Sola célula cuantificación de las tasas de degradación de proteína por microscopia de fluorescencia Time-lapse en cultivo de células adherentes

El objetivo general de este enfoque de imágenes de fluorescencia es determinar la vida media de una proteína de interés en células vivas individuales utilizando una etiqueta SNAP. Las proteínas celulares se renuevan extensivamente, con tasas de síntesis y degradación específicas para cada proteína, y sujetas a regulación fisiológica. Sin embargo, los métodos más comúnmente utilizados para determinar la vida media de las proteínas se limitan a los promedios de la población de células de piojos o requieren el uso de inhibidores de la síntesis de proteínas.

En este vídeo, demostramos cómo se puede utilizar una etiqueta SNAP en combinación con la microscopía de lapso de tiempo de fluorescencia para medir la vida media de las proteínas en células vivas. La ventaja de este método es que logra una resolución de una sola célula y, por lo tanto, proporciona una estimación de la heterogeneidad de las vidas medias en una población de células cultivadas. El procedimiento experimental que aquí se presenta se puede aplicar a cualquier tipo de células cultivadas adherentes, que expresen una proteína de interés fusionada a una etiqueta SNAP.

Esto se puede lograr mediante el marcaje de proteínas endógenas o mediante el uso de la sobreexpresión de proteínas marcadas. La etiqueta SNAP es una versión mutante de la enzima de reparación del ADN, O6-alquilguanina-ADN alquiltransferasa que reacciona específicamente con la bencilguanina, que se puede acoplar a sondas moleculares. Por lo tanto, cualquier proteína de fusión SNAP-tag puede marcarse de forma irreversible con un colorante permeable a la célula de florescencia.

Al lavar el tinte residual, la población de proteínas marcadas decaerá exponencialmente y se puede inferir la vida media de la proteína correspondiente. En este vídeo utilizamos células madre embrionarias, que forman colonias compactas cuando se cultivan clásicamente en platos recubiertos de gelatina. Para permitirles crecer como una monocapa de células y, por lo tanto, lograr una resolución de una sola célula para los experimentos de imágenes de florescencia, las cultivamos en placas recubiertas inadheridas, lo que reduce las interacciones entre células mediadas por la adherencia inclórica celular expresada en la membrana plasmática.

Diluya el inc recombinante adherido a cinco nanogramos por microlitro en PBS, y agregue 30 microlitros de inc diluido adherido por válvula en una placa de 96 válvulas, adecuada para imágenes. Evite el uso excesivo de pipetas, ya que la adherencia de inc recombinante es muy frágil. Incubar a 37 grados durante una hora y media.

Aspire la solución adherente in, lave una vez con 100 microlitros de PBS y agregue hasta 200 microlitros de medio de cultivo ESL predesparasitado. Utilice líneas ESL que expresen una proteína de interés fusionada con la etiqueta SNAP. Lavar las células con cinco ml de PBS.

A continuación, añade dos ml de Tripson, e incuba durante cuatro minutos a 37 grados. Añadir cuatro ml de medio de cultivo ESL, volver a suspender y centrifugar a 1000 T durante cuatro minutos. Aspirar el sobrenadante, volver a suspender en medio fresco y contar las células.

Asiente 30, 000 células por centímetro cuadrado en la placa de imagen recubierta adherente incluida. Proceda con la tinción con tinte SNAP 24 horas después del asentamiento de las células. Diluir el colorante celular en el medio de cultivo ELS hasta la concentración óptima previamente determinada.

Aspire el medio con una pipeta y agregue con cuidado 50 microlitros del tinte SNAP diluido. Incubar durante 30 minutos a 37 grados. Aspirar el tinte y lavar tres veces con 200 microlitros de PBS pre-gusano.

Agregue 200 microlitros de medio de cultivo ESL e incube durante 15 minutos a 37 grados. Realice los pasos de lavado mediante una pipeta suave y no utilice un aspirador automático, ya que las células tienden a desprenderse fácilmente. Repita los mismos pasos de lavado dos veces más, luego agregue 200 microlitros de medio de imagen.

Utilice un medio libre de rojo fenol para reducir el fondo de florescencia. Utilice un microscopio que permita controlar la temperatura y el CO2. Ajuste la temperatura a 37 grados, y el CO2 al cinco por ciento antes de usarlo, y permita equilibrar durante una o dos horas.

Coloque la placa en el microscopio y seleccione el lugar adecuado para la obtención de imágenes. Las imágenes de campo claro muestran el ESL unido a un plato recubierto adherente en una monocapa. Seleccione el objetivo, un objetivo 20X es apropiado para este tamaño de ESL.

Seleccione los ajustes de iluminación para el canal de fluorescencia que se va a grabar. Ajuste la potencia y la exposición del láser para obtener una señal fuerte, ya que disminuirá en el transcurso de la película. Seleccione los parámetros de adquisición para el experimento de lapso de tiempo.

Para las proteínas con vidas medias esperadas de dos a veinte horas, elija tiempos de adquisición de 12 a 24 horas con intervalos de tiempo de 15 minutos. Inicie el experimento de imágenes. Utilice el software FIJI para el procesamiento y análisis de la película.

Recoge las imágenes adquiridas como una pila y deforrésala. Utilice la función FIJI de sustracción de fondo para eliminar el fondo de todas las imágenes de la pila. Seleccione una celda de interés, dibuje una región de interés a su alrededor con la barra de herramientas FIJI y agregue la región de interés al Administrador de ROI.

Continúe con el siguiente fotograma y repita las acciones anteriores. Siga la celda de interés durante el transcurso de la película y guarde el ROI establecido para cada celda rastreada. Haga clic en medir para obtener valores para la intensidad media y el área de los ROI.

Para estimar el fondo local, agregue una región de interés cercana a la celda de interés para cada período de tiempo. Al final, haga clic en medir para obtener los valores de la intensidad media del fondo. En primer lugar, calcule la intensidad media de la célula multiplicando el valor obtenido por la intensidad media del ROI celular por su área.

A continuación, proceda a calcular el valor de fondo integrado de la celda, multiplicando la intensidad media del ROI de fondo por el área del ROI celular. Por último, para obtener un valor corregido de fondo para la intensidad integrada de la celda, reste el valor de intensidad de fondo integrado del valor de intensidad celular integrada. Para obtener una vida media de la población celular, normalice los valores obtenidos al valor de intensidad del primer fotograma para cada celda.

Esto asegura que cada célula contribuya con el mismo peso al valor medio de la vida media, independientemente de su intensidad absoluta de florescencia. Después de las divisiones celulares, rastrea ambas células hijas por separado y suma sus intensidades integradas después de la sustracción de fondo para tener en cuenta la dilución de proteínas durante la división celular. Guarde los conjuntos de ROI para ambas celdas hijas.

Para la estimación de la vida media de la proteína, utilice la herramienta de ajuste de curvas de MATLAB. La desintegración de la proteína sigue una exponencial donde F(x) es la intensidad de la florescencia en el punto de tiempo dado, a" la intensidad inicial, y b" la tasa de descomposición. Después de obtener los valores de la tasa de descomposición b" del ajuste, la vida media se puede calcular dividiendo el logaritmo de dos por b"Esta película muestra la descomposición de la florescencia del colorante SNAP en una línea celular de fusión SNAP-tag opt four inutilizable de doxiciclina.

La señal de fluorescencia observada dependerá de la línea celular utilizada, del nivel de expresión de la proteína de interés correspondiente, así como de las propiedades del colorante utilizado. Para los experimentos de descomposición de proteínas, es importante utilizar una concentración adecuada de colorante SNAP. La concentración debe ser lo suficientemente alta como para producir una señal de florescencia brillante al comienzo del lapso de tiempo.

Sin embargo, el uso de concentraciones de tinte demasiado altas puede hacer que queden restos de tinte en el medio, incluso después del lavado. Posteriormente, el tinte libre podría unirse a las moléculas SNAP-tag recién producidas en el transcurso de la película, lo que distorsionaría la curva de descomposición. Por lo tanto, es crucial optimizar la concentración de colorante SNAP probando diferentes diluciones.

Esta figura muestra las curvas de descomposición para ocho concentraciones diferentes de un colorante SNAP de florescencia probado en una línea celular inutilizable de doxiciclina. Se eligió una concentración inicial de colorante de tres micromolares de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la obtención de imágenes de células vivas, y se realizó una dilución seriada de uno a tres hasta alcanzar una concentración de 1,4 nanomolares. Para las dos concentraciones más altas, la señal no disminuye, mientras que el decaimiento observado sigue una curva exponencial para concentraciones más bajas.

En este ejemplo, se seleccionó una concentración óptima de 12 nanomolares, ya que esta concentración asegura cantidades mínimas de tinte residual que queda en el medio después del lavado, pero la señal de florescencia sigue siendo lo suficientemente brillante como para observar una curva de descomposición clara. El protocolo descrito proporciona una estimación de la variabilidad de célula a célula y la vida media de cualquier proteína dada fusionada con SNAP-tag. Esta figura muestra las desintegraciones de una sola célula y el promedio de la población de tres líneas celulares de fusión de SNAP-tag inutilizables de doxiciclina diferentes.

Nanog y Oct4 tienen una vida bastante corta, con una vida media media de 2,9 y 4,8 horas. Mientras que Srsf11" es más longevo, con una vida media media de 25,3 horas. Los diagramas de caja muestran la distribución de las vidas medias de las tres proteínas.

Hemos demostrado que el uso de un SNAP-tag, en combinación con la microscopía de lapso de tiempo de florescencia, permite determinar la vida media de cualquier proteína de interés. Las mediciones de la desintegración de una sola célula proporcionan una estimación de la heterogeneidad de las vidas medias en una población de células, que se omite cuando se utilizan otros métodos para determinar las vidas medias de las proteínas. Uno de los pasos más cruciales cuando se utiliza una etiqueta SNAP para controlar la descomposición de las proteínas es asegurarse de que no quede ningún tinte residual sin unir en el medio o en las células después del lavado.

De lo contrario, podría unirse a las moléculas SNAP-tag recién producidas más adelante en el curso del experimento y, por lo tanto, comprometer la curva de desintegración. Esto se consigue, por un lado, realizando cuidadosamente todos los pasos de lavado descritos. Por otro lado, la concentración de colorante SNAP debe mantenerse lo más baja posible, sin dejar de estar en un rango que permita obtener una buena relación señal/ruido.

La concentración de colorante SNAP debe optimizarse para cada experimento de acuerdo con la línea celular y el tipo de tinte que se utiliza. Si bien es posible que la etiqueta SNAP pueda alterar la vida media de las proteínas candidatas en algunos casos, no vemos evidencia de tales efectos, ya que las vidas medias determinadas de la prueba de proteínas candidatas se adhieren a valores publicados muy similares. Para descartar aún más un efecto de la etiqueta SNAP en la degradación de proteínas, una opción sería bloquear la síntesis de proteínas con cicloheximida y realizar blots en diferentes puntos temporales, utilizando un anticuerpo que reconozca la proteína autóctona.

Y comparar directamente la descomposición de la proteína candidata a SNAP-tag con la versión indígena sin marcar.