Name: Adherencia de bacterias a las superficies de midieron en el laboratorio de la planta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Aprende a medir la adherencia bacteriana en superficies vegetales usando plántulas esterilizadas y microscopía. Este método rápido y económico permite estudiar interacciones microbianas en fitopatología y seguridad alimentaria.

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El autor agradece a Susan Whitfield para la preparación de las figuras y Camille Martin y Hillary Samagaio para asistencia con algunos de los experimentos.

<ol><li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).</li>
<li>Beuchat, L. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11932192">Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables.</a> Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).</li>
<li>Berger, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+fruit+and+vegetables+as+vehicles+for+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens.</a> Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).</li>
<li>Lugtenberg, B. J., Chin, A. W. T., Bloemberg, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe-plant+interactions%3A+principles+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+Van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Microbe-plant interactions: principles and mechanisms.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 373-383 (2002).</li>
<li>Preston, G. M., Haubold, B., Rainey, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+genomics+and+adaptation+to+life+on+plants%3A+implications+for+the+evolution+of+pathogenicity+and+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 1, 589-597 (1998).</li>
<li>Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C., Barka, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Plant+Growth-Promoting+Bacteria+for+Biocontrol+of+Plant+Diseases%3A+Principles%2C+Mechanisms+of+Action%2C+and+Future+Prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Plant Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospects.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 4951-4959 (2005).</li>
<li>Mathews, S. L., Smith, R. B., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+retention+of+pathogenic+Escherichia+coli.+O157+by+sprouts%2C+leaves+and+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A comparison of the retention of pathogenic Escherichia coli. O157 by sprouts, leaves and fruits.</a> Microb. Biotechnol. 7, 570-579 (2014).</li>
<li>Fuqua, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+bacterial+biofilms+associated+with+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying bacterial biofilms associated with plants.</a> Methods Enzymol. 337, 3-18 (2001).</li>
<li>Torres, A. G., Jeter, C., Langley, W., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+Escherchia+coli.O157%3AH7+to+alfalfa%2C+human+epithelial+cells%2C+and+plastic+is+mediated+by+a+variety+of+surface+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential binding of Escherchia coli.O157:H7 to alfalfa, human epithelial cells, and plastic is mediated by a variety of surface structures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 8008-8015 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., Deora, R., Mishra, M., Torres, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharides+cellulose%2C+poly-beta-1%2C6-n-acetyl-D-glucosamine%2C+and+colanic+acid+are+required+for+optimal+binding+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+strains+to+alfalfa+sprouts+and+K-12+strains+to+plastic+but+not+for+binding+to+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polysaccharides cellulose, poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine, and colanic acid are required for optimal binding of Escherichia coli O157:H7 strains to alfalfa sprouts and K-12 strains to plastic but not for binding to epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2384-2390 (2008).</li>
<li>Matthysse, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cellulose+overproduction+on+binding+and+biofilm+formation+on+roots+by+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., Kijne, J. W. Attachment of Rhizobiaceae to plant cells. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9780792351801">The Rhizobiaceae</a>. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Kluwer Academic Press. 235-249 (1998).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01276821">Conditioned medium promotes the attachment of Agrobacterium tumefaciens.strain NT1 to carrot cells.</a> Protoplasma. 183, 131-136 (1994).</li>
<li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+the+Agrobacterium+tumefaciens.+attR+mutation+on+attachment+and+root+colonization+differs+between+legumes+and+other+dicots%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).</li>
<li>Jeter, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+binding+of+diarrheagenic+strains+of+E.+coli.to+plant+surfaces+and+the+role+of+curli+in+the+interaction+of+the+bacteria+with+alfalfa+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+colonization+by+Agrobacterium+tumefaciens+is+reduced+in+cel%2C+attB%2C+attD%2C+and+attR+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).</li>
<li>Morton, E. R., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analyses+of+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analyses of Agrobacterium.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 3 (2012).</li>
<li>Brandl, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+lesions+promote+the+rapid+multiplication+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+postharvest+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant lesions promote the rapid multiplication of Escherichia coli O157:H7 on postharvest lettuce.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5285-5289 (2008).</li>
<li>Franz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+contamination+of+lettuce+by+GFP-expressing+Escherichia+coli+O157%3AH7+and+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of contamination of lettuce by GFP-expressing Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> Food Microbiol. 24, 106-112 (2007).</li>
<li>Morton, E. R., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Agrobacterium.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 1 (2012).</li>
<li>Lugtenberg, B. J., Kravchenko, L. V., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+seed+and+root+exudate+sugars%3A+composition%2C+utilization+by+Pseudomonas+biocontrol+strains+and+role+in+rhizosphere+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tomato seed and root exudate sugars: composition, utilization by Pseudomonas biocontrol strains and role in rhizosphere colonization.</a> Environ. Microbiol. 1, 439-446 (1999).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x/abstract">A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15, 473-497 (1962).</li>
<li>Danhorn, T., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+plant-associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by plant-associated bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 61, 401-422 (2007).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15639628">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+as+microbial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li>
<li>Charkowski, A. O., Barak, J. D., Sarreal, C. Z., Mandrell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+growth+of+Salmonella+enterica+and+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+alfalfa+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differences in growth of Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7 on alfalfa sprouts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 3114-3120 (2002).</li>
<li>Loper, J., Suslow, T., Schroth, M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/240593829_Lognormal_Distribution_of_Bacterial_Populations_in_the_Rhizosphere">Lognormal distribution of bacterial populations in the rhizosphere.</a> Phytopathology. 74, 1454-1460 (1984).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+Agrobacterium+to+plant+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Attachment of Agrobacterium to plant surfaces.</a> Front Plant Sci. 5, 252(2014).</li>
<li>Douglas, C. J., Halperin, W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens+mutants+affected+in+attachment+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells.</a> J. Bacteriol. 152, 1265-1275 (1982).</li>
<li>Tomlinson, A. D., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+regulation+of+polar+surface+attachment+in+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and regulation of polar surface attachment in Agrobacterium tumefaciens.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 708-714 (2009).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+Agrobacterium+to+plant+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Attachment of Agrobacterium to plant surfaces.</a> Front Plant Sci. 5, (2014).</li>
<li>Wright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endophytic+lifestyle+of+Escherichia+coli+O157%3AH7%3A+quantification+and+internal+localization+in+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">The endophytic lifestyle of Escherichia coli O157:H7: quantification and internal localization in roots.</a> Phytopathology. 103, 333-340 (2013).</li>
<li>Berger, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+fruit+and+vegetables+as+vehicles+for+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens.</a> Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).</li>
<li>Erickson, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+and+Fate+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+Leafy+Green+Phyllosphere+Tissue+Using+Various+Spray+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Internalization and Fate of Escherichia coli O157:H7 in Leafy Green Phyllosphere Tissue Using Various Spray Conditions.</a> J. Food Prot. 77, 713-721 (2014).</li>
<li>McKellar, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+approaches+for+modeling+Escherichia+coli+O157%3AH7+survival+on+field+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different approaches for modeling Escherichia coli O157:H7 survival on field lettuce.</a> Int. J. Food Microbiol. 184, 75-85 (2014).</li>
<li>Wu, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+detection+and+enumeration+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+alfalfa+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the detection and enumeration of Escherichia coli O157:H7 on alfalfa seeds.</a> Int. J. Food Microbiol. 71, 93-99 (2001).</li>
</ol>

El autor declara que ella no tiene competencia financieras intereses.

Es importante ser consciente de todas las superficies que las bacterias pueden adherirse durante el experimento. Así se pueden subestimar las bacterias que son capaces de unirse a cristal si se realiza un recuento viable usando tubos de vidrio y pipetas. Si las plantas se cultivan en agar o suelo y algunos del agar o suelo permanece en las plantas las bacterias pueden enlazar el material adherido en lugar de a las plantas. Por otro lado, lavar la superficie de la planta, particularmente en el caso de las raíces, puede quitar capas superficiales naturales tales como mucosa y alterar así los resultados de pruebas de adherencia.
Es importante estar seguro de que las bacterias se añade a la mezcla de incubación siguen vivas durante el experimento. Así rutinariamente se hagan recuentos de células viables de bacterias libres como adjuntadas. Algunas mutaciones bacterianas o tratamientos pueden reducir la tasa de crecimiento bacteriano o causan la muerte de una fracción de la población bacteriana. Bacterias vivas y muertas no sean distinguibles en el microscopio a menos que se utilizan tinciones especiales. Existe un kit de tinción útil para bacterias muertas o vivir que depende de la exclusión de los tintes de las bacterias vivas. Sin embargo, si una población mixta de especies bacterianas entonces recuento viable de la especie de interés es probablemente el método más fácil para determinar si la incubación ha resultado en la muerte bacteriana.
Composición medio influirá en crecimiento y supervivencia bacteriana. Exudado de raíz y materiales liberados de la herida y cortar los sitios proporcionará sustrato para crecimiento bacteriano modesto. Fosfato, nitrógeno y hierro tienden a ser limitante en estas condiciones. Cationes divalentes como calcio y magnesio pueden influir en la adherencia. En algunos casos fuente de carbono puede influir en la adherencia. pH es también importante. En general el pH de la rizosfera es entre 5.5 y 6.5.
Es necesario tener cuidado en el uso de bacterias con resistencia a los antibióticos. Los antibióticos más frecuentemente utilizados son la rifampicina y ácido nalidíxico. La resistencia a estos antibióticos es generalmente debido a mutaciones en genes cromosómicos (ARN polimerasa y la girasa, respectivamente) y por lo tanto no puede ser fácilmente transferido a otra cepa durante la incubación. Este tipo de resistencia no resulta en la degradación o modificación del antibiótico. Las bacterias de la marca con un marcador de genes portados por el plásmido no se recomienda a menos que el plásmido no puede transferirse a otras bacterias. La resistencia a los antibióticos no debe ser debido a la degradación o química modificación del antibiótico como antibióticos bacterias sensibles entonces serán capaces de crecer en placas de antibióticos si se ubican cerca de las bacterias resistentes.
Los métodos descritos en este documento son útiles para pequeños tamaños de muestra o experimentos donde las muestras deban ser contenida (por ejemplo, experimentos con patógenos humanos). Para tamaños de muestra grande (sobre 100 g de material o de más de 50 plantas) otros métodos o modificación drástica de estos métodos serían necesarios10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. la presencia de grandes cantidades de microorganismos distintos de las especies estudiadas también puede plantear problemas importantes. Posibles soluciones incluyen el uso de bacterias marcadas con una proteína fluorescente o resistencia a los antibióticos como se describe en los pasos 6.1.2 y 7.3. Sin embargo, cuando las bacterias de interés son raros individuos en una población grande de otros microorganismos estos marcadores no pueden ser suficientes para permitir una evaluación clara de los números de las bacterias estudiadas.
Todos los métodos descritos aquí son métodos de laboratorio en. Modificaciones menores se necesitarían estudios de invernadero. Más modificaciones mayores están probable que sean necesarios para estudios de campo donde protozoos, insectos y otros animal variación de depredación y el clima complican la provisión de condiciones definidas para los experimentos. En el futuro estos métodos pueden ampliarse para incluir las interacciones de dos o más microorganismos en la superficie de la planta.

La medición de Unión bacteriana a las superficies de la planta se ha convertido en importante en tres situaciones diferentes. La primera situación es el examen de la transmisión de los patógenos humanos en planta superficies1,2,3. El objetivo aquí es para prevenir el atascamiento bacteriano o eliminar o matar bacterias encuadernadas y así reducir la transmisión de la enfermedad en material vegetal. La segunda situación es el examen de la Unión de patógenos de plantas a sembrar superficies4. Una vez más el objetivo aquí es para evitar vinculante o eliminar o matar bacterias encuadernadas y así reducir la enfermedad. La tercera situación es el examen de la fijación de las bacterias simbióticas o promoción de crecimiento vegetal5,6. El objetivo aquí es promover bacterias vinculante y así al aumento de la salud de las plantas y cultivos los rendimientos.
Las técnicas para medir la Unión bacteriana a superficies descritas en este artículo la planta son baratos y relativamente fáciles de realizar. Los únicos requisitos son un microscopio y materiales encontrados generalmente en un laboratorio de bacteriología. Para algunas técnicas un sonicador de baño es útil. Las técnicas descritas están diseñadas para atar los experimentos realizados con muestras relativamente pequeñas. De Unión se realizan en el laboratorio, aunque es posible modificar algunas de estas técnicas para el uso en el invernadero o en el campo.
Estas técnicas se han utilizado para medir la Unión bacteriana a las raíces, brotes, hojas de corte, corte frutas y tomates intactos en el laboratorio7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Se han utilizado también para medir la colonización de raíces de plantas que crecen en el suelo o arena en el laboratorio16. Las técnicas se han utilizado muchas especies bacterianas incluyendo tumefaciens de la agrobacteria, Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli, Salmonella enterica y Pseudomonas fluorescens. Una útil descripción de métodos para evaluar la interacción de a. tumefaciens con superficies puede encontrarse en Morton y Fuqua (2012)17. En todos los casos los tamaños de la muestra participantes eran pequeños, generalmente menos que las plantas de 25-50. Las técnicas descritas son adecuadas para uso con patógenos humanos que deben mantenerse independientes durante los experimentos.

<table><tbody><tr><td>microscopio óptico</td>, <td>cualquier</td> contraste <td>de fase N/A</td><td>u óptica Nomarski son útiles, para estudios que utilizan marcadores fluorescentes se requiere un microscopio de fluorescencia.</td></tr><tr><td>semillas</td><td>cualquier&nbsp;</td><td>N/A</td><td>anote el número de lote de la semilla y el cultivar</td></tr><tr><td>blanquear</td><td>cualquier</td><td>N/A sonicador</td><td></td></tr> de <tr><td>baño</td><td>cualquier empresa de suministros científicos</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>agar nutriente&nbsp;</td><td>Difco&nbsp;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>tono de soja</td><td>Difco&nbsp;</td><td>24360</td><td></td></tr><tr><td>Arena</td><td>de mar arena Fisher Scientific</td><td>S25</td><td></td></tr><tr><td>arena</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>conetainers</td><td>Stuewe & Hijos, Inc.</td><td>Los conos Ray-Leach</td> tienen <td>disponibles muchos tamaños diferentes para adaptarse al tipo de planta que desea cultivar</td></tr><tr><td>: parafilm</td>, <td>cualquier empresa de suministros científicos</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MS sales,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>parrafin</td>, <td>cualquier</td> centrífuga <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td></td>, <td>cualquier empresa científica</td><td>N/A</td><td>para pelletizar la mayoría de las bacterias, sólo una pequeña centrífuga con una fuerza máxima de 10.000 XG se necesita</td></tr><tr><td>mezclador de vórtice</td><td>cualquier empresa</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>micrómetro</td><td>ACCU-SCOPE Accesorios</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>Sedgwick-célula de recuento de vigas</td><td>Hauser Scientific</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>probe-clip de presa cámara de incubación</td><td>Sigma-Aldrich Z359483</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rifampicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>ácido naladixico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>Tinción viva/muerta</td><td>en biosondas moleculares de vitrógeno</td><td>L7007</td><td></td></tr></tbody></table>

adherencia de bacterias a las superficies de midieron en el laboratorio de la planta

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

Este manuscrito describe un método para medir la Unión bacteriana a las superficies de la planta axénicos en el microscopio óptico y mediante el uso de recuento de células viables. Materiales de planta usados incluyen raíces, brotes, hojas y cortan de frutas. Los métodos descritos son baratos, fácil y conveniente para pequeños tamaños de muestra. Enlace se mide en el laboratorio y puede utilizarse una variedad de medios de incubación y las condiciones. Puede determinarse el efecto de inhibidores. Situaciones que promueven e inhiben la Unión también pueden ser evaluadas. En algunos casos es posible distinguir si varias condiciones modificar enlace debido principalmente a sus efectos sobre la planta o en las bacterias.

A. tumefaciens coloniza las superficies radiculares. Con el fin de determinar si la producción bacteriana de la celulosa desempeña un papel en la colonización de la raíz, los efectos de las mutaciones bacterianas que impiden la síntesis de celulosa fueron examinados16. Se utilizaron las técnicas descritas en los pasos 1,3 y 7.1. Semillas de tomate eran superficie esterilizada y germinadas en agua estéril. Cuando las raíces fueron aproximadamente 2 cm de largo fueron sumergidas en una suspensión de 105 bacterias / mL y plantados en el suelo pasteurizado en contenedores. Las plantas fueron cultivadas durante 14 días a 25 ° C en un ciclo oscuro h 12 h luz/12. Después de la indicada veces las plantas fueron removidos de los contenedores. Las raíces fueron lavadas y sonicadas en un sonicador de baño para eliminar las bacterias encuadernadas. Números de bacterianos se determinaron utilizando el recuento de células viables. La figura 2 muestra el efecto de dos diversas mutaciones de celulosa-menos en la capacidad de las bacterias para colonizar las raíces de tomate. Aunque las desviaciones estándar de las mediciones eran tan altas como 0.9 log10 (un problema común con este tipo de medición) la reducción en el atascamiento de los mutantes menos celulosa es claramente evidente y podemos concluir que la producción bacteriana de celulosa ayuda a la bacteria en la colonización de raíces de tomate.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> Figura 2 : Raíz de la colonización de tipo salvaje y menos celulosa mutantes de a. tumefaciens. Log10 número total de bacterias por cm longitud de la raíz de raíces de tomate inoculadas con cepa de tipo salvaje a. tumefaciens C58 y mutantes menos celulosa C58:1 y C58:A60. Los números que aparecen son el medio de un mínimo de cuatro experimentos separados. Las barras indican las desviaciones estándar de los medios. Las raíces se inocularon por inmersión en una suspensión de 105 bacterias / mL para un minuto. Las plantas fueron cultivadas en contenedores y las bacterias libremente adherentes fueron quitadas por el lavado de las raíces en lavado tampón en un frasco de vidrio. Bacterias firmemente adheridas fueron quitadas usando un sonicador de baño y la suspensión resultante plateado para determinar recuento viable16. Esta figura ha sido modificada de Matthysse y McMahan. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Se examinó el papel de exopolisacáridos en la Unión de e. coli y otras bacterias a brotes de alfalfa. Algunos brotes de enfermedad diarreica por e. coli O157: H7 se trazaron a brotes de alfalfa contaminada. Unión de las bacterias de tipo silvestre y mutantes incapaces de hacer distintos exopolisacáridos se midió usando los métodos descritos en los pasos 1.1, 5.1 y 7.2. Brotes de alfalfa fueron superficie esterilizada y germinó un día en agua estéril a 25 ° C en la oscuridad. Cuatro brotes con las capas de semilla adjuntadas fueron colocados en platos de plástico estériles que contiene 5 mL de agua. Las bacterias cultivadas en caldo Luria fueron agregadas a una concentración final de aproximadamente 5 x 103 / mL. Los brotes inoculados se incubaron a 25 ° C en la oscuridad durante 3 días. Los brotes fueron lavados dos veces en 5 mL de agua estéril en un vial por inversión vigorosa y homogeneizó en lavado Tampón utilizando un homogeneizador de vidrio teflón motorizado. Experimentos anteriores utilizando bacterias marcan con un plásmido portador del gen GFP demostrado ningunas bacterias internalizadas aunque fácilmente se observaron bacterias superficiales. Los resultados se muestran en la tabla 1. Examinaron a dos cepas de e. coli O157: H7. En ambas cepas la producción de poli-β-1, 6-glucurónico acid(PGA) parece hacer la contribución más grande a la Unión del patógeno e. coli a las superficies de la planta. Ácido colónico también desempeñó un papel significativo en la Unión. Mientras que la reducción en el atascamiento en celulosa menos mutantes fue significativa no era tan grande como para los otros dos polisacáridos.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Efectos de las mutaciones en los Genes de producción de exopolisacárido en encuadernación de E. coli O157: H7 brotes y capas de semilla abiertas</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Cepa bacteriana</td>
			<td rowspan="2">Mutación o genotipo (fenotipo relevante)</td>
			<td colspan="2">Sesión número10 de bacterias límite por brote o Testa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alfalfa brotesb
</td>
			<td>Capas de semilla abiertas</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>Ninguno (tipo salvaje)</td>
			<td>4.7 ± 0.6</td>
			<td>5.6 ± 0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (celulosa-minus)</td>
			<td>2,9 ± 0,7c
</td>
			<td>3.5 ± 0.6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>C 8624</td>
			<td>
wcaD (colon menos ácido)</td>
			<td>de 1,8 ± 0,7c
</td>
			<td>2.4 ± 0,5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624P</td>
			<td>
Camp (PGA-minus)</td>
			<td>&lt; 1.0c
</td>
			<td>± 1.0 1.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>Ninguno (tipo salvaje)</td>
			<td>5.6 ± 0,2</td>
			<td>6.1 ± 0.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (celulosa-minus)</td>
			<td>4.8 ± 0.8d
</td>
			<td>4.1 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (colon menos ácido)</td>
			<td>3,9 ± 0,5c
</td>
			<td>4.8 ± 0.8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
Camp (PGA-minus)</td>
			<td>&lt; 1.0c
</td>
			<td>1,2 ± 0,7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">una media ± desviación estándar de un mínimo de tres mediciones de la cantidad (log10) de bacterias límite después de 3 días.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">b brotes fueron lavados antes de la medición.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">c significativamente diferente del tipo silvestre: P &lt; 0.01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">d significativamente diferente del tipo silvestre: P &lt; 0.05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Esta tabla ha sido modificada de Matthysse, Deora, Mishra y Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: efectos de mutaciones en genes de producción de exopolisacárido en Unión de E. coli O157: H7 a brotes. Para determinar el papel de exopolisacáridos y lipopolisacáridos en la Unión del patógeno e. coli O157: H7 cepas de brotes de alfalfa, la Unión de un conjunto de mutantes para los brotes y abiertas capas de semilla fue examinada usando los métodos se describe en el paso 6. Los resultados mostraron que poli-ß-1, 6 -N-acetil-D-glucosamina (PGA) parece ser esencial para la Unión a brotes y eso ácido de la celulosa y colanic son necesarios para la máxima unión de e. coli O157. Esta tabla ha sido modificada de Matthysse, Deora, Mishra y Torres10.
Con el fin de determinar si la producción de PGA es suficiente causar el atascamiento bacteriana a las superficies, un plásmido (pMM11) llevando el operón clonado los genes necesarios para la PGA de codificación producción fue introducida en dos diferentes bacterias que no Normalmente podrá enlazar a las raíces de tomate10. A. tumefaciens A1045 es un mutante de la cepa de tipo salvaje C58 que no puede hacer el glucano cíclico-β-1, 2 y tampoco se unen para plantar superficies29. Sinorhizobium meliloti 1021 que forma nódulos radiculares en alfalfa es incapaz de enlazar no leguminosas incluyendo tomate12. Las técnicas descritas en los pasos 1.1, 5.1, 6.3 y 7.1 se utilizan para determinar si la capacidad de hacer PGA generalmente aumentar Unión bacteriana a las superficies radiculares. Semillas de tomate eran superficie esterilizada y germinadas en agua estéril. Raíces se corta en segmentos de 1 cm de longitud y se colocaron en agua estéril y se inocularon las bacterias. Como estas dos especies de bacterias crecen a tasas diferentes, Unión se midió en diferentes momentos para permitir que cantidades aproximadamente iguales de crecimiento bacteriano. La presencia de la pMM11 del plásmido causó un aumento significativo similar en el número de bacterias dependientes de ambas especies (tabla 2)10. También se observó un aumento significativo en la Unión en el microscopio óptico, pero el enlace fue muy diferente para las dos especies (figura 3). A. tumefaciens A1045 obligado como bacterias individuales a la superficie de la raíz. S. meliloti atado en grandes grupos en los que sólo algunas de las bacterias fueron Unidos directamente a la raíz y la mayoría de las bacterias fueron unida a otras bacterias. Este ejemplo muestra que el simplemente analizando los números de destino sin incluir observaciones microscópicas de bacterias puede dar una impresión errónea de los resultados de un experimento. Aunque ambos métodos (recuento de células viables y observaciones microscópicas) muestran que pMM11 mayor atascamiento bacteriano a las raíces de tomate, el tipo de enlace por la producción de PGA fue diferente para las dos especies bacterianas10.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">El efecto de la pMM11 del plásmido en la Unión de bacterias a las raíces de tomate</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cepa bacteriana</td>
			<td>Plásmido</td>
			<td>Limitado número de bacterias por mm de longitud de raíz</td>
		</tr>
<tr>
<td>A. tumefaciens A1045un
</td>
			<td>ninguno</td>
			<td>0.25 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vector)</td>
			<td>0.25 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (síntesis de PGA)</td>
			<td>10 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>S. meliloti 1021b
</td>
			<td>ninguno</td>
			<td>ninguno detecta</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vector)</td>
			<td>ninguno detecta</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (síntesis de PGA)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">un atascamiento bacteriano se midió después de 2 horas</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b Unión bacteriana fue medida después de 18 horas</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Esta tabla ha sido modificada de Matthysse, Deora, Mishra y Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: el efecto de un plásmidos portadores de genes para la síntesis de PGA en Unión de A. tumefaciens A1045 y S. meliloti 1021 a segmentos de raíz de tomate. Para examinar la capacidad de poli-ß-1, 6 -N-acetil-D-glucosamina (PGA) para promover la Unión de las bacterias a las raíces, el efecto de un plásmido que confiere la habilidad de hacer PGA (pMM11) en la Unión de dos cepas de bacterias a la planta las raíces del tomate fue examinado. Ninguna cepa de bacterias demostró Unión significativa a las raíces de tomate en la ausencia del plásmido o ante la presencia del plásmido sin los genes que codifican la síntesis de la PGA (pBBR1mcs). La adición de los plásmidos portadores de genes de síntesis de PGA aumentó vinculante por ambos tipos de bacterias. Porque a. tumefaciens crece más rápido que el enlace de S. meliloti se midió después de 2 h de incubación para a. tumefaciens y 18 h de S. meliloti. Las técnicas utilizadas son las que se describen en el paso 7. Esta tabla ha sido modificada de Matthysse, Deora, Mishra y Torres10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> Figura 3 : El efecto de la pMM11 del plásmido lleva los genes de biosíntesis de la PGA en la Unión de a. tumefaciens A1045 S. meliloti 1021 a pelos de la raíz de tomate. Enlace a pelos de la raíz del tomate de la A) a. tumefaciens A1045, B) pMM11 de a. tumefaciens A1045, C) S. meliloti 1021 y D) pMM11 de S. meliloti 1021. Aunque el aumento en la Unión de las dos especies bacterianas es más o menos similar, los detalles del enlace como se ve en el microscopio óptico son muy diferentes. Las técnicas utilizadas son las que se describen en el paso 6. Esta figura ha sido modificada de Matthysse, Deora, Mishra y Torres10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
A veces es posible utilizar Unión a superficies no-biológicos para ayudar a distinguir la contribución de las bacterias y de la planta en una interacción específica. La polysaccharide(UPP) unipolar de a. tumefaciens ha demostrado ser capaz de mediar la Unión bacteriana a una variedad de ambas superficies biológicas y no biológicas30. Calcio se observó que inhiben el atascamiento de a. tumefaciens a sembrar superficies mediadas por la UPP28. Con el fin de determinar si la inhibición por los iones del calcio de Unión bacteriana a las superficies de la planta es debido a un efecto sobre las bacterias o sobre la superficie de la planta, se examinó la Unión de las bacterias a hilos de nylon. Las técnicas se describe en el paso 8.2 fueron utilizados. Semillas de tomate eran superficie esterilizada y germinó en el agua como se describe en el paso 1. Las bacterias fueron cultivadas en medio mínimo con sacarosa y añadidas a las raíces de tomate o hilos de nylon a una concentración final de aproximadamente 105/ml como se describe en el paso 5.1. El efecto del agregado de CaCl2 en Unión bacteriana en raíces de tomate e hilos de nylon fue examinado en el microscopio. La figura 4 muestra una inhibición similar de unión de calcio utilizando cualquier superficie lo que sugiere que el efecto del calcio es principalmente en las bacterias10.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> Figura 4 : El efecto del calcio sobre el atascamiento de a. tumefaciens a pelos de la raíz de tomate e hilos de nylon. A. tumefaciens se incubó con raíces de tomate (A y B) o hilos de nylon (C y D) durante 24 h en un 1:10 dilución de sales MS y una 1:20 dilución de medio mínimo AB, 0.4% de sacarosa (A y C) o en un 1:10 dilución de sales MS y 1:20 dilución de medio mínimo AB , 0.4% de sacarosa que contiene 60 mM CaCl2 (B y D)31. El agregado de CaCl2 inhibe Unión bacteriana a raíces e hilos de nylon, lo que sugiere que la inhibición era principalmente debido a un efecto en las bacterias y no en la superficie de la planta. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Un método sencillo para medir y caracterizar la adherencia bacteriana a las plantas, especialmente las raíces y brotes, se describe en este artículo.

Adherencia de bacterias a las superficies de midieron en el laboratorio de la planta

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

El objetivo general de este procedimiento es observar y medir la unión de bacterias a las superficies de las plantas. Este método puede responder preguntas importantes tanto en fitopatología como en seguridad alimentaria. En particular, puede responder preguntas sobre cómo las bacterias se unen a las superficies vegetales y cómo pueden eliminarse. La principal ventaja de esta técnica es que es sencilla, rápida y económica. Para preparar plántulas cultivadas en agua, coloque una pequeña cantidad de semillas en un vaso de precipitados de vidrio de 30, 50, 100 o 150 mililitros. En este caso, se utilizan semillas de tomate.Cubra las semillas con etanol al 80% y agite brevemente. Luego, deje remojar las semillas durante un minuto. Vierta el etanol y sumerja las semillas en una solución de lejía comercial al 50%, Triton X-100 al 0,1% y agua de grifo.Deje en remojo las semillas durante 20 minutos o más tiempo si las semillas son grandes, como las de frijol. Deseche la mezcla de lejía y lave las semillas tres veces con agua estéril, dejando las semillas en remojo en el agua durante un minuto en cada lavado. Vierta las semillas y una pequeña cantidad de agua en una placa de Petri estéril e incube las semillas a oscuras hasta que las plántulas alcancen el tamaño deseado, entre uno y diez centímetros.Para preparar semillas o plántulas cultivadas en arena, después de esterilizar las semillas y los materiales de siembra, inocule las semillas o plántulas con bacterias según el protocolo descrito en el texto. Utilizando una varilla de vidrio estéril, haga un orificio superficial en la arena, lo suficientemente profundo como para colocar la semilla debajo de la superficie. Coloque la semilla en el orificio y cúbrala con una capa fina de arena.Luego, utilice una película sellante para sellar la parte superior del recipiente y evitar la pérdida de agua y la entrada de microbios adicionales. Cultive las plantas en el laboratorio bajo luz o en el invernadero a una temperatura y duración del día adecuadas para la especie y variedad de la planta. Plante las plántulas en la arena.Utilice una varilla de vidrio estéril para hacer un orificio. Luego, con un gancho de acero inoxidable estéril, guíe cuidadosamente la raíz dentro del orificio y use arena para rellenar los lados del orificio. Después de incubar las plantas con bacterias según el protocolo descrito en el texto, prepare una muestra para microscopía colocándola en una gota de agua o medio de incubación sobre un portaobjetos y obsérvela directamente.Si no hay bacterias libres visibles, es posible que haya ocurrido muerte bacteriana o unión de las bacterias al recipiente en el que se llevó a cabo la incubación. Lave la muestra con agua o medio de incubación colocándola en un vial con líquido e invirtiendo suavemente el vial. A continuación, coloque la muestra en un portaobjetos de microscopio con líquido fresco para su observación.Para montar la muestra, utilice un cubreobjetos común. Si la muestra es gruesa y forma un bulto, agregue el líquido y la muestra en el pocillo de una cámara que tenga un cubreobjetos con un anillo de caucho o plástico alrededor del borde. Coloque el portaobjetos encima y presione suavemente hacia abajo para sellar el cubreobjetos al portaobjetos.Invierta la lámina para examinar la muestra. Alternativamente, use una lámina de recuento para algas y un cubreobjetos de manera similar y observe con una magnificación no mayor a 20 veces. Para determinar el número de bacterias viables encontradas en plantas cultivadas en arena, comience por retirar el material de sellado de la parte superior e inferior del recipiente.Coloque el recipiente sobre un trozo de papel estéril y golpee suavemente el recipiente contra la superficie para aflojar la arena antes de levantar suavemente la arena con la planta del recipiente. Cuando el cilindro de arena y la planta estén libres sobre el papel, corte la arena por la mitad para revelar la raíz de la planta. Si se desea, tome muestras de la arena de cerca del borde del recipiente, así como de cerca de la raíz.Esto puede ser útil para determinar la dispersión, acumulación y crecimiento de bacterias. Tome la raíz y elimine la arena y las bacterias que están débilmente adheridas sumergiendo la raíz en un volumen medido de agua o tampón y agitando suavemente. Determine el recuento de células viables de las bacterias en la suspensión resultante mediante su siembra en medios adecuados, como agar Luria.Esto representa el número de bacterias débilmente asociadas con la raíz. Finalmente, elimine las bacterias fuertemente adheridas mediante sonicación y determine su cantidad. Este gráfico muestra el efecto de dos mutaciones diferentes en la producción de celulosa sobre la capacidad de las bacterias para colonizar las raíces de tomate.Aunque las desviaciones estándar de algunas mediciones fueron tan altas como 0,9 logaritmos en base 10, la reducción en la unión de los mutantes sin celulosa es claramente evidente. En este experimento se midió la unión a brotes de alfalfa del tipo salvaje de E. coli 0157:H7 en mutantes incapaces de producir diversos exopolisacáridos. En ambas cepas, la producción de ácido poli-beta-1,6-glucurónico, o PGA, pareció aportar la mayor contribución a la unión de E. coli patógena a las superficies vegetales.El ácido colánico también desempeñó un papel importante en la unión. En este caso, se modificaron genéticamente dos cepas de bacterias incapaces de unirse a superficies vegetales para que produjeran PGA, con el fin de determinar si esto era suficiente para inducir la unión bacteriana a las raíces de tomate. En el caso de A.tumefaciens A1045, el PGA provocó que las bacterias se unieran individualmente a la superficie de la raíz.Por otro lado, S.meliloti se unía en grandes grupos, en los cuales solo unas pocas bacterias estaban directamente adheridas a la raíz, y la mayoría de las bacterias estaban unidas a otras bacterias. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de una hora para la configuración inicial, más el tiempo de incubación, y entre 10 minutos y una hora para la evaluación, dependiendo de la muestra. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las bacterias pueden adherirse a casi cualquier superficie.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo observar la unión de bacterias a las superficies de las plantas. Determine dónde en la planta se unen las bacterias y determine el número de bacterias unidas. No olvide que si lleva a cabo estos procedimientos con patógenos humanos, el procedimiento puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en una cabina de contención y usar guantes.

adherence-of-bacteria-to-plant-surfaces-measured-in-the-laboratory

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