Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos
21 de diciembre de 2017
Este manuscrito describe un método para etiquetar las transcripciones de los ARN mensajero (ARNm) con sonda de ADN marcada con fluorescencia, para el uso en experimentos de fluorescencia de una sola molécula en situ hibridación (smFISH) en e. coli. smFISH es un método de visualización que permite la detección simultánea, localización y cuantificación de moléculas individuales de ARNm en células individuales fijas.
El objetivo general de este protocolo es etiquetar transcripciones individuales en E. Coli para sondas de ADN marcadas con fluorescencia para su visualización en experimentos de FiSH de una sola molécula. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de sistemas, como la caracterización de las transcripciones de la capacidad célula a célula del campo de interés. Así como las transcripciones de la localización de la pared celular.
La principal ventaja de esta técnica es que proporciona cantidad de información sobre las estadísticas de los procesos transcripcionales. Para comenzar el protocolo, cultive E.Coli MG1655 en medio LB durante la noche en un agitador orbital, a 260 RPM y 37 grados Celsius. Al día siguiente, diluya el cultivo durante la noche a uno por 100 en medio fresco y mida su densidad óptica en un espectrofotómetro, hasta un valor de 0,2 a 0,4.
A continuación, granule las células por centrifugación durante cinco minutos a 4.500 G a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante de todos los tubos. Agregue un mililitro de 1XPBS a cada tubo y vuelva a suspender el pellet para minimizar la agregación de célula a célula.
A continuación, añada cuatro mililitros de tampón de fijación y agite suavemente el tubo. Incubar las muestras en un agitador orbital. Vuelva a suspender el gránulo para minimizar la agregación de célula a célula, que puede interferir con la obtención de imágenes celulares.
Después de la incubación, granule las células, retire el sobrenadante y agregue un mililitro de 1XPBS. Transfiera las suspensiones a tubos de microcentrífuga de fondo cónico de 1,8 mililitros. Granular las células por centrifugación.
Comience la permeabilización de las bacterias eliminando cuidadosamente el sobrenadante. Utilice pipetas de pequeño volumen para eliminar todo el líquido fuera del pellet. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 300 microlitros de agua tratada con DEPC.
Agregue 350 microlitros de etanol absoluto de alta calidad y mezcle la solución suavemente invirtiendo el tubo. Agregue otros 350 microlitros de etanol y mezcle nuevamente. A continuación, gire la muestra con el rotador de tubos a 20 rpm durante una hora a temperatura ambiente.
Pellet las células de la permeabilización. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante. Agregue un mililitro de tampón de lavado al 20% a las muestras.
Déjalos reposar durante varios minutos. A continuación, las células de pellets por centrifugación durante siete minutos a 750 G y cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante con mucha suavidad y utilice pipetas de pequeño volumen para eliminar todo el líquido del exterior del pellet.
A continuación, añada la solución madre del conjunto de sondas de oligonucleótidos a la alícuota del tampón de hibridación de modo que la concentración final de oligonucleótidos sea de 250 nanomolares y vórdese el tubo vigorosamente. Suspender las muestras en 50 microlitros de tampón de hibridación que contiene las sondas de oligonucleótidos, evitando la generación de burbujas. Deje las muestras toda la noche, en la oscuridad, en un bloque de calor a 30 grados centígrados.
Para preparar el lavado, obtenga un nuevo tubo de microcentrífuga para cada muestra que se va a fotografiar. Agregue un mililitro de tampón de lavado a cada tubo. Agregue de 10 a 15 microlitros de las muestras hibridadas al nuevo tubo que contiene el tampón de lavado.
Granular las células por centrifugación. A continuación, retira el sobrenadante. Lave las muestras dos veces más.
Vuelva a suspender el pellet en tampón de lavado de 25 microlitros. Prepare un gel de agarosa agregando 150 miligramos de agarosa a 10 mililitros de tampón SSC 2X. Calienta la solución en el microondas durante 10 a 15 segundos cada vez, hasta que la agarosa se disuelva por completo.
A continuación, deja el tubo a un lado para que se enfríe durante unos minutos. A continuación, coloque un marco de silicona separador en el portaobjetos para que el centro del portaobjetos permanezca expuesto. Coloque un anillo rígido de 10 milímetros de ancho y de uno a dos milímetros de grosor en el centro del portaobjetos.
Deposite una pequeña cantidad de gel en el centro para sellar y espere unos minutos para que el gel se endurezca. Luego agregue más gel, hasta que se forme una forma de cúpula alta. Espere unos 10 minutos para que el gel se endurezca y retire el anillo.
Deposite 10 microlitros de células bacterianas de lavado en el gel y séllelo con un portaobjetos de cubierta número cero. Mantenga la muestra en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo. Las mediciones de smFiSH de células de E. coli muestran el nivel de inducción de galK en respuesta a concentraciones variables de D-fucosa extracelular.
La señal de fondo se muestra mediante una deformación galK eliminada o delta galK JW0740 como control negativo. Se observan numerosas manchas en la mayoría de las células. Corresponde a transcripciones de una o pocas galK cuando se añaden dos milimolares de D-fucosa al cultivo bacteriano.
Mientras que se observan algunas manchas en ausencia de D-fucosa extracelular. Otro ejemplo para la aplicación de este protocolo es el gen sodB, con imágenes de fluorescencia y contraste de fase de smFiSH en un tipo salvaje o una cepa delecionada con sodB JW1648. Las muestras preparadas con este protocolo también pueden ser visualizadas utilizando STORM, que permite una precisión precisa de las transcripciones en la célula.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de sistemas exploraran las estadísticas de los eventos de transcripción en células individuales.
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Descripción general
Este manuscrito describe un método para etiquetar transcripciones individuales de ARN mensajero (ARNm) con sondas de ADN marcadas con fluorescencia para su uso en experimentos de hibridación in situ de fluorescencia de molécula única (smFISH) en E. coli. Esta técnica permite la detección simultánea, localización y cuantificación de moléculas individuales de ARNm en células fijas individuales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología de sistemas
- Biología celular
Fundamentos
- La hibridación in situ de fluorescencia de molécula única (smFISH) es un método de visualización potente.
- Este método permite el estudio de procesos transcripcionales a nivel de célula única.
- Comprender la localización y cuantificación del ARNm es crucial para la biología de sistemas.
- E. coli sirve como organismo modelo para estos experimentos.
Propósito del estudio
- Etiquetar transcripciones individuales de ARNm en E. coli.
- Visualizar la localización del ARNm utilizando sondas de ADN marcadas con fluorescencia.
- Mejorar la comprensión de la variabilidad transcripcional entre células.
Métodos utilizados
- Criar E. coli MG1655 en medio LB durante la noche.
- Diluir el cultivo nocturno en medio fresco.
- Medir la densidad óptica para asegurar condiciones de crecimiento adecuadas.
- Aplicar sondas de ADN marcadas con fluorescencia para el análisis smFISH.
Principales resultados
- Etiquetado exitoso de transcripciones individuales de ARNm.
- Visualización de la localización del ARNm dentro de células fijas.
- Cuantificación de procesos transcripcionales a nivel de molécula única.
- Perspectivas sobre la variabilidad entre células en la expresión de transcritos.
Conclusiones
- El método proporciona un enfoque robusto para estudiar la dinámica del ARNm.
- Contribuye con información valiosa al campo de la biología de sistemas.
- Esta técnica puede aplicarse a varias preguntas de investigación relacionadas con la expresión génica.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) in E. coli enables direct quantification and spatial mapping of mRNA transcripts at single-cell resolution, addressing key challenges in understanding transcriptional heterogeneity. This capability supports predictive confidence in early discovery by revealing cell-to-cell variability and subcellular transcript localization. The method is strategically positioned for target validation and mechanistic de-risking in microbial systems biology and synthetic biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of gene expression variability across individual bacterial cells.
- Supports mechanistic de-risking by mapping transcript localization and abundance at single-molecule resolution.
- Facilitates functional target validation by distinguishing true biological effects from population-averaged artifacts.
- Provides high-content data for hypothesis-driven pathway analysis in microbial models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream screening of gene regulation or synthetic constructs.
- Delivers reproducible, quantitative mRNA copy number outputs for assay standardization.
- Enables multiplexed transcript detection within single cells, limited by spectral overlap of fluorophores.
- Supports robust evaluation of gene induction or repression in response to experimental perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling precise quantification of gene expression changes in microbial models.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation for engineered strains or pathway interventions.
- Reduces risk in advancing microbial targets by supplying single-cell resolution data on transcript dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This smFISH labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for microbial systems, supporting both hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Delivers direct measurement of transcriptional events and spatial transcript distribution for pathway clarification.
- Screening: Supplies standardized, quantitative readouts for evaluating gene expression modulation in engineered or wild-type strains.
- Analytics: Enables statistical analysis of mRNA copy number distributions and cell-to-cell variability using open-source or custom software.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by validating gene expression changes at single-cell resolution.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for transcript quantification in diverse bacterial systems and experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial gene expression studies.
- Operational Value: Standardizes transcript labeling and imaging for reproducible, scalable data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for microbial targets and synthetic constructs by providing high-resolution expression data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial targets and engineered pathways based on quantitative single-cell analytics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial cell handling, fixation, and fluorescence microscopy.
- Needs access to fluorescence imaging platforms with low-intensity detection and appropriate filter sets.
- Demands cross-team standardization of probe design and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other bacterial strains or gene targets may require probe redesign and spectral optimization.
- Multiplexing is limited by spectral overlap of available fluorophores, constraining simultaneous gene detection.
