Name: Un análisis Simple reportero basado en fluorescencia para identificar los componentes celulares necesarios para la toxina de ricina una cadena (RTA) trata de levadura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprende a identificar componentes celulares necesarios para el transporte de la toxina de ricina RTA en levadura mediante un ensayo simple basado en fluorescencia. Este método permite analizar genes individuales de forma rápida y económica.

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Partes de este estudio fueron amablemente patrocinadas por una subvención de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).

Nota: Un resumen del flujo de trabajo experimental general se representa en la figura 1.
PRECAUCIÓN: RTA es altamente tóxica para los seres humanos. Se necesita permiso de laboratorio de seguridad S2 (bioseguridad nivel 2 equivalente). Favor de utilizar guantes durante todo el experimento.
1. la expresión heteróloga de su etiquetado RTA en Escherichia coli
<ol>
	<li>Transformar las células de e.coli con el plásmido de expresión pET24-RTA(su) 6 o el vector vacío pET24a(+) usando electroporación estándar protocolos9,10. Las células que contienen el plásmido vacío sirven como control negativo.</li>
	<li>Después de la selección de clones positivos en placas de LB (100 μg/mL) que contiene kanamicina, inocular las células que contienen el plásmido de expresión de la RTA o el vector vacío en medio dekan 5 mL LB (medio LB con 100 μg/mL de kanamicina) e incube a 37 ° C y 220 rpm por 24 h.</li>
	<li>Suplemento 1 LB de Lkan mediana con precultivo 5 mL e incubar las células a 37 ° C y 220 rpm hasta que las células han alcanzado un OD600 de 0.8-1.0 (aproximadamente 3-4 h). Después de eso, reduzca la temperatura de cultivo a 28 ° C y preparar un 1 M de la solución madre de Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) de H2O.</li>
	<li>Inducen la expresión de la RTA de la e. coli añadiendo IPTG a una concentración final de 1 mM.</li>
	<li>Después de 3,5 horas a 28 ° C y 220 rpm, cosecha las células por centrifugación a 10,000 x g y 4 ° C durante 10 minutos, lavar el pellet dos veces con 5 mL de tampón de unión (500 mM NaCl, imidazol de 10 mM y 20 mM KH2PO4 pH = 7.4) a 10.000 x g y 4 ° C por 10 min y resuspender pellet en 5 mL de tampón de Unión. Nota: Protocolo puede hacer una pausa en esta etapa y las células pueden almacenarse a 80 ° C por varios días.</li>
</ol>
2. purificación de su etiquetado RTA mediante cromatografía de afinidad
<ol>
	<li>Someter a ultrasonidos las células en hielo utilizando el siguiente protocolo: pulso s 15 (20 micras), 30 de s de pausa. Repita este paso cinco veces.</li>
	<li>Centrifugar células lisado en 21.000 x g y 4 ° C por 15 minutos y filtrar el sobrenadante utilizando un sistema de filtros de jeringa estériles (tamaño de poro de 0,2 μm). Nota: Pellets celulares de sonicación con éxito muestras muestran fronteras transparentes.</li>
	<li>Utilizar un sistema automatizado de purificación con 5 mL Ni2 +-basado en columna de afinidad para purificar la fracción de su etiquetado RTA de la estéril filtrada e. coli sobrenadante. En general, utilice una velocidad de elución de 1 mL/min y enfriar el sistema de purificación todo para evitar la Unión de la toxina no eficiente y pérdida de la actividad de la toxina. Nota: Los parámetros para la purificación eficiente de RTA se enumeran en la tabla 1. Véase también Becker et al. para más información9.<ol>
		<li>Brevemente, equilibrar la columna de afinidad con 20 mL de tampón de Unión para eliminar el buffer de almacenamiento. Aplicar el sobrenadante estéril filtrado en la columna de afinidad utilizando una jeringa.</li>
		<li>Lavar la columna con 25-35 mL de tampón de Unión para eliminar las proteínas no Unidas de la columna. Realizar el paso de lavado hasta absorbancia UV a 280 nm es cercana al valor inicial de la UV.</li>
		<li>Eluir la fracción unida de la RTA en 20-35 mL de tampón de elución (imidazol de 500 mM, 500 mM NaCl, 20 m m KH2PO4, pH = 7.2) y mantener la muestra en hielo (figura 2A y figura 2B). Nota: Elución de la fracción de RTA se caracteriza por un aumento en la absorción de UV. Tenga en cuenta para recoger exclusivamente esta fracción para evitar la contaminación con proteínas encuadernadas no específicas.</li>
		<li>Utilice 20 μl de las muestras eluídas a cabo azul Coomassie tinción11 o mancha blanca /negra occidental análisis12,13 (opcional). Utilizar primaria contra su anticuerpos (1:1, 000) y secundaria anti-anti-ratón-IgG-HRP (1:10, 000) para detectar RTA y verificar la pureza de la muestra (figura 3).</li>
		<li>Eluídas fracción RTA en una columna de 5 mL desalación del desalt y equilibrar la muestra en 0,8 M sorbitol.<ol>
			<li>Vuelva a colocar la columna de afinidad de sistema de purificación de la columna de la desalación y primero equilibrar la columna con 20 mL de sorbitol de 0,8 M.</li>
			<li>La fracción de RTA eluída se aplica a la columna por medio de una jeringa. Lavar la columna con 100 mL de sorbitol de 0,8 M y eluir la fracción RTA desalada en un tubo de 15 mL en cuanto a la absorción UV comienza a aumentar (figura 2).</li>
			<li>Almacenar la fracción RTA eluída a 4 ° C. Nota: Directamente deje de muestreo fracción de RTA cuando aumenta la conductancia para evitar la contaminación de sal. Parámetros para el procedimiento de desalación se enumeran en la tabla 1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Concentrado de fracción de RTA eluída a 10.000 x g y 4 ° C por 30-180 min., usando una columna de giro de corte 10 kDa hasta un volumen final de 1-2 mL y almacenar la muestra a 4 ° C durante 3-4 semanas. PRECAUCIÓN: No congelar la muestra desde la congelación conduce a una pérdida completa de actividad de RTA.</li>
	<li>Determinar la concentración de proteína usando un kit de determinación de la proteína convencional. Concentración de la proteína debe estar en el rango de 1-1.5 mg/mL. Nota: RTA tiende a precipitar si la concentración de proteína es muy alta (&gt; 5 mg/mL).</li>
</ol>
3. transformación y eliminación de la pared celular de levadura
<ol>
	<li>Transformar a mutantes de deleción de levadura salvaje o seleccionado con la GFP reportero plásmido pRS315-K28SP- GFP6 utilizando acetato de litio estándar transformación métodos14. Incubar las células en el abandono de la leucina (d/o) placas de glucosa (glucosa 2%, agar 1,5%, sulfato de amonio 0,5%, 0,17% levadura nitrógeno Base (YNB) y 0.087% d/o mix sin leucina) a 30 ° C durante 2-3 días para la selección de clones positivos.</li>
	<li>Escoger 3 clones de levaduras diferentes de cada placa y sembrar los clones en 100 mL de leucina d/o medio de rafinosa (rafinosa 2%, sulfato de amonio 0,5%, 0,17% YNB y 0.087% d/o mezclar sin leucina) en 220 rpm y 30 ° C a OD600 = 1.0-2.0 (2-4 x 107 células/mL). Nota: El crecimiento de las células de las levaduras diferentes de eliminación es diferente. Monitor OD600 mediante un espectrofotómetro.</li>
	<li>Para calcular los valores de OD600 , diluir las muestras a OD600 = 0.1-0.3 (1:5 a 1:10 diluciones) y medir OD600 en un espectrofotómetro. Como referencia, el uso de H2O complementado con la correspondiente cantidad de medio de leucina d/o raffionose.</li></ol>Por último, resuspender OD600 = 125 en 5 mL de agua estéril (5 x 108 células/mL).
	<li>Centrifugar las células a 25 ° C por 5 min a 10.000 x g, lave las células dos veces con 5 mL de agua estéril y resuspender las células en 50 mL de tampón de spheroplasting (sorbitol de 0,8 M, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM CaCl2, 2 mM Ditiotreitol (DTT) y enzima lítica de 200 μg/mL).</li>
	<li>Incubar el cultivo de 50 mL a 100 rpm y 30 ° C por 90 min opcional: Monitor formación spheroplast cada 15 min por microscopía de contraste de fase. Bajo el microscopio, las células deben tener un oscuro color gris translúcido. Células brillantes (refractile) son digeridas, mientras que fantasmas (gris pálido células con poco, si cualquiera, estructura interna) se digieren demasiado.</li>
	<li>Comprobar eficacia de preparación spheroplast para cada muestra.
	<ol>
		<li>Después de terminar paso 3.5, 4 μL de la cultura spheroplasted 50 mL de la mezcla con 496 μl de tampón de spheroplasting (aproximadamente 2 × 106 Esferoplastos) y centrifugar 10 min a 400 x g.</li>
		<li>Pellets de resuspender en 10 mL de H2O destilada, muestra de vortex por 30 s y placa 10 μl de la muestra en placas de glucosa de d/o leucina (glucosa 2%, agar 1,5%, sulfato de amonio 0,5%, 0,17% YNB y 0.087% d/o mix sin leucina).</li>
		<li>Incube las células durante 3 días a 30 ° C. Contar el número total de colonias de células crecidas en la placa. Para la evaluación de datos, utilizar sólo las muestras con eficiencia superior al 98% (total de número de la colonia de células &lt; 40 colonias/placa).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Centrifugar las células de paso 3.5 a 400 x g y 4 ° C por 10 minutos y lavar las células dos veces con 5 mL estabilizado leucina d/o rafinosa medio (0,8 M sorbitol, rafinosa 2%, sulfato de amonio 0,5%, 0,17% YNB y 0.087% mezcla de abandono sin leucina). Resuspender las células en medio de 5 mL leucina estabilizada d/o rafinosa (1 x 108 células/mL) y utilizar directamente las células para las mediciones de ensayo reportero GFP (sección 4).</li>

4. GFP reportero ensayo medida en placas de 96 pocillos
<ol>
	<li>Semilla a los Esferoplastos de células de levadura obtenidas en el paso 3.7 en placas de 96 pocillos (200 μL/pocillo).</li>
	<li>Añadir 70 μl leucina estabilizada d/o rafinosa de medio que contiene el control negativo (efluente de una Ni2 +-afinidad purificado célula de lisado de células inducida por IPTG de e. coli expresando el vector vacío) o purificada RTA en una concentración final de RTA de 5 μm ( correspondiente a 160 g/L RTA) en cada pocillo.</li>
	<li>Añadir 30 μL estabilizado galactosa solución (30% galactosa, sorbitol de 0,8 M) para inducir la expresión de GFP y posteriormente iniciar la medición. Nota: Realizar al menos 3 repeticiones técnicas por experimento y 3 biológicos Replica por cepa de levadura.</li>
	<li>Después de terminar la preparación de la muestra (pasos 4.1-4.3), pone la placa de 96 pocillos en un lector de fluorescencia y comenzar la medición. Utilice el filtro de 475/509 nm sistema requerido para la detección de la fluorescencia de GFP. Realizar mediciones a 30 ° C, 120 rpm y con un diámetro de agitación de 1 mm sobre una ventana de tiempo de 20 h (medición de intervalos de 10 min). Nota: El conjunto de filtro GFP está normalmente disponible en todos los sistemas de lector. Temperatura, ventana de tiempo, medición de intervalos y la RTA concentración puede ajustarse a necesidades propias. Resultados representativos se muestran en la figura 4.</li>
	<li>Opcional: Usar controles internos adicionales en la medida de control de calidad. Preparar un control negativo añadiendo medio rafinosa d/o 30 μl de leucina estabilizado en lugar de 30% galactosa (sin inducción de GFP). Además, añadir 70 μl de solución de 0,8 M sorbitol estabilizado G418 (300 μg/mL). El inhibidor de la proteína traducción G418 sirve como control positivo para la inhibición de la proteína impide la expresión de GFP en la levadura.</li>
	<li>Calcular la fluorescencia de GFP relativa en porcentaje para el momento de 20 h según la siguiente ecuación (ver Figura 4A): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56588/56588eq1.jpg"> donde NC es el control negativo
	<ol>
		<li>Por otra parte, determinar la fluorescencia de GFP relativa para cada punto de medición (en este caso 10 min, véase también paso 4.4) utilizando la ecuación anterior. Como se muestra en la Figura 4B, crear un gráfico por borrar las intensidades de fluorescencia de GFP (eje y) con el tiempo (eje x).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-competent+and+folding-defective+forms+of+ricin+A+chain+have+different+fates+after+retrotranslocation+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum.</a> Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).</li>
<li>Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+entry+of+Shiga-like+toxin+a+chain+from+the+yeast+endoplasmic+reticulum+requires+catalytically+active+Hrd1p%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p.</a> PLoS One. 7 (7), e41119(2012).</li>
<li>Moreau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screens+identify+genes+required+for+Ricin+and+PE+intoxications%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications.</a> Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li>
<li>Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+an+external+Lys-Asp-Glu-Leu+%28KDEL%29+protein+from+the+plasma+membrane+to+the+endoplasmic+reticulum%3A+studies+with+cholera+toxin+in+Vero+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells.</a> J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).</li>
<li>Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Reporter+Assay+to+Identify+Cellular+Components+of+Ricin+Toxin+A+Chain+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking.</a> Toxins (Basel). 8 (12), (2016).</li>
<li>Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+depurination+is+not+sufficient+for+ricin-mediated+cell+death+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae.</a> Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).</li>
<li>Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ricin%3A+structure%2C+mode+of+action%2C+and+some+current+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Ricin: structure, mode of action, and some current applications.</a> Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).</li>
<li>Becker, B., Schmitt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+yeast+as+model+to+study+ricin+toxin+a+uptake+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking.</a> Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).</li>
<li>Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24674070">Coomassie blue staining.</a> Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).</li>
<li>Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications.+1979%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979.</a> Biotechnology. 24, 145-149 (1992).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).</li>
<li>Vitetta, E. S., Yen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+functional+properties+of+genetically+engineered+ricin+B+chain+lacking+galactose-binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity.</a> Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).</li>
<li>Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+an+endoplasmic+reticulum+retrieval+sequence+to+ricin+A+chain+significantly+increases+its+cytotoxicity+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells.</a> J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).</li>
<li>Jablonowski, D., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymocin%2C+a+composite+chitinase+and+tRNase+killer+toxin+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast.</a> Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).</li>
<li>Jablonowski, D., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+RNA+polymerase+II+is+affected+by+Kluyveromyces+lactis+zymocin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin.</a> J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).</li>
<li>Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kluyveromyces+lactis+zymocin+mode+of+action+is+linked+to+RNA+polymerase+II+function+via+Elongator%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator.</a> Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Cuando se realiza el protocolo anterior, recomendamos las siguientes sugerencias para lograr un resultado exitoso del experimento.
Para la expresión de proteínas heterólogas, es importante no exceder la concentración de 1 mM IPTG. Concentraciones de IPTG &#62; 1 mM inhibir expresión de RTA inducida por el promotor y plomo para bajar rendimientos de toxina. Además, las células no deben ser cultivadas a temperaturas superiores a 28 ° C para evitar la formación de cuerpo de inclusión, plegable in...

Pacientes que sufren de infecciones por bacterias de producir la toxina representan una grave carga médica y financiera para cada sistema de salud social, en particular tratamientos terapéuticos eficaces son todavía en gran parte desaparecidos. Desarrollar nuevas estrategias terapéuticas, los mecanismos complejos de la intoxicación del médicamente relevante A las toxinas B como la toxina del cólera, Shiga toxina ricina necesita ser entendido completamente a nivel molecular basado en ensayos poderos novela que deben aplicarse.
En los últimos años, varios estudios intentaron analizar A / transporte de la toxina B en levaduras y células de mamíferos mediante métodos desperdiciadores de tiempo y costosa como toxina radiactivo etiquetado1,2 , así como basado en el siRNA se acerca a3. En algunos casos, trata de la toxina ha sido visualizado en vivo por microscopía de fluorescencia después de acoplamiento químico o genética de subunidades de la toxina individual con fluoróforos, puntos cuánticos o proteínas fluorescentes4,5. Por desgracia, tales modificaciones conducen a menudo a propiedades naturales inactivadas o alteradas de las toxinas. Otra forma elegante de responder indirectamente a una amplia variedad de cuestiones científicas es el uso de sistemas de reportero basados en enzimas como lacZ, luciferasa o proteínas fluorescentes (e.g. GFP o Discosoma sp. (proteína fluorescente roja dsRed)).
En este manuscrito, se describe un protocolo simple que identifica los componentes celulares necesarios para el transporte intracelular de RTA aplicada extracelularmente en S. cerevisiae. Por lo tanto, un plásmido reportero de fluorescencia que contiene una señal N-terminal ER-import seguida de GFP actúa como un sensor de la biosíntesis de proteína, que indirectamente mide la inhibición de la traducción de RTA-mediado proteína GFP fluorescencia emisión después de la en vivo traducción6. En caso que endocitosis RTA o tráfico intracelular negativamente (o positivamente) sufre en un mutante de levadura especial eliminación en comparación con el tipo salvaje, esto se puede detectar a través de un aumento (o disminución) en la fluorescencia de GFP emisión6.
Hasta ahora, todos los métodos de análisis de transporte de RTA en células de levadura fueron restringidos en el proceso de retro-desplazamiento ER al citosol de RTA. En un sistema tan artificial, que contiene una señal de importación ER RTA se expresa de un promotor inducible, resultando en un fenotipo suicida1,7. Aunque la célula Unión subunidad B de ricina es además que falta en la configuración experimental descrita en este manuscrito y, por lo tanto, no totalmente representa la situación natural de ricina holotoxin intoxicación8, transporte de la toxina del plasma membrana a través del aparato de Golgi al ER puede mímico de cerca con este ensayo novela. Curiosamente, los resultados preliminares obtenidos en el estudio piloto indican que las vías de tráfico utilizadas por RTA revelan similitudes sorprendentes con la ruta de intoxicación de ricina holotoxin.
En Resumen, el método descrito puede ser utilizado para determinar el papel específico de las proteínas celulares en endocitosis RTA y trata de levadura. Además, este montaje experimental podría ser fácilmente adaptado a otro ribosoma inactivar las toxinas producida y secretada de diversas levaduras y especies bacterianas como zymocin o toxina Shiga.

<table><tbody><tr><td><fuertes>Cepas bacterianas y de levaduras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21 DE3(Gold)</td><td>Aligent Technologies</td><td>230130</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae BY4742</td><td>Euroscarf</td><td>Y10000<</td><td></td></tr><tr><td>em>S. cerevisiae BY4742 deleción</td><td>mutantes Dharmacon</td><td>YSC1054</td><td>toda la colección</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmidios utilizados en este protocolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET24a(+) (Novagen)</td><td>Millipore</td><td>69772-3</td><td></td></tr><tr><td>pET-RTA(His6)</td><td>Becker et al. (2016)3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 20T</td><td>USBio</td><td>Z1000.250 enzima lítica USBio Z1000.250</td><td>para la pared celular se</td></tr><tr>añadió un<td>medio de caldo LB</td><td>Thermo Scientific</td><td>10855021</td><td>15 g de agar para la producción de placas</td></tr><tr><td>YNB</td><td>Thermo Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de levadura sin leucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1376-20G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>D-rafinosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-galactosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750-10MG</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>11811031</tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Roth</td><td>3899.1</td><td></td></tr><tr><td>PAGE regla preteñida Fermentas</td><td></td><td>26616</td><td>escalera de proteínas utilizada para el análisis occidental</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</ strong</td></tr><tr><td>>Material para la purificación de RTA, la desalinización y las mediciones del lector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro</td><td>Amersham</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soniprep 150</td><td>MSE</td><td></td><td>modelo antiguo, otros modelos disponibles</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210470</td><td>modelo antiguo, ya no está disponible</td></tr><tr><td>& Auml; KTAPurifier</td><td>Thermo Scientific</td><td>28406266</td><td>El producto se suspende y se sustituye</td></tr><tr><td>HisTRAP Columna HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>Columna de desalinización HiTRAP</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0003-29</td><td></td></tr><tr><td>Midisart filtro estéril</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td>0.2 &micro; m tamaño de poro</td></tr><tr><td>kit de ensayo de proteínas BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>kit de ensayo de 660 nm</td><td>Thermo Scientific</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>placas de 96 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>260860</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td><Anticuerpos fuertes> (opcional)</anticuerpo primario ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tetra-His</td><td>Qiagen</td><td>34670</td><td>; dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario Anti-HRP Sigma-Aldrich</td><td></td><td>A9044-2ML</td><td>, dilución 1:10.000</td></tr></tbody></table>

un análisis simple reportero basado en fluorescencia para identificar los componentes celulares necesarios para la toxina de ricina una cadena (rta) trata de levadura

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

Bacteriana y planta A / toxinas B explotan las vías de tráfico naturales en las células eucariotas para llegar a sus destinos intracelulares en el citosol y en última instancia matar. Tal A / toxinas B consisten en generalmente un enzimático activo Asubunit (p. ej., toxina de ricina (RTA)) y una o más células enlace Bsubunit(s), que es responsables de toxina vinculante específico para receptores de superficie celular. Nuestro conocimiento actual de cómo A las toxinas B son capaces de intoxicar eficientemente células ayudó a los científicos para entender los mecanismos celulares fundamentales, como la endocitosis y la proteína intracelular clasificación en células eucariotas superiores. Desde un punto de vista médico, asimismo es importante identificar las rutas de tráfico principales toxina para encontrar soluciones de tratamiento adecuada para pacientes o para eventualmente desarrollar aplicaciones terapéuticas de toxina para terapia del cáncer.
Desde el análisis del genoma del tráfico en células de mamíferos la toxina B es complejo, lento y caro, varios estudios sobre una / transporte de la toxina B han llevado a cabo en el organismo del modelo de la levadura Saccharomyces cerevisiae. A pesar de ser menos complejos y fundamentales procesos celulares de levadura y las células eucariotas superiores pueden transferirse a la situación mamífera son similares y muy a menudo los resultados obtenidos en la levadura.
Aquí, describimos un análisis reportero rápido y fácil de utilizar para analizar el tráfico intracelular de RTA en la levadura. Una ventaja esencial de la prueba de nuevo es la oportunidad para investigar no sólo retro-desplazamiento de RTA desde el retículo endoplásmico (ER) en el citosol, pero algo endocitosis y toxina retrógrada transportan de la membrana del plasma en la sala de emergencia. El ensayo hace uso de un plásmido reportero que permite una medición indirecta de la toxicidad de la RTA a través de emisión de fluorescencia de la proteína fluorescente verde (GFP) después de la traducción en vivo . Como RTA eficientemente previene la iniciación de la biosíntesis de la proteína por 28S rRNA depurinación, este ensayo permite la identificación de proteínas de la célula huésped involucrado en el transporte intracelular de RTA a través de la detección de cambios en la emisión de fluorescencia.

El flujo de trabajo general del protocolo descrito en este manuscrito se ilustra en la figura 1, más o menos resumiendo los pasos solo para la purificación exitosa de RTA y el posterior experimento de ensayo de reportero GFP. Puede encontrarse una descripción más detallada de cada paso individual en el protocolo. La figura 2 ilustra el resultado esperado de una purificación exitosa de RTA por cromatografía de afinidad (<strong cl...

En el manuscrito, describimos el uso de un análisis de reportero de fluorescencia basada en levadura a identificar componentes celulares implicados en la trata de personas y matar procesos de los citotóxicos a una subunidad de la ricina toxina de planta (RTA).

Un análisis Simple reportero basado en fluorescencia para identificar los componentes celulares necesarios para la toxina de ricina una cadena (RTA) trata de levadura

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...

El objetivo general de este ensayo indicador simple basado en fluorescencia es detectar los componentes celulares necesarios para el tráfico adecuado de la toxina de ricina A o la cadena RTA en el organismo modelo de levadura. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el transporte intercelular de ribosoma en la activación de una toxina B. En nuestro caso, la subunidad citotóxica de la toxina ricina simple de la membrana plasmática al citosoma.La principal ventaja de este ensayo es la oportunidad de analizar el efecto de un gen individual de levadura en el transporte de RTA de una manera rápida y económica. Comience este protocolo con la transformación de celdas como se detalla en el protocolo de texto. Inocular cinco mililitros de medio de kanamicina LB con células que contengan el plásmido de expresión de RTA o el vector vacío.Incubar las células a 37 grados centígrados y 220 RPM durante 24 horas. Complementar un litro de medio LB de kanamicina con cinco mililitros de precultivo. A continuación, incubar las células a 37 grados centígrados y 220 RPM hasta que las células hayan alcanzado una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,8 a 1,0.A continuación, reduzca la temperatura de cultivo a 28 grados centígrados. Inducir la expresión de RTA de E.Coli mediante la adición de IPTG a una concentración final de un milimolar. Después de 3,5 horas a 28 grados centígrados y 220 RPM, recoja las células por centrifugación a 10.000 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.A continuación, lavar el pellet con cinco mililitros de tampón aglutinante y el pellet a 10.000 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Después de repetir el lavado una vez, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tampón aglutinante. Sonica las células en hielo usando cinco ciclos de un pulso de 15 segundos y una pausa de 30 segundos.Después de centrifugar el licado celular a 21.000 g y cuatro grados centígrados durante 15 minutos, filtre el sobrenadante utilizando un sistema de filtro de jeringa estéril. Utilice un sistema de purificación automatizado, equipado con una columna de afinidad de cinco mililitros a base de níquel para purificar la fracción RTA marcada con HIS del sobrenadante de E. Coli filtrado estéril. En general, use una velocidad de alusión de un mililitro por minuto y enfríe todo el sistema de purificación para evitar la unión de toxinas ineficiente y la pérdida de actividad de toxinas.Equilibre brevemente la columna de afinidad con 20 mililitros de búfer de enlace para eliminar el búfer de almacenamiento. A continuación, aplique el sobrenadante estéril y filtrado sobre la columna de afinidad con una jeringa. Lave la columna con 25 a 35 mililitros de tampón de unión para eliminar las proteínas no unidas de la columna.Realice el paso de lavado hasta que los absorbentes de rayos UV a 280 nanómetros estén cerca del valor inicial de rayos UV. A continuación, eluir la fracción RTA unida con 20 a 35 mililitros de tampón de elución y mantener la muestra en hielo. Es importante comenzar el muestreo de la fracción RTA poco después de que aumente el valor UV, 280 y detener el muestreo de la fracción RTA cuando vuelva a alcanzar la línea base original.Para desalar la fracción RTA eludida, reemplace la columna de afinidad del sistema de purificación por la columna de desalinización y equilibre la columna con 20 mililitros de sorbitol 0,8 molar. Aplique la fracción RTA eludida a la columna a través de una jeringa. Lave la columna con 100 mililitros de sorbitol 0,8 molar y diluya la fracción RTA desalada en un tubo de 15 mililitros tan pronto como la absorción de UV comience a aumentar.Para evitar la contaminación por sal, deténgase en el muestreo de fracciones directamente cuando aumente la conductancia. Almacene la fracción RTA eludida a cuatro grados centígrados. Después de transformar la levadura como se describe en el protocolo de texto, elija tres clones de levadura diferentes de cada plato.Inocular los clones en 100 mililitros de medio rafinosa de caída de lucina a 220 RPM y 30 grados Celsius a una densidad óptica a 600 nanómetros de 1.0 a 2.0. Centrifugar las células a 25 grados centígrados durante cinco minutos a 10.000 g. Después de lavar las células dos veces con cinco mililitros de agua estéril, vuelva a suspender las células en 50 mililitros de tampón esferoplasping.Incubar el cultivo de 50 mililitros a 100 RPM y 30 grados centígrados durante 90 minutos. Después de la centrifugación a 400 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos, lavar las células dos veces con cinco mililitros de medio rafinosa de caída de lucina estabilizada. A continuación, vuelva a suspender las células en cinco mililitros del mismo medio para utilizar las células directamente para las mediciones del ensayo GFP reportero.Siembre los esferoplastos de células de levadura en placas de 96 pocillos. A cada pocillo, agregue 70 microlitros de medio rafinosa de caída de lucina estabilizado, que contenga el control negativo, expresando el vector vacío o RTA purificado en una concentración final de RTA de cinco micromolares. Agregue 70 microlitros de medio de caída de lucina estabilizado a cada uno de los pocillos restantes para llevar su volumen total a 270 microlitros.Para un control positivo de la inhibición de proteínas, agregue 70 microlitros de solución G418 estabilizada con sorbitol 0.8 molar, ya que G418 evita la expresión de GFP en levadura. Agregue inmediatamente 30 microlitros de solución de galactosa estabilizada para inducir la expresión de GFP. Prepare un control negativo adicional agregando 30 microlitros de medio rafinosa de caída de lucina estabilizada en lugar de 30% de galactosa.Después de terminar la preparación de la muestra, coloque la placa de 96 pocillos en un lector de fluorescencia y prepárese para la medición utilizando el juego de filtros de 475, 509 nanómetros requerido para la detección de fluorescencia GFP. Realice mediciones a 30 grados Celsius, 120 RPM y un diámetro de agitación de un milímetro durante un período de tiempo de 20 horas con intervalos de medición de 10 minutos. Aquí se muestra un gráfico de purificación representativo de la cromatografía de afinidad de RTA y el control de vector vacío.El pico azul en el cuadro negro representa la fracción RTA enlazada. Como se muestra en la caja negra, no se elude ninguna proteína de la columna en el control negativo. Aquí se muestra un diagrama de desalinización de una fracción RTA purificada por afinidad.El diagrama muestra la separación de la fracción de proteína RTA y la fracción de sal. Los resultados de la tinción de Coomassie después de una purificación y desalinización exitosas muestran lisado celular o muestras purificadas de diferentes variantes de RTA. En este estudio se utilizó el ATR no modificado.Para validar el ensayo indicador espaciado de fluorescencia, se midió la fluorescencia relativa de GFP de los esferoplastos de levadura de tipo salvaje en condiciones inducidas y no inducidas después de 20 horas de inducción de GFP. También se analizó la fluorescencia relativa de GFP en presencia de RTA, G418 o el control negativo. También se midió la fluorescencia relativa de GFP para mutantes seleccionados en los que se sabe que las proteínas correspondientes están involucradas y no involucradas en el tráfico de RTA en levadura.La línea punteada representaba un umbral de significación. Una vez que se domina la expresión y purificación de RTA, los resultados del ensayo de informe de fluorescencia se pueden recibir en un día. Además, este método allana el camino para que los investigadores en el campo de la inactivación de ribosomas de toxinas B estudien sus raíces de intoxicación en una levadura de organismo modelo eucariota.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un enfoque sólido para controlar la entrega de los orgánulos de la luz del ácido de la vacuola de levadura para la degradación y el reciclaje se describe. El método se basa en el etiquetado específico de los orgánulos de destino con una codificada genéticamente doble emisión de fluorescencia de pH biosensor, y la visualización de las células individuales mediante microscopía de fluorescencia.

Un ensayo de microscopía de fluorescencia para Mitophagy Vigilancia de la levadura Saccharomyces cerevisiae

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Fuente: Becker, B., et al. Un ensayo reportero simple basado en fluorescencia para identificar los componentes celulares necesarios para el tráfico de la cadena de la toxina A de la ricina (RTA) en levaduras. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demuestra la expresión inducible de la cadena de la toxina ricina A (RTA) marcada con Him en Escherichia coli. Describe los pasos implicados en el cultivo selectivo de bacterias transformadas con un plásmido de expresión recombinante, la inducción de la...

Expresión inducible de la cadena A de la toxina ricina marcada con histidina en E. coli

Dos métodos complementarios basados ​​en citometría de flujo y microscopía se presentan que permiten la cuantificación, a nivel de una sola célula, de la dinámica de la expresión génica inducidos por la activación de una vía MAPK en la levadura.

La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

Este protocolo describe un procedimiento experimental para la construcción rápida de factores de transcripción artificiales (ATFS) con GFP reporteros afines y cuantificación de la capacidad de los ATF para estimular la expresión de GFP mediante citometría de flujo.

Síntesis rápida y Detección de factores de transcripción activados químicamente con los periodistas basados ​​en las buenas prácticas agrarias

Este artículo describe un ensayo basado en el crecimiento de levaduras para la determinación de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas. También demuestra un método para la extracción rápida de proteínas de levadura, adecuado para la transferencia de Western para confirmar bioquímicamente los requisitos de degradación. Estas técnicas se pueden adaptar para monitorear la degradación de una variedad de proteínas.

Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

La translocación del efector a las células huésped a través de un sistema de secreción de tipo III es una estrategia de virulencia común entre las bacterias gramnegativas. Se aplicó un ensayo basado en fusión de efectores betalactamasas para el análisis cuantitativo de la translocación. En las células infectadas por Yersinia, la conversión de un indicador FRET por la betalactamasa se controla mediante microscopía de barrido láser.

Análisis de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Efector translocación en las células huésped Usando beta-lactamasa Efector fusiones

La cuantificación precisa de los eventos de tráfico vesicular a menudo proporciona información clave sobre las funciones de proteínas específicas y los efectos de las mutaciones. En este artículo se presentan métodos para utilizar la pHluorina supereclíptica, una variante de GFP sensible al pH, como herramienta para la cuantificación de eventos endocíticos en células vivas mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa y citometría de flujo.

Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

Este protocolo describe un nuevo método que permite la visualización cuantitativa de la formación de complejos de proteínas SNARE, basado en la transferencia de energía de resonancia Förster y toda la vida de la fluorescencia microscopía de imágenes.

Visualizar el lazo intracelular del tráfico de por vida de fluorescencia microscopía de imágenes

Este artículo describe un protocolo de citometría de flujo basado en FRET para cuantificar el autoensamblaje de proteínas en células De. cerevisiae y HEK293T.

Detección y caracterización de autoensamblaje de proteínas en Vivo por citometría de flujo

El seguimiento de eventos de traducción individuales permite estudios cinéticos de alta resolución de mecanismos de traducción dependientes de la tapa. Aquí demostramos un ensayo in vitro de una sola molécula basado en interacciones por imágenes entre anticuerpos etiquetados fluorescentemente y péptidos nacientes etiquetados con epitopos. Este método permite la caracterización de moléculas únicas de cinética de iniciación y elongación peptídica durante la traducción activa dependiente de la...

Un ensayo de imágenes de molécula única in vitro para el análisis de cinética de traducción dependiente de la tapa

Aprende a identificar componentes celulares necesarios para el transporte de la toxina de ricina RTA en levadura mediante un ensayo simple basado en fluorescencia. Este método permite analizar genes individuales de forma rápida y económica.

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Un análisis Simple reportero basado en fluorescencia para identificar los componentes celulares necesarios para la toxina de ricina una cadena (RTA) trata de levadura

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