates of Arabidopsis seeds.</a> Plant Methods. 13 (31), (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Al crecer las semillas de Arabidopsis en medios estériles, debe aplicarse algún tipo de esterilización. Tratamientos de esterilización de gas cloro y cloro provocar similares germinación tasa y molde de inhibición del crecimiento. Ningún método de esterilización causa una reducción significativa en tasa de germinación para las semillas con germinación alto potencial; sin embargo, se recomienda la esterilización de lejía para las líneas con menor potencial de germinación (20-70%), debido a la pequeña, aunque no significativa, mejoría en la tasa de germinación en comparación con la esterilización con gas (Figura 3A).
Esterilización de las semillas de Arabidopsis con concentraciones de cloro de 40-100% hasta 10 min ofrece porcentajes de germinación satisfactoria y la supresión de molde eficaz. Aunque las concentraciones de cloro menos que el 40% ofrecer esterilización adecuada para la mayoría los lotes de semillas, usando una concentración de 40% o mayor garantiza esterilización eficaz de incluso los lotes de semillas fuertemente contaminadas. Es importante no superar los 10 minutos de esterilización usando blanqueador con concentraciones iguales o superiores al 80% para evitar defectos en el desarrollo de la plántula y semilla alta mortalidad.
Tratamiento de semillas de Arabidopsis con concentraciones de gas cloro de 16,5% para resultados 1 h en tasas de germinación alta y eliminación de molde adecuada o 6.1%. Concentración de gas de cloro bajo (2,1%) puede ser utilizado con éxito por aumento de la duración de la esterilización 3 h.
Cuando algunas líneas deben ser esterilizados, se recomienda esterilización líquida en una solución de lejía de 50% durante 10 minutos. Para un mayor número de líneas, la esterilización con gas con una concentración de gas de 6.1% para el 1 h es una mejor opción ya que muchas líneas se pueden esterilizar fácilmente y rápidamente con la menos manipulación.
Nuestros resultados proporcionan condiciones estandarizadas para esterilizar gran cantidad de semillas de diferentes genotipos y las semillas con germinación más baja posibles. La única limitación de estas técnicas de esterilización es que no se puede aplicar a las semillas con las tasas de germinación inferior al 20% debido a la mortalidad extensa de semillas. Métodos alternativos, como sonicación17, para aumentar la tasa de germinación en la ausencia de esterilización podrían ser beneficiosos en estos casos.

Thaliana de Arabidopsis (Arabidopsis) es un organismo modelo principal para investigación básica y aplicada en planta biología1,2,3. Mientras que condiciones estándar para el crecimiento de Arabidopsis se han establecido4, el efecto de la esterilización de las semillas en la viabilidad de la semilla no ha sido rigurosamente probado. Medio sólido en placas o cajas se utiliza habitualmente para facilitar el crecimiento de plántulas de Arabidopsis para muchas aplicaciones experimentales, tales como identificación de homocigotos mutantes letales en una población segregante, observación de fenotipos de brote y raíz a principios etapas, aislamiento de tejido libre de patógeno, colección de grandes cantidades de tejido de la planta de semillero, selección de transformantes o plantas resistentes a los medicamentos y la evaluación de germinación1,2,3,4 . Las semillas cosechan de plantas cultivadas en un invernadero o cámara de crecimiento de vez en cuando están contaminados con microorganismos y polvo. Crecimiento de plántulas de Arabidopsis en diferentes tipos de medios estériles requiere esterilización previa de las semillas para eliminar contaminantes microbianos, tales como hongos y bacterias presentes en la superficie de la semilla. El uso de un régimen de esterilización efectiva semilla es esencial para un equilibrio de alta germinación, mínima contaminación y crecimiento vigoroso de las plantas.
Los dos métodos más comunes utilizados para la esterilización de las semillas de Arabidopsis se basan en lejía comercial (fase líquida) y cloro gaseoso (fase vapor). Varios procedimientos han sido empleados para ambos fase líquida esterilización1,4,5,6,7,8,9 , 10 y en la fase vapor de esterilización de Arabidopsis semillas8,10,11,12,13,14,15 ,16. Sin embargo, aunque estos procedimientos han sido eficaces para lograr la esterilización de las semillas de los genotipos utilizados, un análisis detallado del efecto de los tratamientos de esterilización diferentes sobre las semillas de diferentes genotipos no se ha divulgado. Por lo tanto, la optimización de estos procedimientos de esterilización es necesaria para definir las condiciones en que esterilización eficiente combinada con alta germinación.
La Arabidopsis biológica recursos centro (EE) es una posición única para a) prueba de viabilidad de la semilla de una variedad de diferentes genotipos en la colección y b) tomar ventaja de los procedimientos de control de calidad aplicado internamente y en respuesta a comentarios de los usuarios sobre la germinación de la semilla. Los objetivos de los experimentos aquí presentados fueron determinar los efectos de diferentes métodos de esterilización en la germinación de las semillas de los genotipos de una gama de Arabidopsis. Procedimientos de esterilización optimizado que resultan en tasas de germinación de semilla alta manteniendo la contaminación mínima del patógeno se presentan para la esterilización con gas cloro y el cloro.

método estandarizado para la esterilización de alto rendimiento de semillas de arabidopsis

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Thaliana de Arabidopsis Plantas (Arabidopsis) a menudo deben ser cultivadas en medios estériles. Esto requiere esterilización previa de la semilla para prevenir el crecimiento de contaminantes microbianos presentes en la superficie de la semilla. Actualmente, las semillas de Arabidopsis se esterilizan utilizando dos técnicas diferentes de esterilización en condiciones que difieren ligeramente entre laboratorios y no han sido estandarizadas, a menudo resulta en la esterilización sólo parcialmente eficaz o en la mortalidad excesiva de semilla. También la mayoría de estos métodos no son fácilmente escalable a un gran número de líneas de semillas de genotipos diversos. Como tecnologías para el análisis de alto rendimiento de Arabidopsis siguen proliferando, técnicas estandarizadas para esterilizar grandes cantidades de semillas de genotipos diferentes se convierten en esenciales para llevar a cabo estos tipos de experimentos. Se evaluó la respuesta de un número de líneas de Arabidopsis a dos técnicas diferentes de esterilización basado en tasa de germinación de la semilla y el nivel de contaminación de la semilla con microbios y otros patógenos. Los tratamientos incluyeron concentraciones de esterilización agentes y tiempos de exposición, para determinar las condiciones óptimas para la esterilización de las semillas de Arabidopsis. Se han desarrollado protocolos optimizados para dos métodos de esterilización diferentes: bleach (fase líquida) y cloro (Cl2) gas (fase vapor), tanto dando como resultado tasas de germinación de semillas alta y mínima contaminación microbiana. La utilidad de estos protocolos se ilustra a través de la prueba de tipo salvaje y mutantes semillas con una gama de potenciales de germinación. Nuestros resultados muestran que las semillas efectivamente esterilizable mediante cualquier método sin la mortalidad excesiva de semilla, aunque se observaron efectos perjudiciales de la esterilización de las semillas con menor potencial de germinación óptima. Además, se desarrolló una ecuación para ayudar a los investigadores aplicar las condiciones de esterilización estándar de cloro gas en envases herméticamente cerrados de diferentes tamaños. Los protocolos descritos aquí permiten la esterilización de semillas fácil, eficiente y económico para un gran número de líneas de Arabidopsis.

Semillas de Arabidopsis de una cámara de crecimiento, invernadero o campo abierta a veces están contaminadas por diversos microorganismos como bacterias y hongos1,4. Así, germinando las semillas en medios estériles puede ser especialmente difícil debido a la contaminación de las placas, especialmente cuando el suministro de semillas es limitado. El protocolo optimizado para esterilización con gas cloro y el cloro, cuyos resultados se presentan a continuación, minimiza este problema y preserva la viabilidad de las semillas necesarias para aplicaciones de alto rendimiento.
Efectos de la esterilización de la lejía en la germinación de semillas de Arabidopsis Col-0
Bleach es el agente más comúnmente utilizado para la esterilización de las semillas de numerosas especies de plantas. La concentración óptima del agente de la esterilización y el tiempo de exposición varía entre especies. Se han empleado un número de protocolos utilizando lejía para la esterilización de las semillas de Arabidopsis1,4,5,6,7,8,9 , 10. cuatro diferentes concentraciones de cloro con el tiempo de exposición diferentes cinco períodos fueron probados y los resultados se presentan en figura 1. Los tratamientos se aplicaron a semillas de Columbia tipo salvaje (Col-0). El efecto de la concentración de cloro en la germinación de semillas de Col-0 varió según el tiempo de esterilización según lo demostrado por una interacción significativa entre la concentración de cloro y tiempo de esterilización (figura 1, P &lt; 0.001, ANOVA-análisis de la varianza).
En los experimentos con tiempos de esterilización entre 5 y 10 min, tratamientos con todas las concentraciones de cloro provocaron igualmente alta germinación de semillas de Col-0 (figura 1). Tasas de germinación alta también fueron observadas para las concentraciones de cloro de 40% y 50% para todos los tiempos de esterilización. Tratamientos con lejía de 80% y 100% para periodos de más de 10 minutos resultaron en una significativa disminución de la tasa de germinación en comparación con los tiempos más cortos de remojo (P &lt; 0.01, ANOVA). Además, para 80% y 100% bleach tratamientos por 20 min, germinación fue significativamente disminuida en comparación con los correspondiente 40% y 50% blanqueador tratamientos (P &lt; 0,001, ANOVA).
Semillas muestran diversos niveles de blanqueamiento y arrugamiento al usar blanqueador de alta concentración durante 15 minutos o más. Además de relativamente alta (hasta un 32%) la mortalidad de semilla, las semillas germinadas esterilizadas en estas condiciones a menudo demostradas defectos de crecimiento, reflejados en una falta de cotiledones los hypocotyls para desplegar y alargado, dando por resultado la detención del desarrollo. Mayoría de los tratamientos (14 de 20) fueron completamente libres de molde, resultando en general molde nivel promedio de 0.21% ± 0.003 (tabla 1).
Un tratamiento con lejía 50% y un tiempo de remojo de 10 minutos fue seleccionado como el mejor régimen de esterilización porque combinó el porcentaje de germinación alto con buena inhibición del crecimiento de la superficie del patógeno. Este tratamiento fue seleccionado para probar el efecto de la esterilización de bleach en diferentes líneas mutantes como se describe a continuación.
Efectos de la esterilización con gas cloro en la germinación de semillas de Col-0
Para optimizar las condiciones de esterilización de gas cloro, tres diferentes concentraciones de cloro gas se utilizan para esterilizar semillas de Col-0 para dos periodos de tiempo (tabla 2). La concentración de gas se calculó con base en el volumen de HCl concentrado y el volumen del recipiente de esterilización mediante la siguiente ecuación:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq2.jpg">
Esta ecuación fue derivada usando la ley del gas ideal asume 12,3 M de HCl, una temperatura de 23 ° C y presión atmosférica normalizada de 101,3 kPa.
El efecto de la concentración de gas de cloro en la germinación de semillas de Col-0 mostró depende del tiempo de esterilización según lo indicado por una interacción significativa entre el tiempo y los factores de concentración (figura 2A, P &lt; 0.01, ANOVA) . Concentración de gas de cloro no tuvo efectos significativos sobre germinación de semillas de Col-0 sometido a la esterilización de 1 h. Con este tiempo de esterilización, todas las concentraciones de cloro gaseoso promovieron igualmente altos niveles de germinación superior al 85% (P &gt; 0.05, ANOVA). Por otro lado, esterilización 3 h de duración resultó en una disminución significativa en la tasa de germinación para la mayor concentración de cloro gas, en comparación con las dos concentraciones de gas inferiores (P &lt; 0.05, ANOVA). Estos resultados indican que los tratamientos de semillas de Arabidopsis con cualquiera de las concentraciones de gas cloro probados durante 1 hora, o con concentraciones de gas debajo del 16.5% durante 3 horas, son igualmente eficaces para preservar la viabilidad de la semilla ya que las tasas de germinación fueron siempre mayores de 82%. Sin embargo, esterilizar las semillas por 3 h con 16.5% de gas era perjudicial para la germinación de la semilla.
La incidencia de moho también fue dependiente de la concentración de gas y tiempo de exposición. Crecimiento de moho se inhibió eficazmente con las relativamente altas concentraciones de gas cloro 6.1% y 16,5% para 1 h de duración de tratamiento y con todas las concentraciones de gas de 3 h (figura 2B).
Basado en estos resultados, un tratamiento con una concentración de gas de 6.1% para 1 h (tabla 2) fue seleccionado como la mejor condición de esterilización de fase de vapor para probar el efecto de la esterilización con gas en diferentes líneas mutantes, ya que combina alta germinación () tasa 85%) con muy bajo nivel de contaminación de moho (0,02%).
Efectos de la esterilización con gas cloro y cloro en semillas con germinación diferentes potenciales
El análisis estadístico demostró que la respuesta de germinación a los métodos de esterilización era dependiente en el potencial de germinación de las líneas (Figura 3A, P &lt; 0.01, ANOVA). La esterilización con gas ni lejía ni cloro reduce tasa de germinación de semillas con potencial de germinación alta (grupos 4 y 5). Ningún tratamiento tuvo un efecto sobre la tasa de germinación ya bajo del grupo con la menor germinaciónpotencial (Grupo 1). En cambio, la esterilización con gas cloro resultó en una reducción significativa en aproximadamente 12-18% (P &lt; 0.01, ANOVA) en la germinación de semillas con potencial de germinación intermedio (grupos 2 y 3). Esterilización de lejía también disminuyó tasa de germinación en un 13% del grupo 2, pero no disminuyó la tasa de germinación del grupo 3. Aunque no hubo ninguna diferencia significativa en la tasa de germinación entre el cloro y el cloro tratamientos de gas en cualquier grupo de germinación (Figura 3A, P &gt; 0.442, ANOVA), semillas de esterilizado con lejía tenía ligeramente por encima de germinación de semillas esterilizado por el gas en todos los grupos de germinación.
Tratamientos de esterilización alterados (P &lt; 0,001, ANOVA) el porcentaje de semillas afectadas por molde (figura 3B). Ambos esterilización de gas y el blanqueador de cloro resultaron en menos crecimiento de moho (P &lt; 0.05, ANOVA) en comparación a la no esterilización. No hubo diferencias en nivel de molde detectado entre gas y cloro esterilización en cualquier grupo (figura 3B, P &gt; 0.4, ANOVA).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig1.jpg"> 
Figura 1: efectos de la lejía concentración y tiempo de esterilización en la germinación de semillas de Arabidopsis Col-0. Los valores son medio ± SD de 5 repeticiones independientes del experimento. * indica diferencias significativas en relación a lo 5 min remojo duración para una gama de concentraciones de cloro (P &lt; 0.01, ANOVA). #indica diferencias significativas de 80% y concentraciones de bleach 100% en comparación con 40% y 50% para 20 minutos período de tiempo (P &lt; 0.01, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig2.jpg"> 
Figura 2: efectos de cloro gas de concentración y tiempo de esterilización de las semillas de Arabidopsis Col-0. (A) (B) molde nivel y tasa de germinación. Barras de error representan medio ± SD de 5 biológica y 5 técnicos repeticiones del experimento. Medios que no comparten una letra son significativamente diferentes (P &lt; 0.05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig3.jpg"> 
Figura 3: efectos de la esterilización con gas cloro y cloro en semillas con potencial de germinación diferentes. (A) (B) molde nivel y tasa de germinación. Las 100 líneas de SALK T-DNA fueron clasificadas en cinco grupos según su potencial de germinación de define como la tasa de germinación en ausencia de cualquier agente de esterilización. Los grupos basados en la tasa de germinación fueron los siguientes: Grupo 1 (0-20%), grupo 2 (21-50%), grupo 3 (51-70%), grupo 4 (71-90%) y Grupo 5 (91-100%). Las líneas fueron elegidas al azar y su germinación potencial no depende del genotipo. Los valores son medio ± SD Obtenido de tres repeticiones independientes del experimento. Letras ("a", "ab", "c", etc.) por encima de cada valor indican las agrupaciones estadísticas de medios de la categoría. Medios que no comparten una letra son significativamente diferentes (P &lt; 0.05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Tiempo de esterilización (min)</td>
			<td colspan="4">Concentración de cloro (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>2.13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.50%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.36%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0,68%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>0,19%</td>
			<td>0.28%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Nivel de molde de semillas de Col-0 blanqueador-esterilizado.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>JC.</td>
			<td>Tiempo</td>
			<td rowspan="2">% Cloro gas (mol Cl2/mol total de gas)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mL)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td>(h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>3</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: Cloro (Cl2) tratamientos de esterilización de semillas de tipo salvaje de Columbia usando un contenedor de 7 L de gas.
1 mesa adicional: Una hoja de cálculo programada para llevar a cabo el cálculo para diferentes volúmenes de contenedor y % Cl2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/Supplemental_Table%20_1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

El objetivo de este estudio fue determinar los efectos de la esterilización con gas cloro y el cloro en la germinación de la semilla de un genotipos gama de Arabidopsis crecen en medios estériles. Se han desarrollado protocolos de esterilización optimizado para prevenir el crecimiento de contaminantes microbianos mientras que proporciona la supervivencia satisfactoria de la semilla.

Método estandarizado para la esterilización de alto rendimiento de semillas de Arabidopsis

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar condiciones estandarizadas para la esterilización exitosa de semillas de un gran número de genotipos de Arabidopsis, al tiempo que se previene el crecimiento microbiano. Este método le permite esterilizar cientos de muestras de semillas a la vez, simplificando así un paso crítico de la preparación del material vegetal en los campos de la genómica, la proteómica, la metabolómica y otros estudios de alto rendimiento. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona condiciones en las que se combina una esterilización eficiente con una alta tasa de germinación para un gran número de muestras de semillas.Para empezar, prepara una solución de lejía al 50% con agua destilada. A cada 200 mililitros de solución de lejía, agregue 50 microlitros de detergente TWEEN 20. La solución de lejía se puede almacenar hasta por un mes, siempre y cuando solo se abra en condiciones estériles.A continuación, alícuota 100 semillas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Esto se puede hacer manualmente o mediante el uso de un robot de semillas hecho a medida. Ahora, en una campana de flujo laminar, agregue 500 microlitros de la solución de lejía al 50% a las semillas.Luego, transfiera los tubos a un rotador e incube las semillas en la lejía con una agitación leve durante 10 minutos. Después de 10 minutos, aspire la solución de lejía de los tubos eliminando la mayor cantidad posible. Luego, agregue 500 microlitros de agua destilada estéril e invierta los tubos para mezclar.Deje que las semillas se asienten, luego aspire el agua y reemplácela con otra alícuota para lavar las semillas nuevamente. Realice un total de seis lavados de este tipo con agua destilada esterilizada. Una vez que las semillas se hayan lavado a fondo con agua, suspenderlas en un mililitro de agua antes de colocarlas.Antes de comenzar el proceso de esterilización, calcule los volúmenes de lejía y ácido clorhídrico necesarios para producir cloro gaseoso. Utilice la ecuación proporcionada para obtener el 6% de cloro gaseoso recomendado. Asegúrese de calcular con precisión el volumen de HCl necesario para garantizar una esterilización exitosa y evitar salpicaduras.Asegúrese de usar guantes y una bata de laboratorio durante este protocolo y cambie los guantes cada vez que se humedezcan con ácido o lejía. Debajo de una campana extractora, transfiera los viales de semillas a una rejilla con las tapas abiertas. Luego, coloque la rejilla en un recipiente de plástico en el que se pueda realizar la esterilización y prepare tiras de película de parafina para sellar la tapa al recipiente.Ahora, cargue el vaso con 100 mililitros de lejía y luego coloque un vaso de precipitados de 250 mililitros dentro. El uso de un exceso de lejía es una característica de seguridad y el vaso de precipitados debe tener al menos el doble del volumen total de la solución que contiene. Además, siempre manipule la lejía y los ácidos por separado.A continuación, agregue tres mililitros de ácido clorhídrico al vaso de precipitados y, a continuación, cierre inmediatamente el recipiente y séllelo con parafilm. Monitoree el recipiente durante una hora para asegurarse de que el gas se acumule durante la esterilización. El gas de cloro debe ser visible como una tenue neblina amarilla dentro del recipiente o se puede verificar que la solución se vuelva amarilla.Revise periódicamente el sello del recipiente. Si la tapa se desmonta o el sello de parafina comienza a aflojarse, vuelva a sellar herméticamente la tapa con una capa adicional de película de parafina. Después de la esterilización de una hora, abra una esquina del recipiente para ventilar el gas durante un período de tres horas.Después de tres horas de ventilación, tape todos los tubos y almacene las semillas esterilizadas en condiciones secas hasta que estén plateadas. Ahora, neutralice la reacción agregando lentamente 1,5 gramos de polvo de bicarbonato de sodio mientras revuelve con una varilla de vidrio para disolver los sólidos. Siga agregando bicarbonato de sodio hasta que las burbujas de gas de dióxido de carbono hayan dejado de formarse.Luego, mida el pH de la solución y, si es necesario, agregue bicarbonato de sodio adicional hasta que el pH sea neutro. Siempre que la solución no huela mal, se puede desechar. De lo contrario, espere hasta que todos los olores se disipen.Agregue 500 microlitros de agua destilada esterilizada a cada tubo de semillas esterilizadas con gas. A continuación, vierta las semillas en una placa MS y extiéndalas uniformemente utilizando un asa de inoculación estéril de un solo uso o una punta de pipeta estéril. Después de tres días de estratificación de semillas a cuatro grados centígrados, transfiera las placas a 23 grados centígrados con 16 horas de exposición diaria a la luz.Mantenga los párpados en la parte superior para que las raíces crezcan en el medio. Después de ocho días de crecimiento, marque la fracción de semillas que han germinado. La germinación se cuenta cuando el radical se ha proyectado fuera de la cubierta de la semilla y los dos cotiledones son visibles.Además, cuente el número de semillas afectadas por el moho para determinar la efectividad de las condiciones de esterilización. Se probaron cuatro concentraciones diferentes de lejía en cinco tiempos de exposición diferentes en semillas de tipo silvestre Columbia. Las altas concentraciones de lejía afectaron negativamente la germinación con demasiada exposición.Sin embargo, se observaron altas tasas de germinación con 40 y 50% de lejía en todos los tiempos de exposición. Las semillas esterilizadas con altas concentraciones de lejía tuvieron una alta mortalidad y a menudo mostraron defectos de crecimiento, pero por lo general estaban completamente libres de moho. Se determinó que la esterilización con lejía al 50% durante 10 minutos tenía el equilibrio óptimo entre la inhibición del moho y la germinación saludable.Para optimizar las condiciones de esterilización del gas cloro, se utilizaron tres concentraciones diferentes de cloro gaseoso para esterilizar semillas de tipo silvestre Columbia durante dos períodos de tiempo diferentes. Hubo una interacción significativa entre el tiempo y la concentración de gases. A una hora, no hubo efecto sobre la germinación, mientras que la concentración más alta de gas fue perjudicial a las tres horas.Por lo tanto, se eligió un período de esterilización de una hora. El crecimiento de moho se inhibió eficazmente con exposiciones a gases de tres horas o, para exposiciones de una hora, utilizando seis o 17% de gas. Por lo tanto, se determinó que una concentración de gas del 6% durante una hora era óptima para la germinación y la inhibición del moho.Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para esterilizar con éxito cientos de líneas de semillas por día si se realiza correctamente. Las semillas esterilizadas con gas también se pueden almacenar durante un período prolongado de tiempo en condiciones secas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar las ecuaciones proporcionadas para calcular los volúmenes requeridos de HCl y lejía.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los estudios de asociación de todo el genoma, con el fin de vincular una variedad de genotipos diferentes y los fenotipos de interés. Buena suerte con tus experimentos.

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