Name: Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 para analizar la formación y la reparación de roturas de doble cadena de DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Aprende microscopía de inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 para analizar roturas de doble cadena de DNA. Este método permite visualizar daños genéticos y estudiar la inestabilidad genómica en células tumorales.

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El proyecto fue apoyado por la Fundación alemana José Carreras de leucemia (14 DJCLS R/2017).

todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el II Comité de ética de la Mannheim facultad médica de la Universidad de Heidelberg. Escrito el consentimiento informado fue obtenido de todos los individuos.
 1. preparación de materiales <ol><li>solución anticoagulante: Prepare una solución anticoagulante de 200 U.I. heparina / mL en cloruro de sodio 0.9%. Llenar cada uno de los tubos de colección (dibujar volumen 9 mL) con 2 mL de la solución anticoagulante antes de retiro de las muestras de sangre o médula ósea.</li>
	<li>Solución de lisis de glóbulos rojos: preparar el 10 x solución de lisis de eritrocitos con 82,91 g de cloruro de amonio, bicarbonato de amonio 7,91 g y 2 mL de 0,5 M solución de ácido etilendiaminotetraacético a un pH de 8.0 mediante la disolución de los agentes en doble y agua destilada para un volumen total de 1 L.</li>
	<li>Solución de fijación: 8.3 Añadir μl de una solución de hidróxido de potasio de 1 M a paraformaldehido (PFA) de la 360 mg en un tubo de microtitulación. Llenar el tubo con tampón fosfato salino (PBS) hasta la marca de 1 mL del tubo y el tubo en un bloque calefactor a 95 ° C para obtener 1 mL de una solución PFA 36% del calor. Transferir la solución PFA de 36% 1 mL a un tubo con una capacidad de 15 mL. Añadir 8 mL de PBS a la solución 1 mL para el PFA de 36%, a 9 mL de una solución madre de PFA 4%. Alícuota de la solución madre de PFA 4% y almacenar a-18 ° C hasta que utilizan para la fijación de las células. 
	PRECAUCIÓN: 1) Potasio hidróxido en solución es corrosivo. Ser conscientes de la protección cutánea y ocular. 2) PFA es carcinogénico. Evite el contacto con la piel y la inhalación. Preparar la solución de fijación bajo una campana de.</li>
	<li>Solución de permeabilización: añadir 50 μl Octoxinol 9 a 50 mL PBS para obtener una solución de aproximadamente 0.1% Octoxinol 9.</li>
	<li>Bloqueo de solución: Prepare 5% y 2% bloqueo soluciones mezclando el agente bloqueador de proteínas con PBS y tienda en 6 &#8211; 8 º C.</li>
</ol> 2. Preparación de las muestras <ol><li>fibroblastos en cultivo celular: cultivar fibroblastos humanos de la línea celular NHDF en humidificado 5% CO 2 ambiente a 37 ° C en Medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal de ternera, 4 mM glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina.
	<ol><li>Preparación de portaobjetos de un microscopio con adherente fibroblastos <ol><li>Retire el medio del frasco (área de crecimiento 75 cm 2) con el exponencial crecimiento fibroblastos NHDF. Añadir 10 mL de PBS en el matraz. Lavar los fibroblastos adherentes suavemente agitando manualmente el matraz durante 1 minuto</li>
			<li>Quitar el PBS y añadir tripsina 1 mL en el matraz. Agite el frasco suavemente para asegurarse de que todas las células adherentes son cubiertas por la tripsina. Retire el matraz a la tripsina. Poner el matraz en la incubadora durante 5 min a 37 ° C.</li>
			<li>Tomar el frasco de la incubadora y añada 10 mL de RPMI 1640 medio en el matraz. Pipeta el medio arriba y abajo varias veces para dispersar a los fibroblastos.</li>
			<li>Pipeta 0,3 mL de los fibroblastos dispersos en cada uno de los dos campos del portaobjetos y colocar la corredera en la incubadora durante 24 h para que los fibroblastos se adhieren a la diapositiva. Para la inmunotinción de γH2AX y 53BP1 en los núcleos de los fibroblastos, pasar al paso 3.1.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Las muestras de pacientes <ol><li>las muestras de sangre: utilizar los tubos de colección que se rellenaron con 2 mL de la solución anticoagulante y añadir 7 mL de sangre en los tubos. Almacenar las muestras durante la noche a temperatura ambiente (es decir, 18-20 ° C). Al día siguiente, aislar la fase G0/G1 de reposo las células mononucleares mediante centrifugación de gradiente de densidad (paso 2.2.3).</li>
		<li>Las muestras de médula ósea: utilizar los tubos de colección que se rellenaron con 2 mL de la solución anticoagulante (paso 1.1) y añadir 7 mL médula en los tubos. Almacenar las muestras durante la noche a temperatura ambiente (es decir, 18-20 ° C). Al día siguiente, aislar la fase G0/G1 de reposo las células mononucleares mediante centrifugación de gradiente de densidad (paso 2.2.3). Utilizar microesferas de CD34 y células columnas de separación para el aislamiento de células CD34 +.</li>
		<li>Aislamiento de células mononucleares mediante centrifugación de gradiente de densidad 
		Nota: Las células mononucleares son aisladas de muestras de médula ósea y sangre por centrifugación del gradiente de densidad 17 , 18 , 19.
		<ol><li>Diluir la muestra de sangre heparinizada en una proporción de 1:1 con PBS y la muestra de médula ósea heparinizada en una proporción de 1:3 con PBS. Suspender las células suavemente por dibujarlos dentro y fuera de la pipeta dos veces.</li>
			<li>Añadir un volumen de densidad gradiente medio a un tubo nuevo. Suavemente la capa diluida sangre o médula ósea en la parte superior del medio de gradiente de densidad. Tenga cuidado de no para mezclar las dos capas.</li>
			<li>Centrifugar el tubo durante 30 min a temperatura ambiente y x 400 g. extraer la capa superior de plasma con la pipeta. Luego cosechar cuidadosamente las células mononucleares en la capa por encima de la media de gradiente de densidad. Transferencia de las células mononucleares en un tubo fresco.</li>
			<li>Agregar por lo menos tres volúmenes de PBS a las células mononucleares en el tubo. Suspender las células suavemente por dibujarlos dentro y fuera de la pipeta dos veces. Centrifugar el tubo durante 10 min a temperatura ambiente y 400 g. x</li>
			<li>Después de la vuelta, quite el sobrenadante y añadir 10 mL de 4 ° C, 1 x solución de lisis de glóbulos rojos. Resuspender suavemente las células por dibujarlos dentro y fuera de la pipeta dos veces y coloque el tubo en hielo durante 5 minutos. Añada 30 mL de PBS a 4 ° C y centrifugar el tubo durante 10 min a temperatura ambiente y 400 g. x</li>
		</ol></li> <li>Preparación de los cytospins <ol><li>preparar dos cytospins con células mononucleares de las muestras del paciente (es decir, un cytospin para la tinción de inmunofluorescencia γH2AX y uno cytospin para γH2AX y 53BP1 combinado de tinción de inmunofluorescencia) por centrifugación (300 x g, 10 min) de 1.0 x 10 5 células para cada preparación ( figura 3 y 4).</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. γH2AX y 53BP1 tinción de inmunofluorescencia <ol><li>fijación y permeabilización: fijar las células con 200 μL de 4% PFA durante 10 minutos. Después de la fijación, lave las células suavemente tres veces con 30 mL de PBS durante 5 minutos en un agitador de laboratorio. Luego permeabilizar las células con 200 μL de 0,1% Octoxinol 9 durante 10 minutos lavar las células suavemente tres veces con 30 mL de solución de bloqueo de 5% por 5 min en un agitador de laboratorio. Bloquear las células en 30 mL de dulce 5% bloquea la solución 1 h.</li>
	<li>Incubación con los anticuerpos <ol><li>incubar una preparación de las células con un anticuerpo monoclonal anti-γH2AX de ratón (1: 500) y la otra preparación de las células con un anticuerpo monoclonal anti-γH2AX de ratón (1: 500) y un policlonales anti-53BP1 anticuerpos (1: 500) durante la noche a 4 ° C.</li>
		<li>Después de incubación lavado las células suavemente 3 veces con 30 mL de solución de bloqueo del 2% por cada 5 min en un agitador laboratorio.</li>
		<li>Quitar la solución de bloqueo e incubar la primera preparación de las células con un anticuerpo secundario de cabra Alexa488 conjugado anti-ratón (1: 500) y la segunda preparación de las células con una cabra Alexa488 conjugado anticuerpo secundario anti ratón ( 1: 500) y un burro Alexa555 conjugado anti-conejo de anticuerpo secundario (1: 500) por 1 h a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Medio de montaje: poner la diapositiva con las células en un bol y lavar las células suavemente tres veces con 30 mL de PBS por cada 5 min en un agitador de laboratorio. Retirar el PBS y Monte las células con medio de montaje que contiene 4, 6-diamidino-2-phenylindole. Poner cuidadosamente un cubreobjetos sobre el medio de montaje para que burbujas de aire no son incrustado. Esperar al menos 3 h para endurecer el de medio de montaje antes de analizar las células por microscopía de fluorescencia.</li>
</ol> 4. Análisis de γH2AX y 53BP1 focos <ol><li>microscopía de fluorescencia: analizar los focos γH2AX y 53BP1 en los núcleos de la célula con un microscopio de epifluorescencia equipado con los filtros DAPI, Alexa 488 y Cy3 durante proyección de imagen en un objetivo de X 100 Ampliación. Grabar imágenes con una cámara y procesar las imágenes con software de imagen apropiado.</li>
</ol>

<ol><li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+maintenance+mechanisms+for+preventing+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.</a> Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).</li>
<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , 
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<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).</li>
<li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).</li>
<li>Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+NHEJ-derived+reciprocal+chromosomal+translocations+does+not+require+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70.</a> Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Scully, R., Xie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+strand+break+repair+functions+of+histone+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Double strand break repair functions of histone H2AX.</a> Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).</li>
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<li>Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX+in+cancer+cells%3A+a+potential+biomarker+for+cancer+diagnostics%2C+prediction+and+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence.</a> Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).</li>
<li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK2V617F+promotes+replication+fork+stalling+with+disease-restricted+impairment+of+the+intra-S+checkpoint+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+DNA+damage+and+alteration+of+the+DNA+damage+response+in+myelodysplastic+syndromes+and+acute+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Res%22%5BJournal%5D)">Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias.</a> Leuk Res. 57, 112-118 (2017).</li>
<li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+repair%3A+53BP1+comes+into+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).</li>
<li>Escribano-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+cycle-dependent+regulatory+circuit+composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+controls+DNA+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.</a> Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+White+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Separation of White Blood Cells.</a> Nature. 204, 793-794 (1964).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Invest+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol+Open%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li>
<li>Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+multi-detector+row+CT%3A+a+quantitative+biomarker+of+low-level+radiation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure.</a> Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).</li>
<li>Lobrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks+after+computed+tomography+examinations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Lobrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+lack+of+DNA+double-strand+break+repair+in+human+cells+exposed+to+very+low+x-ray+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 es un método útil para el análisis de la formación y reparación de DSB en un amplio espectro de áreas de investigación. Los parámetros críticos que influyen en el resultado de los experimentos son la fase del ciclo celular, los agentes utilizados para la fijación y permeabilización de las células, la elección de los anticuerpos y el hardware y el software del microscopio de fluorescencia.
La influencia del ciclo celular en patrones de foco...

DNA se daña continuamente por endógeno (p. ej., estrés de replicación, especies reactivas de oxígeno, la inestabilidad intrínseca del ADN) y exógenos (por ejemplo, los radicales químicos, irradiación) fuentes (figura 1)1,2 ,3,4. Entre los daños en el ADN, roturas de DNA doble cadena (DSB) son particularmente graves lesiones y pueden inducir la muerte celular o carcinogénesis. Cerca de 50 OSD puede surgir por célula y ciclo celular5. En células de mamífero, recombinación homóloga (HR) y nonhomologous end-joining (NHEJ) desarrollados como principales vías para la reparación de DSB (figura 2). HR se produce en la fase de finales S/G2 y utiliza una hermana intacta cromátide como plantilla para la reparación potencialmente libre de errores. En comparación, el NHEJ es activa durante todo el ciclo de la célula y potencialmente mutagénicos como pares de bases puede ser añadidos o resecados antes de la ligadura de los extremos rotos. Además, unirse a final alternativo se podrá contratarse como un mecanismo de lenta reparación mutagénica de respaldo en caso de deficiencia NHEJ6,7.
DSB inducen la fosforilación de la histona H2AX en 139 de serina en una región de varios megabase pares alrededor de cada OSD. Los focos nucleares formando se denominan focos de γH2AX y son detectables por inmunofluorescencia microscopia8. ΓH2AX promueve el reclutamiento de proteínas más sensible al OSD y participa en la remodelación de la cromatina, la reparación del ADN y de transducción de señal9. Como cada enfoque γH2AX se considera representar un OSD único, la cuantificación del OSD por microscopia de la inmunofluorescencia es posible, que se ha demostrado en líneas celulares de cáncer y muestras de los pacientes10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (proteína 1 de Unión p53) es otra proteína clave en la mediación reparación DSB. Está implicado en el reclutamiento de DSB-responsivo proteínas, puesto de control las señales y la sinapsis de OSD extremos15. Además, 53BP1 desempeña un papel fundamental en la elección de vía de reparación DSB. Activa la reparación de DSB hacia NHEJ mientras que HR es prevenido16. Teniendo en cuenta las funciones originales de γH2AX y 53BP1 en reparación DSB, el análisis simultáneo de γH2AX y 53BP1 por microscopia de la inmunofluorescencia puede ser un método útil para el análisis exacto de la formación y reparación de DSB.
Este manuscrito proporciona un protocolo paso a paso para realizar microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 en núcleos celulares. Específicamente, la técnica se aplica en fibroblastos normales de la línea celular NHDF, en linfocitos de rayos x irradiada de un individuo sano y en las células CD34 + de un paciente con leucemia mieloide aguda. Los detalles del método se señalan en el contexto de los resultados presentados.

<table><tbody><tr><td>Medio RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td>Medio para cultivo celular</td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>ratiopharm</td><td>PZN 3029843</td><td>&nbsp; Heparina 5.000 U.I. / mL</td></tr><tr><td>Solución de cloruro de sodio 0,9%</td><td>B. Braun</td><td>PZN 1957154</td><td>Componente de la solución madre anticoagulante</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>Medio para el aislamiento de células mononucleares</td></tr><tr><td>Solución de tripsina 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59427C</td><td>Enzima para la disociación de fibroblastos en cultivo celular</td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-702</td><td>Aislamiento de células progenitoras mieloides CD34+</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de diagnóstico</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER-203B-CE24</td><td>Portaobjetos de microscopio</td></tr><tr><td>Megafuge 1.0 R</td><td>Heraeus</td><td>75003060</td><td>&nbsp; Centrífuga de sobremesa&nbsp;</td></tr><tr>Dispositivo <td></td><td></td><td></td><td>Cytospin</td></tr><tr><td>Tapa</td><td>Heraeus</td><td>76003422</td><td>Tapa para trabajar sin microtubos</td></tr><tr><td>Contenedor Cyto</td><td>Heraeus 75003416</td><td></td><td>Contenedor Cyto con 2 orificios cónicos</td></tr><tr><td>Portaclips</td><td>Heraeus</td><td></td><td>75003414 Portador para sujetar un contenedor de citocitos y una corredera</td></tr><tr><td>Inserto de soporte</td><td>Heraeus</td><td>75003417</td><td>Inserto de soporte para sujetando un soporte</td></tr><tr><td>de clip Triton X-100 (Octoxinol 9)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85112</td><td>Detergente para la permeabilización de membranas celulares</td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de potasio 1M</td><td>Merck Millipore</td><td>109107</td><td>Necesario para preparar la solución de paraformaldehído</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Agente de fijación</td></tr><tr><td>Salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Solución salina equilibrada</td></tr><tr><td>Chemiblocker</td><td>Merck Millipore</td><td>2170</td><td>Agente bloqueante</td></tr><tr><td>Monoclonal de ratón anti-& gamma; Anticuerpo H2AX (JBW301)</td><td>Merck Millipore</td><td>05-636</td><td>Anticuerpo primario para la detección de &gamma; H2AX</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal anti-53BP1 de conejo (NB100-304)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-304</td><td>Anticuerpo primario para la detección de 53BP1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugado anti-ratón de cabra anti-ratón</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-conjugado anti-conejo anticuerpo</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Vectashield medio de montaje</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Contiene DAPI para la tinción de ADN</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>490035 Microscopio de fluorescencia</td></tr><tr><td>Cool Cube 1 Cámara CCD</td><td>Metasystems</td><td>H-0310-010-MS</td><td>Sistema de cámara para grabación digital</td></tr><tr><td>Software Isis</td><td>Metasystems</td><td>Software de</td><td>microscopio</td> No aplicable</tr></tbody></table>

microscopia de la inmunofluorescencia de γh2ax y 53bp1 para analizar la formación y la reparación de roturas de doble cadena de dna

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Roturas de DNA doble cadena (DSB) son graves lesiones de ADN. Análisis de la formación y reparación de DSB es relevante en un amplio espectro de áreas de investigación incluyendo la integridad del genoma, genotoxicidad, Radiobiología, envejecimiento, cáncer y desarrollo de medicamentos. En respuesta a OSD, la histona H2AX es fosforilada en serina 139 en una región de varios pares de megabase formando discretos focos nucleares detectables por microscopia de la inmunofluorescencia. Además, 53BP1 (proteína 1 de Unión p53) es otra proteína sensible al OSD importante promover la reparación de DSB por nonhomologous end-joining evitando la recombinación homóloga. Según las funciones específicas de γH2AX y 53BP1, el análisis combinado de γH2AX y 53BP1 por microscopia de la inmunofluorescencia puede ser un enfoque razonable para un análisis detallado del OSD. Este manuscrito ofrece un protocolo paso a paso con notas metódicas para la realización de la técnica. Específicamente, se demuestra la influencia del ciclo celular en patrones de focos γH2AX en fibroblastos normales de la línea celular NHDF. Además, el valor de los focos de γH2AX como un biomarcador es representado en los linfocitos de rayos x irradiada de un individuo sano. Finalmente, se investiga inestabilidad genética en las células CD34 + de un paciente con leucemia mieloide aguda por microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1.

Análisis de los focos de γH2AX en las células es más precisa en la fase G0/G1 y el G2 fase cuando γH2AX focos aparecen como puntos fluorescentes distintas (figura 5A). En contraste, análisis de focos de γH2AX en las células durante la fase S se complica con puntos dispersos γH2AX pan-nuclear causados por el proceso de replicación (figura 5B).
Fijación de las células fue...

Este manuscrito ofrece un protocolo para el análisis de roturas de doble cadena de DNA por microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1.

Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 para analizar la formación y la reparación de roturas de doble cadena de DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

El objetivo general de la microscopía de inmunofluorescencia gamma-H2AX y 53BP1 es analizar la formación y reparación de roturas de doble cadena de ADN en varios tejidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación del cáncer, como cómo surge la inestabilidad genética en las células tumorales. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden visualizar las roturas de doble cadena de ADN y que se pueden analizar los procesos de reparación.La demostración del procedimiento correrá a cargo de Susanne Brendel, técnica de nuestro laboratorio. Comience el experimento preparando soluciones, comenzando con la solución madre anticoagulante con 200 unidades internacionales de heparina por mililitro en cloruro de sodio al 0,9 por ciento. Llene cada uno de los tubos de recolección con dos mililitros de solución madre anticoagulante antes de extraer las muestras de sangre o médula ósea.A continuación, prepare la solución de lisis 10X para glóbulos rojos con 82,91 gramos de cloruro de amonio, 7,91 gramos de bicarbonato de amonio y dos mililitros de solución de ácido etilendiamenetrazado 0,5 molar a un pH de 8,0 disolviendo los agentes en agua bidestilada para un volumen total de un litro. Luego, prepare la solución de fijación agregando 8.3 microlitros de una solución de hidróxido de potasio de un molar a 360 miligramos de paraformaldehído, o PFA, en un tubo de microtitulación. Llene el tubo con solución salina tamponada con fosfato, o PBS, hasta la marca de un mililitro del tubo y caliente el tubo en un bloque calefactor a 95 grados Celsius para obtener un mililitro de una solución de PFA al 36 por ciento.Transfiera un mililitro de solución de PFA al 36 por ciento a un tubo de 15 mililitros. Y agregue ocho mililitros de PBS para obtener una solución madre de PFA al cuatro por ciento de nueve mililitros. Alicuente la solución madre de PFA al cuatro por ciento y guárdela a menos 18 grados centígrados hasta su uso para la fijación celular.A continuación, prepare la solución de permeabilización añadiendo 50 microlitros de Octoxinol 9 a 50 mililitros de PBS para obtener una solución de aproximadamente 0,1 por ciento de Octoxinol 9. Finalmente, prepare soluciones bloqueadoras al cinco por ciento y al dos por ciento mezclando el agente bloqueante de proteínas con PBS. Para preparar las muestras de sangre o médula ósea, extraiga los tubos llenos de dos mililitros de la solución madre anticoagulante.Extraer siete mililitros de sangre o médula ósea por tubo en condiciones estériles mediante venopunción o punción de médula ósea respectivamente. Guarde las muestras durante la noche a temperatura ambiente. Después del almacenamiento durante la noche, diluya la muestra de sangre heparinizada uno a uno con PBS y la muestra de médula ósea heparinizada en una proporción de uno a tres con PBS.Suspenda las células suavemente tirando de ellas hacia adentro y hacia afuera de la pipeta dos veces. A continuación, agregue un volumen de medio de gradiente de densidad a un tubo nuevo. Coloque suavemente la sangre o la médula ósea diluida sobre el medio de gradiente de densidad y tenga cuidado de no mezclar las dos capas.Centrifugar el tubo durante 30 minutos a temperatura ambiente y 400 G. Extraiga la capa superior de plasma con una pipeta. Luego, coseche cuidadosamente las células mononucleares en la capa por encima del medio de gradiente de densidad. Transfiera las células mononucleares a un tubo nuevo y agregue al menos tres volúmenes de PBS.Suspenda las células suavemente tirando de ellas hacia adentro y hacia afuera de la pipeta dos veces. Centrifuga el tubo. Después de girar, retire el sobrenadante.Agregue 10 mililitros de cuatro grados Celsius 1x solución de lisis para glóbulos rojos. Vuelva a suspender las células suavemente introduciéndolas y extrayéndolas de la pipeta dos veces y coloque el tubo en hielo durante cinco minutos. A continuación, añade 30 mililitros de PBS a cuatro grados centígrados y centrifuga el tubo.Utilice microesferas de CD34 y columnas de separación celular para el aislamiento de células CD34 positivas. Preparar dos citoespines con células mononucleares de las muestras del paciente por centrifugación de una multiplicada por 10 las cinco células para cada preparación. Fije las celdas con 200 microlitros de PFA al cuatro por ciento durante 10 minutos.Después de la fijación, lave las células suavemente tres veces con 30 mililitros de PBS durante cinco minutos cada una en una coctelera. A continuación, permeable las células con 200 microlitros de Octoxynol 9 al 0,1 por ciento durante 10 minutos. Lave las células suavemente tres veces con 30 mililitros de solución bloqueadora al cinco por ciento durante cinco minutos cada una en una agitadora de laboratorio.Bloquee las células en 30 mililitros de solución bloqueante fresca al cinco por ciento durante una hora. La fijación y permeabilización de las células con un cuatro por ciento de paraformaldehído en Octoxynol 9 al 0,1 por ciento preserva claramente los focos gamma-H2AX y 53BP1. Incubar una preparación de las células con un anticuerpo monoclonal anti-gamma-H2AX de ratón y la otra preparación de las células con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-gamma-H2AX y un anticuerpo policlonal de conejo anti-53BP1 durante la noche a cuatro grados centígrados.Se recomienda encarecidamente el uso de anticuerpos anti-gamma-H2AX y anti-53BP1 de eficacia probada. Después de la incubación, lave las células suavemente tres veces con 30 mililitros de solución bloqueadora al dos por ciento por cada cinco minutos en un agitador de laboratorio. A continuación, incube la primera preparación de las células con un anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado Alexa 488 diluido uno en 500 en una solución de bloqueo al dos por ciento.Incubar la segunda preparación de las células con un anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado Alexa 488 y un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado de burro Alexa 555 diluido uno en 500 en una solución de bloqueo al dos por ciento. Lave las células suavemente tres veces con 30 mililitros de PBS en un agitador de laboratorio. Retire el PBS y monte las celdas con medio de montaje.Coloque con cuidado un cubreobjetos en la parte superior del medio de montaje para que no queden burbujas de aire. Espere al menos tres horas para que el medio de montaje se endurezca antes de analizar las células mediante microscopía de fluorescencia. Finalmente, analice los focos gamma-H2AX y 53BP1 en los núcleos celulares con un microscopio de fluorescencia equipado con filtros para DAPI, Alexa 488 y Cy3 durante la obtención de imágenes con un aumento de objeto de 100x.El análisis de los focos gamma-H2AX en las células es más preciso en la fase G0, G1 y G2, cuando los focos gamma-H2AX aparecen como puntos fluorescentes distintos, como se muestra en esta imagen representativa de fibroblastos. Por el contrario, el análisis de los focos de gamma-H2AX en las células durante la fase S se complica por las manchas dispersas de gamma-H2AX pannucleares causadas por el proceso de replicación. La tinción con inmunofluorescencia de gamma-H2AX se utilizó para la cuantificación de roturas de doble cadena de ADN en tejidos irradiados y se demostró que los niveles de focos de gamma-H2AX en los linfocitos irradiados son proporcionales a la dosis de irradiación.La colocalización de los focos gamma-H2AX y 53BP1 en células CD34 positivas de un paciente con leucemia mieloide aguda indica la promoción de mecanismos de reparación de unión de extremos no homólogos mediados por 53BP1 en los sitios de roturas de doble cadena de ADN. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la microscopía de inmunofluorescencia gamma-H2AX y 53BP1 para el análisis de roturas de doble cadena de ADN. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunotransferencia de ATM, ATR, quinasa de punto de control uno, quinasa de punto de control dos y TP53 en células tumorales para analizar las alteraciones de la respuesta al daño del ADN.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

La cuantificación de ADN de doble filamento con la formación de estrías γH2AX como un marcador molecular se ha convertido en una herramienta indispensable en la biología de la radiación. Aquí se demuestra el uso de un ensayo de inmunofluorescencia para la cuantificación de γH2AX focos después de la exposición de las células a la radiación.

La cuantificación de γH2AX focos en respuesta a la radiación ionizante

La cuantificación de ADN de doble filamento se rompe sobre la base de γH2AX focos se ha convertido en una herramienta de valor incalculable, sobre todo en biología de la radiación, para la evaluación de la radiosensibilidad del tejido y los efectos de los compuestos de la radiación modificar. Aquí se demuestra el uso de un ensayo de inmunofluorescencia para la cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido.

La cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido

El análisis microscópico de γH2AX focos, que forman después de la fosforilación de H2AX en la Ser-139 en respuesta a ADN de doble filamento se rompe, se ha convertido en una herramienta indispensable en la biología de la radiación. Aquí hemos utilizado un anticuerpo mono-metílico de la histona H3 lisina 4 como marcador epigenético de la eucromatina activa la transcripción, para evaluar la distribución espacial de la radiación inducida por la formación de γH2AX dentro del núcleo.

Evaluación de la distribución espacial de la radiación ionizante γH2AX siguientes

En este video, describimos el método de inmunofluorescencia para visualizar la localización de las proteínas de reparación del ADN γH2AX y 53BP1 en los sitios de roturas de ADN de doble cadena en núcleos celulares irradiados.

Visualización basada en inmunofluorescencia de las interacciones de las proteínas de reparación del ADN

En este video, describimos la técnica de microscopía de inmunofluorescencia para detectar proteínas específicas de respuesta al daño del ADN localizadas en los sitios de roturas de doble cadena del ADN en células mononucleares humanas. Las proteínas son reconocidas por anticuerpos primarios específicos, que a su vez se unen a anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos que emiten fluorescencia durante la visualización microscópica, lo que permite la visualización de las proteínas como...

Microscopía de inmunofluorescencia para el análisis de roturas de doble cadena de ADN

Estudiar la cinética de reparación de daños de ADN requiere un sistema para inducir lesiones en regiones definidas del nucleares. Se describe un método para crear localizados roturas de doble cadena utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un 405 nm láser y procedimientos automatizados para cuantificar la dinámica de los factores de reparación de estas lesiones.

Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación

Reparación de roturas del DNA de doble cadena es un proceso dinámico, que requiere no sólo la formación de complejos de reparación en los descansos, pero también su resolución después de la lesión se trata. Aquí, utilizamos microscopia de la inmunofluorescencia para roturas de doble hebra transitorias y duradera como una herramienta para diseccionar este mecanismo de mantenimiento del genoma.

Caracterización de procesos de reparación del ADN en transitoria y duradera doble cadena DNA roturas por microscopia de la inmunofluorescencia

No se ha establecido completamente la respuesta de daño del ADN inducida por radiación activada por el haz mixto de neutrones utilizado en la terapia de captura de neutrones de boro (BNCT). Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para detectar focos inducidos por radiación (RIF) de proteínas de reparación mediante tinción de inmunofluorescencia en líneas celulares de cáncer de colon humano después de la irradiación con el haz mezclado con neutrones.

Imágenes de inmunofluorescencia de daños en el ADN y dosis de focos en células de cáncer de colon humano

Después del daño del ADN, las células humanas activan vías de reparación esenciales para restaurar la integridad de su genoma. Aquí, describimos el método de inmunofluorescencia indirecta como un medio para detectar proteínas de reparación del ADN, analizar su reclutamiento espacial y temporal, y ayudar a interrogar la interacción proteína-proteína en los sitios de daño del ADN.

Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia

Este protocolo presenta un método para evaluar la formación y reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante la detección simultánea de focos γH2AX y 53BP1 en núcleos interfase de linfocitos periféricos humanos tratados con bleomicina.

Inmunofluorescencia dual de γH2AX y 53BP1 en linfocitos periféricos humanos

Aquí, presentamos un protocolo simple y rápido para la detección de la interacción de proteínas en sitios de daño en el ADN.

Ensayo de ligando de proximidad para localizar proteínas en sitios de daño en el ADN

Aprende microscopía de inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 para analizar roturas de doble cadena de DNA. Este método permite visualizar daños genéticos y estudiar la inestabilidad genómica en células tumorales.

Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 para analizar la formación y la reparación de roturas de doble cadena de DNA (Video) | JoVE Journal

Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 para analizar la formación y la reparación de roturas de doble cadena de DNA

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