Fabricación de pozos de agarosa personalizado para la siembra de células y tejido anillo autoensamblaje con moldes impresa en 3D
2 de abril de 2018
Este protocolo describe una plataforma para la fabricación de anillos de tejido automático montado en tamaños variables utilizando un molde de plástico modificado para requisitos particulares impresa en 3D. Negativos PDMS se curan en el molde impreso en 3D; agarosa se echa entonces en los negativos PDMS curados. Las células se siembran en los pozos de agarosa resultante donde agregan en anillos de tejido.
El objetivo general de este procedimiento es crear moldes de siembra de células personalizados que se utilizan para hacer anillos de tejido autoensamblados de varias dimensiones. Este método nos permite crear anillos de tejido tridimensionales a partir de células humanas que se pueden utilizar para evaluar la estructura, la fuerza y la función del tejido. La principal ventaja de esta técnica es que es un método sencillo para fabricar moldes para tejidos autoensamblados con dimensiones personalizadas.
Para comenzar el procedimiento, utilice un software de diseño asistido por computadora para crear un dibujo de un molde en las dimensiones deseadas. Envíe el archivo CAD a una impresora 3D de alta resolución. Imprime el molde en un plástico con un acabado brillante que sea estable a 50 grados centígrados.
Lave a fondo el molde impreso con un cepillo, detergente y agua. Enjuaga el molde con agua destilada y déjalo secar al aire en una rejilla. Es importante elegir un plástico impreso en 3D que sea estable a la temperatura de curado del PDMS.
Los residuos que se transfieren al PDMS durante el calentamiento pueden afectar la formación de anillos. A continuación, mida 25 gramos de base de PDMS en un bote de pesaje desechable. Agregue el agente de curado en una proporción de 1:10 en peso y revuelva vigorosamente hasta que la base y el agente de curado estén completamente mezclados.
Luego, fije cinta de laboratorio alrededor de los lados del molde para formar una pared de aproximadamente un centímetro de altura alrededor de la cara con los pocillos impresos. Asegúrese de que no haya espacios en la pared de la cinta. Vierte la mezcla de PDMS en el molde impreso en 3D.
Desgasifique el PDMS en una cámara de vacío durante 30 a 60 minutos o hasta que no queden burbujas. Cura el PDMS a 50 grados centígrados durante dos a cuatro horas o hasta que el PDMS esté lo suficientemente sólido como para sacarlo del molde. Luego, retire la cinta y separe con cuidado el negativo PDMS del molde.
Incube el negativo PDMS en un horno a 60 grados centígrados durante una hora para asegurarse de que esté completamente curado. Luego, lave bien el negativo con detergente y agua. Enjuaga el molde con agua destilada y déjalo secar al aire.
Antes de fabricar el molde de agarosa, autoclave el negativo PDMS, un par de pinzas romas y cualquier otra herramienta que desee. Para comenzar la fabricación, prepare y autoclave al menos 50 mililitros de agarosa al dos por ciento en DMEM. Prepare los pozos de agarosa un día antes de la siembra en anillo.
Pipetear cuatro mililitros de agarosa fundida en el negativo PDMS esterilizado en autoclave, teniendo cuidado de no llenar demasiado el molde. A continuación, pipetee la agarosa fundida en las cavidades para los postes del pozo de agarosa. Utilice la punta de la pipeta para eliminar todas las burbujas de aire.
La superficie final de la agarosa debe ser plana. Deje que la agarosa se enfríe durante unos 10 minutos. Luego, use pinzas romas para separar cuidadosamente el molde de agarosa enfriado del negativo PDMS.
Coloque el molde boca arriba en un pocillo de una placa de seis pocillos. Agregue el medio de cultivo completo apropiado al pocillo de la placa para que los pocillos de agarosa queden completamente sumergidos. Equilibre los pozos de agarosa a 37 grados centígrados durante la noche antes de usar.
Primero, en una placa de cultivo de 15 centímetros, se cultivan células de músculo liso aórtico de rata a 37 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono al 5 por ciento hasta que se logre una confluencia del 70 por ciento. Una vez que se haya preparado y equilibrado el molde de agarosa deseado durante la noche, enjuague la placa de cultivo dos veces con cinco mililitros de solución salina tamponada con fosfato. Después de eliminar el PBS, agregue tres mililitros de tripzina al 0.25 por ciento al plato.
Incubar a 37 grados centígrados durante dos o tres minutos o hasta que las células se hayan levantado del plato. Neutralizar el tripzina con tres mililitros del medio de cultivo completo. Transfiera las células a un tubo cónico y pipetee suavemente las células hasta que se resuspendan por completo.
Diluya un aliquat de la suspensión celular con un volumen igual de tinte azul de tripano y cuente las células con un hemocitómetro. A continuación, centrifuga la suspensión a 200 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un medio de cultivo completo para lograr una concentración de 10 millones de células por mililitro.
Los pasos más importantes para garantizar una formación de anillos consistente son optimizar el número de células y el medio de cultivo para la línea celular que está utilizando. A continuación, obtenga los pozos de agarosa equilibrados. Aspire con cuidado todo el medio tanto alrededor del exterior de la agarosa como dentro de los pozos de agarosa, teniendo cuidado de no perforar el fondo de los pocillos.
Pipetear 50 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo. Agregue dos mililitros de medio fresco alrededor del exterior de los pocillos de agarosa sin dejar que el medio se derrame en los pocillos. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados en una atmósfera de cinco por ciento de CO2 para permitir que las células se agreguen.
A continuación, aspire el medio desde el exterior de la agarosa. Agregue 4,5 mililitros de medio fresco al plato bien para que los polos de agarosa se llenen y todo el molde de agarosa quede completamente sumergido. Continúe incubando la placa hasta que los anillos de tejido estén lo suficientemente desarrollados, reemplazando el medio cada día.
Luego, deslice suavemente cada anillo de tejido desde su poste con pinzas. Inmediatamente, fije los anillos para la histología o utilícelos para evaluaciones funcionales o mecánicas. La impresión 3D permitió un diseño de molde más flexible.
Los diámetros de los postes se variaban fácilmente, como se muestra en los anillos de células de músculo liso de mi rata fabricados alrededor de postes con diámetros de dos, cuatro y doce milímetros. También se han preparado anillos de tejido a partir de SMC humanas primarias, células madre mesenquimales humanas y SMC derivadas de células madre pluripotentes inducidas. Los anillos se utilizaron como modelos de tejido in vitro para evaluar la función del tejido y la resistencia mecánica.
Aunque este método se diseñó originalmente para fabricar y modelar tejido vascular, también se puede utilizar para fabricar segmentos de otros tipos de tejido, como el cartílago, el músculo esquelético y el tejido cardíaco. Este método proporciona una forma sencilla para que los investigadores creen moldes personalizados para fabricar anillos de tejido en 3D con diferentes dimensiones. Estos anillos se pueden utilizar para evaluar la estructura, las propiedades mecánicas y la función de los tejidos de ingeniería hechos de diferentes tipos de células.
Resumen
Este protocolo describe un método para crear anillos de tejido autoensamblados de diferentes tamaños utilizando un molde personalizado impreso en 3D. El proceso implica la fabricación de negativos de PDMS y la colada de agarosa para crear pozos destinados a la agregación celular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Ingeniería de tejidos
- Cultivo celular
- Impresión 3D
Antecedentes
- Los anillos de tejido autoensamblados pueden utilizarse para estudiar la estructura y función del tejido.
- La impresión 3D permite diseños personalizables de moldes.
- Esta técnica puede aplicarse a diversos tipos de tejidos, incluidos tejidos vasculares y cardíacos.
- Optimizar el número de células y las condiciones de cultivo es crucial para la formación exitosa de anillos de tejido.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método sencillo para fabricar anillos de tejido con dimensiones específicas.
- Evaluar las propiedades mecánicas y la funcionalidad de los tejidos ingenierizados.
- Proporcionar una plataforma para estudiar diferentes tipos celulares en ingeniería de tejidos.
Métodos Utilizados
- Diseñar moldes utilizando software CAD e imprimirlos en 3D con plástico estable.
- Crear moldes negativos de PDMS y pozos de agarosa para la siembra celular.
- Sembrar células en los pozos de agarosa y permitir que se agreguen formando anillos de tejido.
- Evaluar los anillos de tejido formados por sus propiedades estructurales y funcionales.
Resultados principales
- Se formaron con éxito anillos de tejido a partir de diversos tipos celulares, incluyendo células musculares lisas humanas.
- El método demostró flexibilidad en el diseño de moldes y la fabricación de tejidos.
- Los anillos se utilizaron para evaluaciones in vitro de la función del tejido y la resistencia mecánica.
- Se obtuvieron anillos de tejido con diferentes dimensiones mediante la variación del diámetro de los postes en los moldes.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona una manera sencilla y eficaz de crear anillos de tejido personalizados.
- Puede adaptarse para diversas aplicaciones en ingeniería de tejidos.
- La técnica mejora el estudio de los tejidos diseñados y sus propiedades.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite a los equipos de I+D biomédica generar anillos de tejido personalizables y libres de andamio para modelado preclínico, apoyando la reducción mecanicista de riesgos de candidatos terapéuticos. Al permitir un control preciso sobre las dimensiones y la composición del tejido, mejora la confiabilidad predictiva en las etapas iniciales de validación de dianas y en los flujos de trabajo de desarrollo de ensayos. El enfoque reduce la dependencia de sistemas basados en andamios, mejorando la relevancia traslacional para aplicaciones de cribado de fármacos y modelado de enfermedades.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante anillos de tejido autoensamblados que aclaran la funcionalidad de las vías y la interacción con el blanco.
- Valor operativo: Facilita la reducción del riesgo biológico al proporcionar un sistema reproducible para evaluar la modulación del blanco en contextos de tejido tridimensional.
- Valor predictivo: Mejora la selección de carteras al generar lecturas funcionales que se correlacionan con las respuestas a nivel de tejido frente a compuestos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Produce anillos de tejido estandarizados y libres de andamiaje adecuados para la evaluación cuantitativa de los efectos de compuestos sobre la mecánica y función del tejido.
- Valor operativo: Permite la disponibilidad del ensayo mediante la fabricación reproducible de pozos de agarosa, reduciendo la variabilidad en campañas de cribado posteriores.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma en múltiples tipos celulares y modelos de tejidos, apoyando cascadas eficientes de evaluación de compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica mediante la generación de anillos de tejido que imitan la estructura nativa del tejido y sus propiedades mecánicas.
- Sistema Relevante para la Enfermedad: Permite modelar tejidos vasculares, cardíacos, musculares esqueléticos y de cartílago utilizando fuentes primarias o derivadas de células madre.
- Avance Ajustado al Riesgo: Proporciona puntos finales funcionales e histológicos para orientar decisiones de avance o interrupción antes de los estudios in vivo.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir la fabricación de tejidos guiada por hipótesis, lo que orienta la identificación de compuestos activos mediante fenotipado funcional y mecánico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al permitir que los equipos evalúen la formación, resistencia y función del tejido dependientes del blanco en un entorno tridimensional controlado.
- Tamizaje: Proporciona anillos de tejido listos para ensayos con dimensiones consistentes, lo que posibilita un tamizaje fiable de compuestos para fenotipos a nivel de tejido.
- Análisis: Ofrece resultados cuantitativos que incluyen el diámetro del tejido, la fuerza contráctil y marcadores histológicos para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traductiva: Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta el uso preclínico mediante la generación de modelos de tejido aplicables a la evaluación mecánica, funcional e histológica.
- Reutilización Empresarial: Establece el flujo de trabajo con moldes impresos en 3D como una plataforma reutilizable para generar diversos anillos de tejido en diferentes proyectos y tipos celulares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en las interacciones con tejidos diana.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante la fabricación personalizable de moldes con baja varianza.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir una rápida iteración de modelos de tejidos sin artefactos relacionados con andamios.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos funcionales tempranos sobre modelos de tejidos ingenierizados.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en diseño asistido por computadora (CAD), impresión 3D y técnicas estériles de cultivo de tejidos.
- Necesita acceso a una impresora 3D capaz de producir piezas plásticas brillantes y resistentes al calor, así como equipo estándar para la preparación de PDMS y agarosa.
- Exige la estandarización entre equipos de los parámetros de diseño del molde, densidades de siembra celular y condiciones de cultivo para obtener resultados reproducibles.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes tipos celulares u objetivos tisulares, particularmente en relación con la concentración de agarosa y el diámetro de los postes.
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de un moldeado preciso de agarosa para evitar la deformación de los pocillos y la importancia de optimizar el número de células por pocillo para lograr una formación consistente de anillos.
