Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 para analizar la formación y la reparación de roturas de doble cadena de DNA

El objetivo general de la microscopía de inmunofluorescencia gamma-H2AX y 53BP1 es analizar la formación y reparación de roturas de doble cadena de ADN en varios tejidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación del cáncer, como cómo surge la inestabilidad genética en las células tumorales. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden visualizar las roturas de doble cadena de ADN y que se pueden analizar los procesos de reparación.

La demostración del procedimiento correrá a cargo de Susanne Brendel, técnica de nuestro laboratorio. Comience el experimento preparando soluciones, comenzando con la solución madre anticoagulante con 200 unidades internacionales de heparina por mililitro en cloruro de sodio al 0,9 por ciento. Llene cada uno de los tubos de recolección con dos mililitros de solución madre anticoagulante antes de extraer las muestras de sangre o médula ósea.

A continuación, prepare la solución de lisis 10X para glóbulos rojos con 82,91 gramos de cloruro de amonio, 7,91 gramos de bicarbonato de amonio y dos mililitros de solución de ácido etilendiamenetrazado 0,5 molar a un pH de 8,0 disolviendo los agentes en agua bidestilada para un volumen total de un litro. Luego, prepare la solución de fijación agregando 8.3 microlitros de una solución de hidróxido de potasio de un molar a 360 miligramos de paraformaldehído, o PFA, en un tubo de microtitulación. Llene el tubo con solución salina tamponada con fosfato, o PBS, hasta la marca de un mililitro del tubo y caliente el tubo en un bloque calefactor a 95 grados Celsius para obtener un mililitro de una solución de PFA al 36 por ciento.

Transfiera un mililitro de solución de PFA al 36 por ciento a un tubo de 15 mililitros. Y agregue ocho mililitros de PBS para obtener una solución madre de PFA al cuatro por ciento de nueve mililitros. Alicuente la solución madre de PFA al cuatro por ciento y guárdela a menos 18 grados centígrados hasta su uso para la fijación celular.

A continuación, prepare la solución de permeabilización añadiendo 50 microlitros de Octoxinol 9 a 50 mililitros de PBS para obtener una solución de aproximadamente 0,1 por ciento de Octoxinol 9. Finalmente, prepare soluciones bloqueadoras al cinco por ciento y al dos por ciento mezclando el agente bloqueante de proteínas con PBS. Para preparar las muestras de sangre o médula ósea, extraiga los tubos llenos de dos mililitros de la solución madre anticoagulante.

Extraer siete mililitros de sangre o médula ósea por tubo en condiciones estériles mediante venopunción o punción de médula ósea respectivamente. Guarde las muestras durante la noche a temperatura ambiente. Después del almacenamiento durante la noche, diluya la muestra de sangre heparinizada uno a uno con PBS y la muestra de médula ósea heparinizada en una proporción de uno a tres con PBS.

Suspenda las células suavemente tirando de ellas hacia adentro y hacia afuera de la pipeta dos veces. A continuación, agregue un volumen de medio de gradiente de densidad a un tubo nuevo. Coloque suavemente la sangre o la médula ósea diluida sobre el medio de gradiente de densidad y tenga cuidado de no mezclar las dos capas.

Centrifugar el tubo durante 30 minutos a temperatura ambiente y 400 G. Extraiga la capa superior de plasma con una pipeta. Luego, coseche cuidadosamente las células mononucleares en la capa por encima del medio de gradiente de densidad. Transfiera las células mononucleares a un tubo nuevo y agregue al menos tres volúmenes de PBS.

Suspenda las células suavemente tirando de ellas hacia adentro y hacia afuera de la pipeta dos veces. Centrifuga el tubo. Después de girar, retire el sobrenadante.

Agregue 10 mililitros de cuatro grados Celsius 1x solución de lisis para glóbulos rojos. Vuelva a suspender las células suavemente introduciéndolas y extrayéndolas de la pipeta dos veces y coloque el tubo en hielo durante cinco minutos. A continuación, añade 30 mililitros de PBS a cuatro grados centígrados y centrifuga el tubo.

Utilice microesferas de CD34 y columnas de separación celular para el aislamiento de células CD34 positivas. Preparar dos citoespines con células mononucleares de las muestras del paciente por centrifugación de una multiplicada por 10 las cinco células para cada preparación. Fije las celdas con 200 microlitros de PFA al cuatro por ciento durante 10 minutos.

Después de la fijación, lave las células suavemente tres veces con 30 mililitros de PBS durante cinco minutos cada una en una coctelera. A continuación, permeable las células con 200 microlitros de Octoxynol 9 al 0,1 por ciento durante 10 minutos. Lave las células suavemente tres veces con 30 mililitros de solución bloqueadora al cinco por ciento durante cinco minutos cada una en una agitadora de laboratorio.

Bloquee las células en 30 mililitros de solución bloqueante fresca al cinco por ciento durante una hora. La fijación y permeabilización de las células con un cuatro por ciento de paraformaldehído en Octoxynol 9 al 0,1 por ciento preserva claramente los focos gamma-H2AX y 53BP1. Incubar una preparación de las células con un anticuerpo monoclonal anti-gamma-H2AX de ratón y la otra preparación de las células con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-gamma-H2AX y un anticuerpo policlonal de conejo anti-53BP1 durante la noche a cuatro grados centígrados.

Se recomienda encarecidamente el uso de anticuerpos anti-gamma-H2AX y anti-53BP1 de eficacia probada. Después de la incubación, lave las células suavemente tres veces con 30 mililitros de solución bloqueadora al dos por ciento por cada cinco minutos en un agitador de laboratorio. A continuación, incube la primera preparación de las células con un anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado Alexa 488 diluido uno en 500 en una solución de bloqueo al dos por ciento.

Incubar la segunda preparación de las células con un anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado Alexa 488 y un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado de burro Alexa 555 diluido uno en 500 en una solución de bloqueo al dos por ciento. Lave las células suavemente tres veces con 30 mililitros de PBS en un agitador de laboratorio. Retire el PBS y monte las celdas con medio de montaje.

Coloque con cuidado un cubreobjetos en la parte superior del medio de montaje para que no queden burbujas de aire. Espere al menos tres horas para que el medio de montaje se endurezca antes de analizar las células mediante microscopía de fluorescencia. Finalmente, analice los focos gamma-H2AX y 53BP1 en los núcleos celulares con un microscopio de fluorescencia equipado con filtros para DAPI, Alexa 488 y Cy3 durante la obtención de imágenes con un aumento de objeto de 100x.

El análisis de los focos gamma-H2AX en las células es más preciso en la fase G0, G1 y G2, cuando los focos gamma-H2AX aparecen como puntos fluorescentes distintos, como se muestra en esta imagen representativa de fibroblastos. Por el contrario, el análisis de los focos de gamma-H2AX en las células durante la fase S se complica por las manchas dispersas de gamma-H2AX pannucleares causadas por el proceso de replicación. La tinción con inmunofluorescencia de gamma-H2AX se utilizó para la cuantificación de roturas de doble cadena de ADN en tejidos irradiados y se demostró que los niveles de focos de gamma-H2AX en los linfocitos irradiados son proporcionales a la dosis de irradiación.

La colocalización de los focos gamma-H2AX y 53BP1 en células CD34 positivas de un paciente con leucemia mieloide aguda indica la promoción de mecanismos de reparación de unión de extremos no homólogos mediados por 53BP1 en los sitios de roturas de doble cadena de ADN. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la microscopía de inmunofluorescencia gamma-H2AX y 53BP1 para el análisis de roturas de doble cadena de ADN. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunotransferencia de ATM, ATR, quinasa de punto de control uno, quinasa de punto de control dos y TP53 en células tumorales para analizar las alteraciones de la respuesta al daño del ADN.