Un análisis Simple reportero basado en fluorescencia para identificar los componentes celulares necesarios para la toxina de ricina una cadena (RTA) trata de levadura

El objetivo general de este ensayo indicador simple basado en fluorescencia es detectar los componentes celulares necesarios para el tráfico adecuado de la toxina de ricina A o la cadena RTA en el organismo modelo de levadura. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el transporte intercelular de ribosoma en la activación de una toxina B. En nuestro caso, la subunidad citotóxica de la toxina ricina simple de la membrana plasmática al citosoma.

La principal ventaja de este ensayo es la oportunidad de analizar el efecto de un gen individual de levadura en el transporte de RTA de una manera rápida y económica. Comience este protocolo con la transformación de celdas como se detalla en el protocolo de texto. Inocular cinco mililitros de medio de kanamicina LB con células que contengan el plásmido de expresión de RTA o el vector vacío.

Incubar las células a 37 grados centígrados y 220 RPM durante 24 horas. Complementar un litro de medio LB de kanamicina con cinco mililitros de precultivo. A continuación, incubar las células a 37 grados centígrados y 220 RPM hasta que las células hayan alcanzado una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,8 a 1,0.

A continuación, reduzca la temperatura de cultivo a 28 grados centígrados. Inducir la expresión de RTA de E.Coli mediante la adición de IPTG a una concentración final de un milimolar. Después de 3,5 horas a 28 grados centígrados y 220 RPM, recoja las células por centrifugación a 10.000 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.

A continuación, lavar el pellet con cinco mililitros de tampón aglutinante y el pellet a 10.000 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Después de repetir el lavado una vez, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tampón aglutinante. Sonica las células en hielo usando cinco ciclos de un pulso de 15 segundos y una pausa de 30 segundos.

Después de centrifugar el licado celular a 21.000 g y cuatro grados centígrados durante 15 minutos, filtre el sobrenadante utilizando un sistema de filtro de jeringa estéril. Utilice un sistema de purificación automatizado, equipado con una columna de afinidad de cinco mililitros a base de níquel para purificar la fracción RTA marcada con HIS del sobrenadante de E. Coli filtrado estéril. En general, use una velocidad de alusión de un mililitro por minuto y enfríe todo el sistema de purificación para evitar la unión de toxinas ineficiente y la pérdida de actividad de toxinas.

Equilibre brevemente la columna de afinidad con 20 mililitros de búfer de enlace para eliminar el búfer de almacenamiento. A continuación, aplique el sobrenadante estéril y filtrado sobre la columna de afinidad con una jeringa. Lave la columna con 25 a 35 mililitros de tampón de unión para eliminar las proteínas no unidas de la columna.

Realice el paso de lavado hasta que los absorbentes de rayos UV a 280 nanómetros estén cerca del valor inicial de rayos UV. A continuación, eluir la fracción RTA unida con 20 a 35 mililitros de tampón de elución y mantener la muestra en hielo. Es importante comenzar el muestreo de la fracción RTA poco después de que aumente el valor UV, 280 y detener el muestreo de la fracción RTA cuando vuelva a alcanzar la línea base original.

Para desalar la fracción RTA eludida, reemplace la columna de afinidad del sistema de purificación por la columna de desalinización y equilibre la columna con 20 mililitros de sorbitol 0,8 molar. Aplique la fracción RTA eludida a la columna a través de una jeringa. Lave la columna con 100 mililitros de sorbitol 0,8 molar y diluya la fracción RTA desalada en un tubo de 15 mililitros tan pronto como la absorción de UV comience a aumentar.

Para evitar la contaminación por sal, deténgase en el muestreo de fracciones directamente cuando aumente la conductancia. Almacene la fracción RTA eludida a cuatro grados centígrados. Después de transformar la levadura como se describe en el protocolo de texto, elija tres clones de levadura diferentes de cada plato.

Inocular los clones en 100 mililitros de medio rafinosa de caída de lucina a 220 RPM y 30 grados Celsius a una densidad óptica a 600 nanómetros de 1.0 a 2.0. Centrifugar las células a 25 grados centígrados durante cinco minutos a 10.000 g. Después de lavar las células dos veces con cinco mililitros de agua estéril, vuelva a suspender las células en 50 mililitros de tampón esferoplasping.

Incubar el cultivo de 50 mililitros a 100 RPM y 30 grados centígrados durante 90 minutos. Después de la centrifugación a 400 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos, lavar las células dos veces con cinco mililitros de medio rafinosa de caída de lucina estabilizada. A continuación, vuelva a suspender las células en cinco mililitros del mismo medio para utilizar las células directamente para las mediciones del ensayo GFP reportero.

Siembre los esferoplastos de células de levadura en placas de 96 pocillos. A cada pocillo, agregue 70 microlitros de medio rafinosa de caída de lucina estabilizado, que contenga el control negativo, expresando el vector vacío o RTA purificado en una concentración final de RTA de cinco micromolares. Agregue 70 microlitros de medio de caída de lucina estabilizado a cada uno de los pocillos restantes para llevar su volumen total a 270 microlitros.

Para un control positivo de la inhibición de proteínas, agregue 70 microlitros de solución G418 estabilizada con sorbitol 0.8 molar, ya que G418 evita la expresión de GFP en levadura. Agregue inmediatamente 30 microlitros de solución de galactosa estabilizada para inducir la expresión de GFP. Prepare un control negativo adicional agregando 30 microlitros de medio rafinosa de caída de lucina estabilizada en lugar de 30% de galactosa.

Después de terminar la preparación de la muestra, coloque la placa de 96 pocillos en un lector de fluorescencia y prepárese para la medición utilizando el juego de filtros de 475, 509 nanómetros requerido para la detección de fluorescencia GFP. Realice mediciones a 30 grados Celsius, 120 RPM y un diámetro de agitación de un milímetro durante un período de tiempo de 20 horas con intervalos de medición de 10 minutos. Aquí se muestra un gráfico de purificación representativo de la cromatografía de afinidad de RTA y el control de vector vacío.

El pico azul en el cuadro negro representa la fracción RTA enlazada. Como se muestra en la caja negra, no se elude ninguna proteína de la columna en el control negativo. Aquí se muestra un diagrama de desalinización de una fracción RTA purificada por afinidad.

El diagrama muestra la separación de la fracción de proteína RTA y la fracción de sal. Los resultados de la tinción de Coomassie después de una purificación y desalinización exitosas muestran lisado celular o muestras purificadas de diferentes variantes de RTA. En este estudio se utilizó el ATR no modificado.

Para validar el ensayo indicador espaciado de fluorescencia, se midió la fluorescencia relativa de GFP de los esferoplastos de levadura de tipo salvaje en condiciones inducidas y no inducidas después de 20 horas de inducción de GFP. También se analizó la fluorescencia relativa de GFP en presencia de RTA, G418 o el control negativo. También se midió la fluorescencia relativa de GFP para mutantes seleccionados en los que se sabe que las proteínas correspondientes están involucradas y no involucradas en el tráfico de RTA en levadura.

La línea punteada representaba un umbral de significación. Una vez que se domina la expresión y purificación de RTA, los resultados del ensayo de informe de fluorescencia se pueden recibir en un día. Además, este método allana el camino para que los investigadores en el campo de la inactivación de ribosomas de toxinas B estudien sus raíces de intoxicación en una levadura de organismo modelo eucariota.