Análisis de la comunicación entre monocitos y las células de cáncer de mama primario en una matriz extracelular extracto (ECME)-sistema tridimensional basado en

El objetivo general de este protocolo es estudiar la comunicación directa e indirecta entre las células primarias de cáncer de mama y los monocitos en un sistema de cocultivo tridimensional. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el microambiente inflamatorio del campo del cáncer de mama, como cómo se reclasifican y activan las células inmunitarias, cómo estas células ayudan a mantener el microambiente inflamatorio del tumor y cómo este microambiente facilita la invasión de las células tumorales. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una alternativa asequible para estudiar la comunicación intratumoral e ilustra el potencial de los sistemas celulares in vitro en 3D para interrogar características específicas de la biología tumoral.

Particularmente los relacionados con la agresión tumoral. Para comenzar, cultive dos veces 10 al sexto monocitos U937 y THP1 en 10 mililitros de medio RPMI1640, suplementado con 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de antibiótico antimicótico. También cultive PM frescas en medio DMEMF12 suplementado.

Incubar las células a 37 grados centígrados en un ambiente humidificado con un cinco por ciento de dióxido de carbono. Placa cuatro veces 10 al quinto monocitos en un mililitro por pocillo de su medio correspondiente. Coloque un inserto en cada pocillo y agregue 900 microlitros de la suspensión de cuatro por 10 a la quinta celda BrC en el medio correspondiente.

Incubar los cultivos a 37 grados centígrados en un ambiente humidificado con cinco por ciento de dióxido de carbono durante cinco días y recuperar los sobrenadantes. Recupere las células por tripsinización si se realiza un análisis posterior. Incluya controles de cultivos celulares individuales con los medios respectivos.

Para marcar las células BrC y los monocitos con cumerina y rodamina disponibles comercialmente antes del cultivo celular, prepare una monocapa de dos veces 10 a la sexta célula BrC de interés y reemplace el medio estándar con una solución de trabajo suficiente y precalentada del colorante fluorescente. Incubar las células a 37 grados centígrados en un ambiente humidificado con un cinco por ciento de dióxido de carbono durante 30 minutos. A continuación, aspire la solución de tinte y utilice suficiente XPBS para enjuagar suavemente las células.

Aspire el PBS y agregue el medio estándar. Para tripsinizar las células, agregue dos mililitros de 05 por ciento de tripsina y 0,48 milimolar EDTA al matraz e incube las células a 37 grados Celsius durante cinco a 10 minutos. Añadir 200 microlitros de FBS para detener la tripsinización y siete mililitros del medio correspondiente sin suplementos.

Vuelva a suspender las células mediante pipeteo, luego transfiera 10 microlitros de las células a una cámara Nuebauer y cuéntelas. A continuación, granule las células a 430 veces g y temperatura ambiente durante cinco minutos, luego deseche el sobrenadante y use tres mililitros de solución de trabajo de tinte fluorescente precalentado para volver a suspender las células. Incubar la suspensión celular a 37 grados centígrados en un ambiente humidificado con un cinco por ciento de dióxido de carbono durante 30 minutos.

Después de peletizar las células nuevamente, deseche la solución de trabajo del tinte y use de cinco a siete mililitros de un XPBS para volver a suspender suavemente las celdas. Luego, después de peletizar las celdas una vez más y desechar el PBS, vuelva a suspender las celdas en cinco a siete mililitros de medio estándar. Cuenta 10 microlitros de la suspensión celular.

Establezca un cocultivo esparciendo suficiente ECME en el fondo del pozo para formar una capa uniforme en cada pocillo de un sistema de deslizamiento de cuatro pocillos. Placa de 20 microlitros de una suspensión de una sola celda que contiene cinco células BrC marcadas de 10 a la quinta por pocillo. Después de 15 a 20 minutos a 37 grados centígrados, agregue una suspensión de 2,5 veces 10 al quinto monocitos marcados en 80 microlitros de medio de ensayo suplementado con ECME al 60 por ciento.

Deje que el ECME se solidifique a 37 grados centígrados durante 15 a 20 minutos. Ahora agregue un mililitro de una mezcla uno a uno de las células BrC y el medio de cultivo de monocitos. Incubar los cocultivos a 37 grados centígrados en un ambiente humidificado con un cinco por ciento de dióxido de carbono durante 24 horas, 48 horas o cinco días para rastrear los cambios en diferentes puntos temporales.

Para degradar las proteínas ECM y recuperar las células de los cultivos, aspire y deseche el medio, luego agregue 0,5 mililitros de un XPBS con 0,1 por ciento de tripsina y 0,25 por ciento de EDTA al cultivo. Incubar las células a 37 grados centígrados durante tres horas. Después de la incubación, agregue 0,5 mililitros de un XPBS con 10 por ciento de FBS para neutralizar la tripsina y vuelva a suspender las células pipeteando vigorosamente para lograr una suspensión de una sola célula.

Después de peletizar las células, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en cinco mililitros de un XPBS con 10 por ciento de FBS. Repita este paso una vez. Someta la suspensión de la célula a fax con el instrumento apropiado.

Asegurar que las poblaciones finales tengan al menos un 95 por ciento de pureza. En cada pocillo de un sistema de portaobjetos de ocho pocillos, extienda una base de 40 microlitros de ECME y deje que se solidifique a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Siembre 800 células MCF10 A por pocillo en 400 microlitros de medio de cultivo DMEM F12 suplementado según el protocolo de texto.

A continuación, añada 400 microlitros de medio condicionado o medio de cultivo DMEM F12 suplementado con 20 nanogramos por mililitro de IL1 beta recombinante humana. Coloque el portaobjetos de la cámara en una placa de Petri de vidrio que contenga una placa de Petri de 35 mililitros llena de dos mililitros de PBS. Las células MCF 10A deben sembrarse en cada pocillo muy lentamente para evitar daños en la base de la ECME y evitar que las células se asienten y formen una monolia.

Utilizando un microscopio óptico, registre la formación de acinos glandulares cada 24 horas durante 14 días. Después de 14 días de cultivo, añadir 100 microlitros de dapy de 100 nanomolares en un XPBS e incubar las muestras a temperatura ambiente con agitación constante durante 25 minutos. Enjuague las muestras con un XPBS a temperatura ambiente, tres veces durante cinco minutos cada una con agitación constante.

Utilice un medio de montaje específico para la tinción fluorescente para montar las preparaciones. A continuación, selle las muestras montadas con pulimento transparente y mantenga los portaobjetos protegidos de la luz a cuatro grados centígrados. La demostración del procedimiento en el microscopio confocal estará a cargo de Vadim Pérez, investigador del Laboratorio Nacional de Microscopía Avanzada.

Analice los acinos con un microscopio confocal tomando imágenes de pilas transversales a diferentes profundidades de los acinos. Visualice diferentes proteínas celulares en los acinos con protocolos de tinción adecuados. Por ejemplo, aquí se tiñó caheren para evaluar la adhesión célula a célula, la polaridad celular y la formación de oralimen.

Durante cinco días se estudió la morfología de las células primarias de BrC que crecían en cultivos 3D a bajas y altas densidades. Durante las primeras 48 horas, las células se adhieren al ECME con una forma de huso alargado y forman estructuras similares a las de un tejido a los cinco días. Después de cinco días en cocultivos 3D, las células BrC comerciales MCF7 y MDA-MB-231 formaron agregados desorganizados.

Sin embargo, las células MDA-MB-231 agresivas para agregados con formas alargadas, mientras que las células MCF7 no agresivas para agregados con formas redondeadas que están más densamente compactadas que las células MDA-MB-231. Se cosecharon los sobrenadantes de los cultivos primarios de BrC en 3D de interacción indirecta y sus cocultivos de cinco días con monocitos primarios. Se observaron niveles significativamente aumentados de IL1 beta e IL8 en los cocultivos primarios de monocitos de células BrC.

Citocinas cruciales e inflamatorias que se han asociado previamente con la progresión maligna. Las células MCF10A se cultivaron con dos sobrenadantes diferentes de dos líneas celulares primarias de BrC para observar la formación de lúmenes como medida de la resistencia a las anoykis. A diferencia de las células MCF10A cultivadas en condiciones estándar, la microscopía biconfocal en el día 14, los cortes transversales de los esferoides muestran que las células MCF10A evadieron el anoykis medido mediante el recuento del número de células centrales en los acinos.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis médico, para responder preguntas adicionales. Pruebe las vías de señalización en la migración del cáncer. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de los microambientes tumorales exploraran las comunicaciones de las células de cáncer de mama con células de masa, fibroblastos, neutrófilos o incluso diferentes clones de células tumorales en sistemas de cocultivo en 3D.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer un sistema de cultivo en 3D para modelar el microambiente tumoral.