Detección y eliminación de nucleasa contaminación durante la purificación de prototipo recombinante Virus Espumoso integrasa

El objetivo general de este protocolo es identificar y eliminar la actividad de nucleasas contaminantes durante la purificación de proteínas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la retrovirología, como la bioquímica, la estructura y la dinámica de la integración. La principal ventaja de esta técnica es que permite la identificación y eliminación de la actividad de nucleasas de ADN contaminantes de una proteína recombinante de interés durante su purificación.

Comience por descongelar un pellet de E.coli que expresa la integrasa del virus espumoso prototípico en hielo. Utilice un sonicador equipado con un biohorn de 0,5 pulgadas de diámetro y una punta microcónica de 0,125 pulgadas de diámetro para sonicar durante 30 segundos al 30% de amplitud con el tubo en hielo. Tras la sonicación, transfiera la muestra celular a un tubo para ultracentrífuga frío y centrifugue a 120.000 ×g durante 60 minutos a cuatro grados Celsius.

Tras la centrifugación, debería observarse un precipitado evidente, y el sobrenadante puede tener un color amarillo. Transfiera el sobrenadante a un tubo cónico frío de 50 mililitros. A continuación, prepare la columna de FPLC de 110 milímetros de largo y 5 milímetros de diámetro con una resina cargada con níquel de 1,5 mililitros.

Primero, conecte la columna al instrumento de FPLC y aplique el tampón. El instrumento debe estar recopilando datos en tiempo real de conductividad y absorbancia UV a 280 nanómetros. Las lecturas de conductividad y UV deben estabilizarse.

Si es necesario, continúe pasando tampones a través de la columna hasta que las lecturas sean estables. Mediante un superloop, cargue la muestra de proteína en la columna a un flujo de 0,15 mililitros por minuto con un límite máximo de presión de 0,5 megapascal. Conecte el superloop al FPLC AKTA.

Después de lavar la columna y eluir las proteínas, tome alícuotas de 15 microlitros del flujo inicial, del lavado y de las fracciones de absorbancia a 280 nanómetros del pico, y agregue 15 microlitros de tampón de muestra 2X para SDS-PAGE a cada muestra. Hierva las muestras durante tres minutos. Cargue 10 microlitros de cada muestra en geles de SDS-PAGE al 10%, junto con 4 microlitros de estándares de proteínas preteñidos.

Inspeccione visualmente el gel para identificar las fracciones que parecen contener integrasa de virus espumoso prototípico casi pura. Combine estas fracciones y anote el volumen mientras pipetea. Habitualmente se trata de ocho a diez mililitros.

Mediante un espectrofotómetro, mida la absorbancia UV a 280 nanómetros de las fracciones combinadas y calcule la cantidad total de la proteína integrasa del virus espumoso prototípico. Un rendimiento típico es de aproximadamente 10 miligramos por litro de cultivo inducido. Para eliminar la etiqueta de hexahistidina, suplemente la integrasa del virus espumoso prototípico con una concentración final de 10 milimolar de DTT y 0,1 milimolar de EDTA.

Luego, agregue 15 microgramos de proteasa 3C del rinovirus humano por miligramo de integrasa del virus espumoso prototípico e incube a cuatro grados Celsius durante la noche. Para realizar la fraccionamiento por cromatografía de afinidad con heparina de la integrasa del virus espumoso prototípico, reduzca la concentración de cloruro de sodio de la muestra a 200 milimolares agregando 1,5 volúmenes del tampón C. Luego, cargue la muestra diluida de integrasa del virus espumoso prototípico en la columna de heparina Sepharosa a una velocidad de flujo de 0,5 mililitros por minuto con un límite máximo de presión de un megapascal. Después de lavar la columna y recolectar el gradiente y el lavado final, analice la carga, el flujo pasante, el lavado y las fracciones mediante SDS-PAGE al 8 %.

Luego evalúe las fracciones teñiendo el gel con azul de Coomassie. La integrasa del virus espumoso prototípico y la nucleasa contaminante tienen diferentes afinidades por la cromatografía de heparina Sepharose. Identifique las fracciones de heparina Sepharose que parecen contener integrasa del virus espumoso prototípico casi pura para usar en el ensayo de nucleasa.

Para comenzar el ensayo de nucleasa, combine tres microlitros de fracción de heparina y 50 nanogramos de ADN plasmídico superenrollado de tres kilobases con tampón de reacción hasta un volumen final de 15 microlitros. Incube a 37 grados Celsius durante 90 minutos. Detenga la reacción con Proteinasa K a un miligramo por mililitro y SDS al 0,5%, e incube a 37 grados Celsius durante una hora.

Luego, agregue 3,5 µL de colorante de carga 6X a las reacciones del ensayo de nucleasa y cargue todo el volumen en un gel de agarosa al 1%. Ejecute el gel a 100 voltios a temperatura ambiente durante una hora o hasta que el frente del colorante alcance el extremo del gel. Cuando la electroforesis esté completa, una imagen del gel obtenida con un escáner fluorescente debe mostrar que el ADN lineal migra según su tamaño real de tres kb, el ADN superenrollado migra más rápido, alrededor de dos kb, y el ADN en forma de círculo relajado migra más lentamente, cerca de 3,5 kb.

Mediante el uso de software de análisis de imágenes, calcule el volumen en píxeles del ADN plasmídico en forma superenrollada, lineal y circular relajada en cada carril. Denomine la suma de los volúmenes en píxeles de estas tres formas de ADN como el valor total de ADN, y utilícelo para calcular el porcentaje de formas lineales y circulares relajadas. Las fracciones que contienen nucleasas contaminantes muestran un porcentaje mayor de formas lineales y circulares relajadas en comparación con el control negativo.

Combine las fracciones de heparina Sepharosa que no muestren actividad de nucleasa contaminante y transfiéralas a un tubo de diálisis de corte de peso molecular de 10 milímetros, entre seis y ocho kilodaltons. Realice la diálisis a cuatro grados Celsius durante la noche frente a un litro de solución de diálisis. Al día siguiente, recupere la muestra de integrasa del virus espumoso prototípico libre de nucleasas del tubo de diálisis.

Mida la absorbancia a 280 nanómetros y calcule la concentración final de proteína. Aliquote la proteína y congele rápidamente en nitrógeno líquido. Luego, almacene los alícuotas a menos 80 grados Celsius.

El ensayo de nucleasa se realizó según se describe en este video. Los controles negativos incluyen ADN plasmídico sin proteína y una purificación previa de la integrasa del virus espumoso prototípico de tipo silvestre, que se sabe que está libre de nuclease. Un control positivo para la actividad de nuclease contaminante es una purificación previa de la integrasa del virus espumoso prototípico catalíticamente inactiva que se sabe que tiene nuclease contaminante.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ensayos bioquímicos o imágenes de molécula individual, con el fin de responder preguntas adicionales, como la cinética y la dinámica enzimática. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar y eliminar la actividad de nucleasas contaminantes de una proteína recombinante.