Adherencia de bacterias a las superficies de midieron en el laboratorio de la planta

El objetivo general de este procedimiento es observar y medir la unión de las bacterias a las superficies de las plantas. Este método puede responder a preguntas importantes tanto en fitopatología como en seguridad alimentaria. En particular, puede responder preguntas sobre cómo las bacterias se unen a las superficies de las plantas y cómo se pueden eliminar.

La principal ventaja de esta técnica es que es fácil, rápida y económica. Para preparar plántulas cultivadas en agua, coloque una pequeña cantidad de semillas en un vaso de precipitados de vidrio de 30, 50, 100 o 150 mililitros. Aquí se utilizan semillas de tomate.

Cubra las semillas con etanol al 80% y revuelva brevemente. Luego deje las semillas en remojo durante un minuto. Vierta el etanol y sumerja las semillas en una solución de 50% de lejía comercial y 0.1% de Triton X-100 y agua del grifo.

Deje que las semillas se remojen durante 20 minutos o más si las semillas son grandes, como las semillas de frijol. Vierte la mezcla de lejía y lava las semillas tres veces con agua estéril, dejando que las semillas se remojen en el agua durante un minuto por cada lavado. Vierta las semillas y una pequeña cantidad de agua en una placa de Petri estéril e incube las semillas en la oscuridad hasta que las plántulas alcancen el tamaño deseado, entre un centímetro y 10 centímetros.

Para preparar semillas o plántulas cultivadas en arena, después de esterilizar las semillas y los materiales de siembra, inocule las semillas o plántulas con bacterias de acuerdo con el protocolo de texto. Con una varilla de vidrio estéril, haz un agujero poco profundo en la arena lo suficientemente profundo como para colocar la semilla debajo de la superficie. Coloca la semilla en el agujero y cúbrela con una fina capa de arena.

Luego, use una película de sellado para sellar la parte superior del recipiente para evitar la pérdida de agua y la entrada de microbios adicionales. Cultive las plantas en el laboratorio bajo una luz o en el invernadero a una temperatura y duración del día adecuadas para la especie y variedad de planta. Planta las plántulas en la arena.

Use una varilla de vidrio estéril para hacer un agujero. Luego, con una aguja de ganchillo de acero inoxidable estéril, guía la raíz con cuidado hacia el interior del agujero y utiliza arena para rellenar los lados del agujero. Después de incubar plantas con bacterias de acuerdo con el protocolo de texto, prepare una muestra para microscopía colocándola en una gota de agua o medio de incubación en un portaobjetos de microscopio y obsérvela directamente.

Si no hay bacterias libres visibles, es posible que haya habido muerte bacteriana o unión bacteriana al recipiente en el que se llevó a cabo la incubación. Lave la muestra en agua o medio de incubación colocándola en un vial de líquido e invirtiendo suavemente el vial. A continuación, coloque la muestra en el portaobjetos del microscopio en líquido fresco para su observación.

Para montar la muestra, utilice un cubreobjetos ordinario. Si la muestra es espesa y hace un bulto, agregue el líquido y la muestra en el pocillo de una prensa, aplique un cubreobjetos que tenga un anillo de goma o plástico alrededor del borde. Coloque el portaobjetos en la parte superior y presione suavemente hacia abajo para sellar el cubreobjetos al portaobjetos.

Invierta el portaobjetos para examinar la muestra. Alternativamente, use un portaobjetos de conteo de algas y un cubreobjetos de manera similar y vea con un aumento no mayor de 20 veces. Para determinar la cantidad de bacterias viables que se encuentran en las plantas que crecen en la arena, comience por quitar el material de sellado de la parte superior e inferior del recipiente.

Coloque el recipiente sobre un trozo de papel estéril y golpee suavemente el recipiente contra la superficie para aflojar la arena antes de levantar suavemente la arena con la planta del recipiente. Cuando el cilindro de arena y la planta estén libres en el papel, divide la arena por la mitad para revelar la raíz de la planta. Si lo desea, tome muestras de la arena cerca del borde del recipiente, así como cerca de la raíz.

Esto puede ser útil para determinar la propagación, acumulación y crecimiento de bacterias. Levante la raíz y elimine la arena y las bacterias que están poco adheridas sumergiendo la raíz en un volumen medido de agua o tampón y agitándola suavemente. Determine el recuento de células viables de las bacterias en la suspensión resultante colocándola en medios adecuados como el agar luria.

Esto representa el número de bacterias vagamente asociadas con la raíz. Por último, elimine las bacterias estrechamente unidas por sonicación y determine su número. Este gráfico muestra el efecto de dos mutaciones negativas de celulosa diferentes en la capacidad de las bacterias para colonizar las raíces del tomate.

Aunque las desviaciones estándar de algunas mediciones fueron tan altas como 0,9 log base de 10, la reducción en la unión de la celulosa menos mutantes es claramente evidente. En este experimento se midió la unión a brotes de alfalfa del tipo silvestre E.Coli 0157:H7 en mutantes incapaces de producir varios exopolisacáridos. En ambas cepas, la producción de ácido poli-beta uno seis glucurónico, o PGA, pareció hacer la mayor contribución a la unión de E. coli patógena a las superficies de las plantas.

El ácido colánico también jugó un papel importante en la unión. Aquí, dos cepas de bacterias que no pueden unirse a las superficies de las plantas fueron diseñadas para producir PGA para determinar si es suficiente para causar la unión bacteriana a las raíces del tomate. En el caso de A. tumefaciens A1045, la PGA hizo que las bacterias se unieran individualmente a la superficie de la raíz.

Por otro lado, S. meliloti se unió en grandes grupos, en los que solo algunas de las bacterias se unieron directamente a la raíz, y la mayoría de las bacterias se unieron a otras bacterias. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de una hora para la configuración inicial, más el tiempo de incubación, y entre 10 minutos y una hora de tiempo de puntuación, dependiendo de la muestra. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las bacterias pueden adherirse a casi cualquier superficie.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo observar la unión de las bacterias a las superficies de las plantas. Determine en qué parte de la planta se unen las bacterias y determine el número de bacterias unidas. No olvide que si realiza estos procedimientos con patógenos humanos, el procedimiento puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como trabajar en una capucha de contención y usar guantes.