Name: Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprende a etiquetar ARN mensajero individual en Escherichia coli mediante sondas de ADN fluorescentes para experimentos de hibridación in situ de fluorescencia de molécula única. Este método permite detectar, localizar y cuantificar transcritos a nivel celular.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación de Ciencias de Israel 514415 (a J.S.) y una donación de BSF-NSF (MCB) 2016707 (a J.S.). Apoyo de un Siegfried y Ullman Irma profesor silla (J.S.) también es reconocida.

1. diseño de la sonda
Nota: Este protocolo utiliza una sonda de oligonucleótidos comercialmente disponible ya etiquetada con fluoróforos. Las puntas de prueba consisten en un conjunto de secuencias específicas complementarias a un blanco mRNA, cada sonda está conjugado con una sola molécula fluorescente. Alternativamente, es posible fijar marcadores fluorescentes para puntas de prueba, como se describe en otra parte5,16.
<ol>
	<li>Sondas de smFISH de diseño utilizando el algoritmo de16 diseño de sondeo desarrollado por Arjun Raj (van Oudenaarden Lab, Instituto Tecnológico de Massachusetts); secuencias de sondas smFISH en este manuscrito se enumeran en la tabla de materiales. Nota: El número mínimo de sondeos en un conjunto para una señal detectable es de ~ 30. El número exacto puede variar según el gen de interés, particularmente si se miden las transcripciones muy corto.</li>
	<li>Elegir un tinte que se adapta a la configuración óptica (véase tabla de materiales). Nota: El tinte Cy3 o un colorante ópticamente equivalente con una baja susceptibilidad al blanqueo de foto es muy recomendable. Un candidato para el etiquetado dual es Cy5 o un ópticamente equivalente del tinte (véase tabla de materiales). Colorantes adecuados para la proyección de imagen de tormenta de ARNm marcado se caracterizan por su capacidad para múltiples ciclos de emisión de fluorescencia. Algunos colorantes de smFISH pueden ser utilizados para la proyección de imagen de tormenta (véase tabla de materiales). Para las transcripciones de dos (o más) correspondientes a los diferentes genes en la misma célula de la imagen, uno debe elegir las puntas de prueba del oligonucleótido conjugados con tintes cuyos espectros tienen poca o ninguna superposición.</li>
</ol>
2. preparación del reactivo
Nota: Es importante mantener las muestras libres de Rnasa utilizando consumibles libre de Rnasa como filtrado de pipetas y tubos y mantener cualquier ambiente de trabajo limpio. Con el fin de evitar la degradación de las transcripciones de destino, todos los reactivos utilizados siguiendo la fijación de la célula deben estar libre de nucleasas (véase tabla de materiales) o diethylpyrocarbonate (DEPC)-tratada y esterilizada.
<ol>
	<li>Buffers para smFISH
	<ol>
		<li>Preparación libre de RNasa 1 x PBS (tamponada fosfato salino, solución con una concentración de tampón fosfato 0,01 m y una concentración de cloruro de sodio de 0,154 M (pH 7,4)). Diluir PBS 10 x libre de Rnasa (véase tabla de materiales) en libre de nucleasa de agua (véase tabla de materiales) con un 1:10 cociente v/v.<ol>
			<li>Preparar o bien tratada con DEPC 1 x PBS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Preparación libre de Rnasa 2 x SSC (tampón de citrato salino de sodio, 0.3 M de NaCl en citrato de sodio de 0,03 M, (pH 7.0)). Diluir libre de Rnasa 20 x SSC (véase tabla de materiales) en agua libre de nucleasas en un 1:10 cociente v/v.<ol>
			<li>Por otra parte, preparar 2 tratada con DEPC x SSC.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Solución madre de la sonda de oligonucleótidos.
	<ol>
		<li>Volver a disolver la mezcla de sonda de oligonucleótidos secos en 200 μL de tampón TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) para crear un stock de prueba de 25 μm. Mezclar por pipeteo arriba y abajo y luego vortex y centrifugar brevemente.</li>
		<li>Para evitar la congelación y deshielo del tubo solución, hacer varias alícuotas de la solución madre, corresponde a la cantidad que se espera utilizar en un único experimental ejecutar. Almacenar la solución a-20 ° C o inferior y proteger de la luz. Nota: Un sistema de sonda de 5 nmol puede proporcionar hasta 250 reacciones de hibridación.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tampón de hibridación (después Skinner et al. 7 ):
	<ol>
		<li>Añadir 5 mL de agua libre de nucleasa a un tubo cónico-parte inferior polipropileno 50 mL. Añadir 1 g de sulfato de dextrán al agua y disolverla con un vórtex vigoroso. Mezcle el contenido en un agitador orbital hasta que las burbujas desaparezcan (~ 30 min).</li>
		<li>Añadir a la solución 3.530 μl de formamida desionizada, 10 mg de tRNA de e. coli , 1 mL 20 x SSC, 100 μl de complejo de vanadyl ribonucleósido de 200 mM y 40 μl de 50 mg/mL BSA. Traer el volumen final a 10 mL por adición de agua tratada con DEPC o agua libre de nucleasas y agitar la solución hasta que quede homogéneo. Nota: Para evitar la congelación y descongelación de la solución, hacer varias alícuotas de la solución madre, corresponde a la cantidad que se espera utilizar en un único experimental ejecutar. Almacenar la solución a-20 ° C. Asegúrese de dejar la formamida caliente a la temperatura ambiente antes de abrir la botella. Para reducir el fondo, se recomienda calibrar la concentración óptima de formamida (10-40% cociente de v/v). 
		PRECAUCIÓN: ¡ADVERTENCIA! Formamida es altamente tóxico y un conocido teratógeno. Evite el contacto con los ojos o la piel, inhalación o ingestión. Manejar bajo una campana de humos mientras se está usando una bata de laboratorio y guantes de protección.</li>
		<li>Esterilizar la solución haciéndola pasar por un filtro de 0,22 μm. Guardar en alícuotas y almacenar a-20 ° C hasta un año.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparar memoria intermedia de fijación (4.6% formaldehído en PBS 1 x) mediante la adición de formaldehído al 37% (v/v) en PBS 1 x (ver 2.1.1) en un cociente de v/v y vórtice de 1:8. PRECAUCIÓN: ADVERTENCIA! El formaldehído es altamente tóxico y un carcinógeno conocido. Manejar bajo una campana de humos mientras se está usando una bata de laboratorio y guantes de protección.</li>
	<li>Preparar el tampón de lavado para smFISH (20% formamida en 2 x SSC) agregando formamida desionizada a 2 x SSC (ver 2.1.2) en un cociente de v/v y vórtice de 1:4.</li>
	<li>Preparar imágenes buffer para smFISH mediante la adición de 5 mM cisteamina y oxígeno carroñeros (7 μm glucosa oxidasa, catalasa nM 56 y glucosa 10% (p/v)) para tapón de lavaje (20% formamida en 2 x SSC)</li>
	<li>Búferes de tormenta
	<ol>
		<li>Preparar el tampón A añadiendo 50 mM Tris-HCl y 10 mM de NaCl en agua libre de nucleasa. Nota: Almacene a temperatura ambiente durante años.</li>
		<li>Preparar Buffer B agregando 50 mM Tris HCl, 10 mM de NaCl y 10% w/v glucosa al agua libre de nucleasa. Nota: Almacene a 4 ° C por hasta un año.</li>
		<li>Preparar el tampón MEA disolviendo cisteamina 77 mg en 1 mL de tampón A (hace una solución de 1 M). Nota: Se puede almacenar a 4 ° C durante 1 mes.</li>
		<li>Preparar Gloxy buffer agregando 8.440 AU (unidades arbitrarias) glucosa oxidasa y catalasa 70.200 de AU 1 ml buffer A. Nota: Hace 50 x solución stock, se puede almacenar a 4 ° C durante 1 mes.</li>
		<li>Preparar buffer de tormenta mediante la adición de 50 mM de tampón MEA y 1 x Gloxy buffer a buffer B. Nota: El buffer de imagen de tormenta se compone de 5 mM cisteamina, depuradores de oxígeno (7 μm glucosa oxidasa y catalasa nM 56) en 50 mM Tris 10 mM NaCl y 10% de glucosa a pH 8.0. Preparar justo antes de la proyección de imagen, puede ser almacenado y utilizado a temperatura ambiente por aproximadamente 2 h.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. muestra la fijación
<ol>
	<li>Crecen las células bacterianas (p. ej., E.</li></ol>coli MG1655) en medios de crecimiento de la coctelera de elección (p. ej., medio LB) durante la noche inan orbital a 260 rpm y 37 ° C. Nota: Para determinar el fondo debido a la fijación no específica de las sondas, mediciones en una cepa en la que se ha eliminado el gen de interés se realizará, siguiendo los mismos procedimientos (véase Δgalk en figura 1 y ΔsodB en Figura 2).
	<li>Diluir la cultura durante la noche 1: 100 en medio fresco y medir su densidad óptica (OD600) en un espectrofotómetro cada h ~ 1, hasta un valor de 0.2 - 0.4; una cultura de 4 mL serán suficiente. Nota: Si el microscopio elegido carece de contraste de fases o funciones de contraste de interferencia diferencial, membranas externas de e. coli pueden ser etiquetadas con marcador fluorescente lipofílico de 2 μM (véase tabla de materiales), que se debe agregar a la suspensión bacteriana 20 min antes de la fijación17. Fijación y posterior tratamiento se logran como se describe a continuación. Debe tener cuidado de elegir un marcador fluorescente con un diverso espectro de emisión, para reducir al mínimo el traslapo espectral con el conjunto de la sonda marcada.</li>
	<li>Pellet de células por centrifugación durante 5 min a 4.500 g a 4 ° C. Retire el sobrenadante de todos los tubos.</li>
	<li>Añadir 1 mL de 1 x PBS a cada tubo y resuspender el precipitado para reducir la agregación de célula a célula. Añada 4 mL de buffer de fijación y agitar suavemente.</li>
	<li>Incubar las muestras en un agitador orbital a 260 rpm durante 30 min a 24 ° C.</li>
	<li>Pellet de células por centrifugación 10 min, 1.000 g, 4 º C. Eliminar el sobrenadante. Añadir 1 mL 1 x PBS.</li>
	<li>Suspensiones de transferencia a tubos de microcentrífuga cónica inferior de μL 1,8 (véase tabla de materiales) y repita el paso 3.6 dos veces.</li>

4. muestra permeabilización
<ol>
	<li>Quite con cuidado el sobrenadante. Utilizar pipetas de pequeño volumen, si es necesario, para eliminar todo el líquido fuera de la pelotilla.</li>
	<li>Resuspender en 300 μL de agua tratada con DEPC o agua libre de nucleasa. Añadir 350 etanol de μl alto grado absoluto (99%) y mezclar suavemente por inversión del tubo. Añadir otro 350 μl de etanol y mezcla otra vez, para llegar a una concentración final de etanol de 70% (cociente de v/v). PRECAUCIÓN: ADVERTENCIA! El etanol es inflamable.</li>
	<li>Rotar la muestra con un agitador de tubo a 20 rpm durante 1 h a temperatura ambiente (RT), o a 4 ° C durante la noche. Las muestras pueden ser almacenadas a 4 ° C una semana.</li>
</ol>
5. hibridación
<ol>
	<li>Pellet de células por centrifugación de 7 min, 750 g de x, 4 º C. Eliminar el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 1 mL 20% lavado Tampón a las muestras y dejar reposar por varios minutos o pipeta para disolver completamente la pastilla.</li>
	<li>Pellet de células por centrifugación por 7 min, x 750 g, 4 º C.</li>
	<li>Retire suavemente el sobrenadante mediante pipeteo. Utilizar pipetas de pequeño volumen si es necesario quitar todo el líquido fuera de la pelotilla.</li>
	<li>Añadir la punta de prueba del oligonucleótido establece la solución en la alícuota de tampón de hibridación para que la concentración del oligonucleótido final es de 250 nM; Vortex vigorosamente. Nota: Una etiqueta de dos o más mRNAs diferentes a la vez en la misma célula. Agregar conjuntos de sonda de ambos objetivos para el tampón de hibridación. Debe tener cuidado de elegir tintes tienen diferentes espectros de emisión para reducir al mínimo el traslapo espectral (p. ej., Cy3 y Cy5). Asegúrese de que las muestras destinadas a proyección de imagen de tormenta se cruzó por hibridación con una sonda de oligonucleótidos sistema conjugada con un tinte adecuado para tormenta (por ejemplo, en la tabla de materiales).</li>
	<li>Suspender las muestras (véase el paso 5.4) en 50 μl de tampón de hibridación que contiene las sondas de oligonucleótidos, evitando la generación de burbujas (la solución es muy viscosa).</li>
	<li>Dejar las muestras durante la noche en un bloque caliente a 30 ° C en oscuridad. Nota: Después de esto, las muestras pueden almacenarse hasta por 6 meses a 4 ° C.</li>
</ol>
6. lavado
<ol>
	<li>Utilice un tubo nuevo de microcentrífuga para cada muestra a la imagen. Añadir 1 mL de tampón de lavado.</li>
	<li>Añadir 10-15 μl de las muestras hibridadas al nuevo tubo que contiene el tampón de lavado y mezcla/vortex.</li>
	<li>Pellet de células por centrifugación por 7 min, 750 x g a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. Nota: Para reducir el fondo, incubar 1 h a 30 ° C.</li>
	<li>Lavar dos veces más (resuspender en 1 mL de tampón de lavado, centrifugar y eliminar pellets).</li>
	<li>Resuspender en 25 μl de tampón de lavado. Nota: Para reducir una foto-blanqueo puede Agregar en el tampón de lavado oxígeno limpieza sistema (2.6) para mejorar la estabilidad del colorante en experimentos de fluorescencia de una sola molécula6.</li>
</ol>
7. preparación de muestras para la proyección de imagen
Nota: Las células necesitan ser inmovilizados para permitir la proyección de imagen adecuada bajo un microscopio de fluorescencia y contraste de fase. Los siguientes métodos pueden utilizarse para preparar muestras en las que diferentes campos de vista puede ser reflejada en diferentes planos focales.
<ol>
	<li>Preparación del gel de agarosa
	<ol>
		<li>Añadir 150 mg agarosa a 2 de 10 mL del tampón de x SSC. No agregue 2 x SSC en agarosa, o bien no se disolverá debidamente.</li>
		<li>Microondas para 10-15 s cada vez, hasta grandes burbujas empiezan a formar. Dejar de lado que se enfríe durante unos minutos.</li>
		<li>Coloque un marco de silicona separación en la diapositiva para que quede expuesto el centro de la diapositiva.</li>
		<li>Coloque un anillo rígido de 10 mm ancho (1-2 mm de espesor) en el centro de la diapositiva y depositar una pequeña cantidad de gel, para el sellado. Espere unos minutos para que se endurezca.</li>
		<li>Añadir más gel hasta una forma de domo alto. Esperar 10 minutos para se endurezca y retire el anillo (con unas pinzas finas o cualquier otro método).</li>
		<li>Depósito de ~ 10 μL de lavado las células bacterianas (ver 6.5) en el gel y el sello con un portaobjetos cubreobjetos de #0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparación de muestras de cámara para smFISH
	<ol>
		<li>Como alternativa (hasta 7.1) preparar muestras para la proyección de imagen de inmovilizar las células bacterianas lavadas (ver 6.5) en la parte inferior de poly-D-lisina-recubiertas de vidrio desechables plástico Petri.</li>
		<li>Incubar las muestras en la oscuridad, a temperatura ambiente, durante la noche antes de la visualización para permitir la adherencia de las células a la superficie. Antes de visualización una vez lavado con tampón de lavado (. 5); mantener la muestra húmeda con tampón de buffer(2.5) o la proyección de imagen de lavado para smFISH (2.6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparación de la muestra de cámara para la tormenta
	<ol>
		<li>Preparar muestras de tormenta para la proyección de imagen de fondo de poly-D-lisina-recubiertas de vidrio desechable plástico Petri.</li>
		<li>Incubar las muestras en la oscuridad, a temperatura ambiente, durante una noche. Antes de lavar de visualización una vez con tampón de lavado para smFISH (2.5); y agregar buffer imagen de tormenta (2.7.5).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8.Visualización de la transcripción
<ol>
	<li>Imagen de células con un microscopio de fluorescencia de campo amplio equipado con una platina motorizada (véase tabla de materiales). Nota: Para la modificación de la tormenta, utilizan células marcadas con un pigmento capaz de múltiples ciclos de emisión de fluorescencia. La muestra usando el sistema de imagen 3D super resolución de la imagen (por ejemplo, ver la tabla de materiales).</li>
	<li>Uso (se recomienda) un 60-100 x N.A &#62; 1.3 petróleo inmersión fase contraste objetivo con una fuente de luz fuerte, como mercurio o lámpara de haluro de metal; También se recomiendan las fuentes de luz basada en LED.</li>
	<li>Uso un estándar refrigerado por cámara CCD, idealmente optimizado para la proyección de imagen de luz de bajo nivel en lugar de velocidad (utilizamos una cámara con tamaño de píxel de 16 μm) (véase tabla de materiales). Nota: El uso de un EMCCD refrigerado (electrones multiplicando el dispositivo de carga acoplada) cámara CCD es necesaria para reducir el ruido térmico que evita la detección, particularmente de las moléculas individuales.</li>
	<li>Use el cartucho de juegos apropiado para los fluoróforos elegido.</li>
	<li>Para determinar correctamente los límites de la célula, adquisición de imágenes de diferentes campos de vista en cada muestra con la óptica de contraste de fase, o fluorescencia de etiquetado la membrana celular externa. Adquisición de imágenes en diferentes planos focales (z-stack) para todos los canales (generalmente 13 rebanadas separaron por 250 nm se toman). Nota: La etapa motorizada del microscopio y los conjuntos de filtro debe estar controlada por comercial (véase tabla de materiales) o software interno que puede captar un montón de imágenes en secuencia.</li>
</ol>
9. Análisis de datos
<ol>
	<li>Convertir las pilas de la imagen a un formato adecuado para análisis de datos.</li>
	<li>Estimar el número de la copia de la meta ARNm de la intensidad total de focos fluorescentes en la célula, en lugar de conteo discretos 'manchas' como en otros protocolos disponibles en la actualidad.</li>
	<li>Realizar análisis de imágenes con software libre18 o con un programa a la medida. Para obtener más información de la proyección de imagen de datos y análisis ver Skinner et al. 7</li>
</ol>

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<li>Arbel-Goren, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+degradation+and+noise+of+small+RNA-controlled+genes+in+a+switch+activated+network+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).</li>
<li>Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272811000909/pdfft?md5=6d05a9738e887934c944928bf6182e5c&pid=1-s2.0-S0005272811000909-main.pdf">A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En nuestro laboratorio hemos medido el número de transcripción de distintos genes en células de e. coli utilizando el método de smFISH2. En Resumen, este procedimiento consta de los siguientes pasos: fijación de la célula, permeabilización de membranas para permitir la penetración de la sonda, sonda de hibridación y proyección de imagen usando un microscopio estándar de fluorescencia de la muestra. Este procedimiento se basa en los previamente publicados con algunas modificaciones<sup cla...

La estocasticidad es un aspecto fundamental e inevitable de la expresión génica y da lugar a la célula heterogeneidad1, tanto a nivel de transcripción y proteínas2,3. Cuantificación de la variabilidad entre las células bajo condiciones bien definidas ofrece una ventana única en los procesos básicos que subyacen a su regulación y expresión génica. Una fuente importante de heterogeneidad de la célula en bacterias ocurre a nivel transcripcional. Transcripción de números varían no sólo por la estocasticidad de transcripción, sino también a procesos regulación postranscripcional de small RNAs y ARNases2. Una forma de acceder directamente a esta heterogeneidad de manera cuantitativa es etiquetado fluorescente individual transcripción de un gen determinado en smFISH. Esta metodología permite la detección y la localización subcelular de las moléculas de ARN particular en fijos, las células bacterianas individuales4. mRNAs se hibridó con un sistema de marcada con fluorescencia ~ 20 largo base de oligonucleótidos que son diseñado para unirse selectivamente a las transcripciones de interés5,6. Etiquetado múltiples asegura la detección por fluorescencia del fondo encima de, y las moléculas de ARNm individuales aparecen como manchas de difracción limitada bajo un microscopio de fluorescencia7 (Ver figura 1). Existen otros enfoques para el etiquetado de las moléculas de mRNA, en los que las sondas complementarias oligómero llevan haptenos conjugados (por ejemplo, biotina o digoxigenina) que se detectan mediante técnicas de reportero marcada con fluorescencia secundaria8.
Hay otros métodos que proporcionan información cuantitativa sobre las transcripciones, además de smFISH. Algunos, como el Northern blot o PCR cuantitativa, la mayor parte de la sonda y por lo tanto puede medir el número de copias de mRNA ni su posición en las células individuales. Por lo tanto estos métodos no son adecuados para cuantificar la variabilidad de célula a célula. Se ha desarrollado una técnica basada en la imagen reciente que permite cuantificar el número de copias de ARN dentro de las células así como su localización intracelular, llamado multiplexado error robusto en situ hibridación de la fluorescencia (MERFISH). MERFISH se basa en la asignación de un código de barras único que consiste en una combinación definida de un número fijo de sondas de oligonucleótidos marcados con fluorescencia. Estos códigos de barras se leen hacia fuera en rondas secuenciales de medidas smFISH, con fotoblanqueo después de cada ronda de hibridación, aumentando rendimiento de procesamiento por dos órdenes de magnitud9,10. Esta técnica requiere un líquido automatizado manejo de sistema y el diseño apropiado de la serie de la sonda.
La combinación de múltiples fluorescencia de etiquetado de expedientes individuales, junto con técnicas de superresolución novela como estocásticos reconstrucción óptica microscopia (tormenta)11, permite un aumento diez veces de resolución en el localización subcelular de las transcripciones. En la tormenta, una conveniente combinación de sondas fluorescentes y búfer de imagen permite múltiples ciclos de emisión de fluorescencia por la molécula de la sonda (parpadeando). TORMENTA también puede utilizarse para el transcriptoma de e. coli de la imagen y observar la organización espacial de todo el genoma de ARN, por etiquetado simultáneamente todas las transcripciones de interés12.
Todos los métodos de la sola célula revisados anteriormente se basan en imágenes transcritos en células fijas. Por lo tanto, no proporcionan ninguna información sobre las propiedades cinéticas de las transcripciones dentro de las células. Para seguir las transcripciones en células vivas13, mRNAs pueden ser etiquetados por la fusión del gen de interés para una amplia gama de sitios de Unión. Estos últimos son luego reconocidos por una proteína de unión a RNA, como el bacteriófago MS2 proteína de la cápsida, que está unida a una proteína fluorescente como la proteína verde fluorescente (GFP)10,14,15.
Aquí se describe un método para etiquetar mRNAs individuales con un conjunto de sondas de ADN marcada con fluorescencia, para el uso en experimentos de smFISH, en particular en e. coli. Por otra parte, nos muestran que el mismo esquema de etiquetado puede utilizarse para mediciones de tormenta con modificaciones menores.

<table><tbody><tr><td>Sulfato de dextrano sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Etanol puro, 99,5%, reactivo ACS, absoluto</td><td>Mallinckrodt Baker - Avantor</td><td>8025.25</td><td></td></tr><tr><td>Dietilpirocarbonato (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Libre de ARNasa 20X SSC</td><td>Life Technologies/Ambion</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>Libre de ARNasa 10X PBS</td><td>Life Technologies/Ambion</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Tampón TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) BioUltra, para biología molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>agua libre de nucleasas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>solución de formaldehído para biología molecular, 36,5-38% en agua</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Formamida desionizada, libre de nucleasa</td><td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>E. coli tRNA (ácido ribonucleico, tipo de transferencia xx de escherichia)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753-500UN</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure BSA (50 mg/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td><td>AM2616</td><td></td></tr><tr><td>Complejo de vanadil-ribonucleósido, VRC, 200 mM</td><td>New England Biolab</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Cisteamina y oxígeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa oxidasa de Aspergillus niger, Tipo VII, 50KU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Catalasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-fucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8150</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO Cell Labeling Solution Life</td><td> Tecnologías</td><td>V2286</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa, reactivo de bajo punto de fusión</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Aislador de silicona adhesivo 24-2 mm de diámetro x 1,8 mm de profundidad JTR24R-A2-2.0</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A2-2.0 666208</td><td></td></tr><tr><td>fondo de vidrio recubierto de poli-D-lisina Platos de cultivo con fondo de vidrio</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de examen sin polvo de nitrilo Super life</td><td>Supermax</td><td>TC-N-9889</td><td></td></tr><tr><td>Cinta incubadora de esterilización</td> de la marca <td>Sigma-Aldrich BR61750</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (1,8 ml)</td><td>Axygen - Corning Life Sciences</td><td>MCT-175C</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de fondo redondo Falcon (14 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de fondo cónico de polipropileno tubos (50 ml)</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (Corning 5 ml)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4051</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (Corning 10 ml)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (Corning 25 ml)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas espectrofotómetro</td><td>Sarstedt</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta sin RNasa 0,2 - 20 &mu; l</td><td>FroggaBio</td><td>FT20</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta sin RNasa 10 - 200 &mu; l</td><td>Axigene/corning</td><td>TF-200</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta sin RNasa 100 - 1000 &mu; l</td><td>FroggaBio</td><td>FT1000</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta sin RNasa 100 - 1000 &mu; l</td><td>Sorenson</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa disposile 10 mL aguja G-21</td><td>Becton Dickinson, Biosciences</td><td>BD-309643</td><td></td></tr><tr><td>Minisart 0.2 mmm Filtro de jeringa</td><td>Sartorius</td><td>16534 K</td><td></td></tr><tr><td>Nikon instruments microscopio tipo A aceite de inmersión A, 8cc</td><td>Nikon</td><td>MXA20233</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio 76 x26, 3"x1"x1mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>421-004ET</td><td></td></tr><tr><td>#0 corredera de cubreobjetos 24x60</td><td>Thermo Fisher Scientific/Menzel</td><td>BNBB024060A0</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>M.R.C</td><td>TOU-50</td><td></td></tr><tr><td>Bloque caliente</td><td>M.R.C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fried Electric Company</td><td>G-560-E</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid Portátil XP2, Controlador de Pipeta</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>4-000-501-I</td><td></td></tr><tr><td>OD600 Espectrofotómetro para tasas de crecimiento bacteriano DiluPhotometer</td><td>Midsci</td><td>OD600-10</td><td></td></tr><tr><td>iXon X3 EMCCD cámara</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td> </td></tr><tr><td>Eclipse Ti Microscopio</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td> </td></tr><tr><td>CFI plan apocromático DM 100X objetivo de aceite lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13</td><td>Nikon</td><td>MRD31905</td><td> </td></tr><tr><td>Juego de filtros (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP</td><td>Nikon</td><td>49005</td><td> </td></tr><tr><td>Juego de filtros (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P</td><td>Nikon</td><td>49009</td><td> </td></tr><tr><td>Software de investigación automática AR de elementos Nis-elements</td><td></td> <td>Microscopio Nikon</td> MQS31000 <td> </td></tr><tr><td>STORM</td><td>Vutara</td><td>SR-200</td><td> </td></tr><tr><td>NA 1.2 objetivo de inmersión en agua </td><td>Olympus</td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>SRX software de adquisición y análisis de imágenes</td><td>Cámara Vutara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evolve 512 EMCCD</td><td>Fotometría</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stellaris&reg; Sondas FISH, ensayo personalizado con CAL Fluor&reg; Rojo 590 Dye Biosearch</td><td>Technologies Inc</td><td>SMF-1083-5</td><td></td></tr><tr><td>Secuencia de sonda para galK mRNA: </fuerte></td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttttttctttcagactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tagccaaatggttggcaaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctgaatggtgtggcag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caccaatcaaattcacgcgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgaaaccgtcgttgtagtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgataatcaatcgcgcaggg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtggtgcacacaactgatcacg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgcgaactttacggtcatc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gctgattttcataatcggct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcatcgagggaaaactcgtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gttttcatgtgcgacaatgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cacgccacgaacgtagttag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttacgcagttgcagatgttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tccagtgaagcggaagaact</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgctgcaatacggttccgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtccagcggcagataaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgaccgttaagcgcgatttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>agcctacaaactggttttct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcggaaattagctgatccat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>aaggcatgatctttcttgcc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cagtgagcggcaatcgatca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgggcatggaaactgctttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gatgatgacgacagccacac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gggtacgtttgaagttactg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttgtattcgctgccaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggtttcgcactgttcacgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tggctgctggaagaaacgcg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttcaatggtgacatcacgca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>catgcgcaacagcgttgaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggcgttttcagtcagtatat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atacgtttcaggtcgccttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgagactccgccatcaactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gaaatcatcgcgcatagagg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caatttgcggcacggtgatt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttgacgatttctaccagagt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acctttgtcgccaatcacag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggatcagcgcgacgatacag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atattgttcagcgacagctt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtctctttaatacctgtttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctccttgtgatggtttacaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>Stellaris&reg; Sondas FISH, ensayo personalizado con Quaser Fluor&reg; Tinte rojo 670 Biosearch</td><td>Technologies Inc</td><td>SMF-1083-5</td><td></td></tr><tr><td>Secuencia de sonda para sodB mRNA: </fuerte></td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttttttctttcagactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tagccaaatggttggcaaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctgaatggtgtggcag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caccaatcaaattcacgcgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgaaaccgtcgttgtagtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgataatcaatcgcgcaggg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtggtgcacacaactgatcacg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgcgaactttacggtcatc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gctgattttcataatcggct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcatcgagggaaaactcgtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gttttcatgtgcgacaatgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cacgccacgaacgtagttag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttacgcagttgcagatgttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tccagtgaagcggaagaact</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgctgcaatacggttccgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtccagcggcagataaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgaccgttaagcgcgatttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>agcctacaaactggttttct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcggaaattagctgatccat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>aaggcatgatctttcttgcc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cagtgagcggcaatcgatca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgggcatggaaactgctttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gatgatgacgacagccacac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gggtacgtttgaagttactg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttgtattcgctgccaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggtttcgcactgttcacgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tggctgctggaagaaacgcg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttcaatggtgacatcacgca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>catgcgcaacagcgttgaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggcgttttcagtcagtatat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atacgtttcaggtcgccttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgagactccgccatcaactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gaaatcatcgcgcatagagg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caatttgcggcacggtgatt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttgacgatttctaccagagt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acctttgtcgccaatcacag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggatcagcgcgacgatacag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atattgttcagcgacagctt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtctctttaatacctgtttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctccttgtgatggtttacaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr></tbody></table>

método para el etiquetado de las transcripciones en los escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia in situ hibridación experimentos

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Se describe un método para etiquetar las transcripciones de los ARN mensajero (ARNm) en bacterias fijadas para uso en experimentos de fluorescencia de una sola molécula en situ hibridación (smFISH) en e. coli. smFISH permite la medición de la variabilidad de la célula a célula en número de copias de ARNm de genes de interés, así como la localización subcelular de las transcripciones. Los pasos principales son la fijación de la cultura de la célula bacteriana, permeabilización de las membranas celulares e hibridación de las transcripciones de destino con juegos de sondas de oligonucleótidos de marcada con fluorescencia corto disponible en el mercado. smFISH permite la proyección de imagen de los transcritos de genes múltiples en la misma celda, con las limitaciones impuestas por el solapamiento espectral entre diferentes marcadores fluorescentes. Después de completar el protocolo que se ilustra a continuación, las células pueden ser fácilmente reflejadas utilizando un microscopio juntado con una cámara adecuada para baja intensidad de la fluorescencia. Estas imágenes, junto con contornos celulares obtenidos de segmentación de los marcos de contraste de fase o de coloración de la membrana de la célula, permiten el cálculo de la distribución número de copia de ARNm de una muestra de las células utilizando el software de la abrir-fuente o medida. El método de etiquetado descrito aquí puede aplicarse también a las transcripciones de la imagen con microscopía óptica estocástica de la reconstrucción (tormenta).

Llevamos a cabo medidas de smFISH de galK y sodB transcritos en células de e. coli . Las transcripciones fueron hibridadas con un conjunto de secuencias específicas complementarias a la secuencia de destino, cada sonda ser conjugado a una molécula fluorescente solo (véase tabla de materiales). Fluorescencia y fase contraste imágenes de MG1655 tipo e. coli cepa (WT) o una JW0740 (colección de Keio)19 galK-elimina la tensión (ΔgalK) expusie...

Este manuscrito describe un método para etiquetar las transcripciones de los ARN mensajero (ARNm) con sonda de ADN marcada con fluorescencia, para el uso en experimentos de fluorescencia de una sola molécula en situ hibridación (smFISH) en e. coli. smFISH es un método de visualización que permite la detección simultánea, localización y cuantificación de moléculas individuales de ARNm en células individuales fijas.

Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

El objetivo general de este protocolo es etiquetar transcripciones individuales en E. Coli para sondas de ADN marcadas con fluorescencia para su visualización en experimentos de FiSH de una sola molécula. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de sistemas, como la caracterización de las transcripciones de la capacidad célula a célula del campo de interés. Así como las transcripciones de la localización de la pared celular.La principal ventaja de esta técnica es que proporciona cantidad de información sobre las estadísticas de los procesos transcripcionales. Para comenzar el protocolo, cultive E.Coli MG1655 en medio LB durante la noche en un agitador orbital, a 260 RPM y 37 grados Celsius. Al día siguiente, diluya el cultivo durante la noche a uno por 100 en medio fresco y mida su densidad óptica en un espectrofotómetro, hasta un valor de 0,2 a 0,4.A continuación, granule las células por centrifugación durante cinco minutos a 4.500 G a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante de todos los tubos. Agregue un mililitro de 1XPBS a cada tubo y vuelva a suspender el pellet para minimizar la agregación de célula a célula.A continuación, aña

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Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos (Video) | JoVE Journal

Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos

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