Fabricación de pozos de agarosa personalizado para la siembra de células y tejido anillo autoensamblaje con moldes impresa en 3D

El objetivo general de este procedimiento es crear moldes de siembra de células personalizados que se utilizan para hacer anillos de tejido autoensamblados de varias dimensiones. Este método nos permite crear anillos de tejido tridimensionales a partir de células humanas que se pueden utilizar para evaluar la estructura, la fuerza y la función del tejido. La principal ventaja de esta técnica es que es un método sencillo para fabricar moldes para tejidos autoensamblados con dimensiones personalizadas.

Para comenzar el procedimiento, utilice un software de diseño asistido por computadora para crear un dibujo de un molde en las dimensiones deseadas. Envíe el archivo CAD a una impresora 3D de alta resolución. Imprime el molde en un plástico con un acabado brillante que sea estable a 50 grados centígrados.

Lave a fondo el molde impreso con un cepillo, detergente y agua. Enjuaga el molde con agua destilada y déjalo secar al aire en una rejilla. Es importante elegir un plástico impreso en 3D que sea estable a la temperatura de curado del PDMS.

Los residuos que se transfieren al PDMS durante el calentamiento pueden afectar la formación de anillos. A continuación, mida 25 gramos de base de PDMS en un bote de pesaje desechable. Agregue el agente de curado en una proporción de 1:10 en peso y revuelva vigorosamente hasta que la base y el agente de curado estén completamente mezclados.

Luego, fije cinta de laboratorio alrededor de los lados del molde para formar una pared de aproximadamente un centímetro de altura alrededor de la cara con los pocillos impresos. Asegúrese de que no haya espacios en la pared de la cinta. Vierte la mezcla de PDMS en el molde impreso en 3D.

Desgasifique el PDMS en una cámara de vacío durante 30 a 60 minutos o hasta que no queden burbujas. Cura el PDMS a 50 grados centígrados durante dos a cuatro horas o hasta que el PDMS esté lo suficientemente sólido como para sacarlo del molde. Luego, retire la cinta y separe con cuidado el negativo PDMS del molde.

Incube el negativo PDMS en un horno a 60 grados centígrados durante una hora para asegurarse de que esté completamente curado. Luego, lave bien el negativo con detergente y agua. Enjuaga el molde con agua destilada y déjalo secar al aire.

Antes de fabricar el molde de agarosa, autoclave el negativo PDMS, un par de pinzas romas y cualquier otra herramienta que desee. Para comenzar la fabricación, prepare y autoclave al menos 50 mililitros de agarosa al dos por ciento en DMEM. Prepare los pozos de agarosa un día antes de la siembra en anillo.

Pipetear cuatro mililitros de agarosa fundida en el negativo PDMS esterilizado en autoclave, teniendo cuidado de no llenar demasiado el molde. A continuación, pipetee la agarosa fundida en las cavidades para los postes del pozo de agarosa. Utilice la punta de la pipeta para eliminar todas las burbujas de aire.

La superficie final de la agarosa debe ser plana. Deje que la agarosa se enfríe durante unos 10 minutos. Luego, use pinzas romas para separar cuidadosamente el molde de agarosa enfriado del negativo PDMS.

Coloque el molde boca arriba en un pocillo de una placa de seis pocillos. Agregue el medio de cultivo completo apropiado al pocillo de la placa para que los pocillos de agarosa queden completamente sumergidos. Equilibre los pozos de agarosa a 37 grados centígrados durante la noche antes de usar.

Primero, en una placa de cultivo de 15 centímetros, se cultivan células de músculo liso aórtico de rata a 37 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono al 5 por ciento hasta que se logre una confluencia del 70 por ciento. Una vez que se haya preparado y equilibrado el molde de agarosa deseado durante la noche, enjuague la placa de cultivo dos veces con cinco mililitros de solución salina tamponada con fosfato. Después de eliminar el PBS, agregue tres mililitros de tripzina al 0.25 por ciento al plato.

Incubar a 37 grados centígrados durante dos o tres minutos o hasta que las células se hayan levantado del plato. Neutralizar el tripzina con tres mililitros del medio de cultivo completo. Transfiera las células a un tubo cónico y pipetee suavemente las células hasta que se resuspendan por completo.

Diluya un aliquat de la suspensión celular con un volumen igual de tinte azul de tripano y cuente las células con un hemocitómetro. A continuación, centrifuga la suspensión a 200 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un medio de cultivo completo para lograr una concentración de 10 millones de células por mililitro.

Los pasos más importantes para garantizar una formación de anillos consistente son optimizar el número de células y el medio de cultivo para la línea celular que está utilizando. A continuación, obtenga los pozos de agarosa equilibrados. Aspire con cuidado todo el medio tanto alrededor del exterior de la agarosa como dentro de los pozos de agarosa, teniendo cuidado de no perforar el fondo de los pocillos.

Pipetear 50 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo. Agregue dos mililitros de medio fresco alrededor del exterior de los pocillos de agarosa sin dejar que el medio se derrame en los pocillos. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados en una atmósfera de cinco por ciento de CO2 para permitir que las células se agreguen.

A continuación, aspire el medio desde el exterior de la agarosa. Agregue 4,5 mililitros de medio fresco al plato bien para que los polos de agarosa se llenen y todo el molde de agarosa quede completamente sumergido. Continúe incubando la placa hasta que los anillos de tejido estén lo suficientemente desarrollados, reemplazando el medio cada día.

Luego, deslice suavemente cada anillo de tejido desde su poste con pinzas. Inmediatamente, fije los anillos para la histología o utilícelos para evaluaciones funcionales o mecánicas. La impresión 3D permitió un diseño de molde más flexible.

Los diámetros de los postes se variaban fácilmente, como se muestra en los anillos de células de músculo liso de mi rata fabricados alrededor de postes con diámetros de dos, cuatro y doce milímetros. También se han preparado anillos de tejido a partir de SMC humanas primarias, células madre mesenquimales humanas y SMC derivadas de células madre pluripotentes inducidas. Los anillos se utilizaron como modelos de tejido in vitro para evaluar la función del tejido y la resistencia mecánica.

Aunque este método se diseñó originalmente para fabricar y modelar tejido vascular, también se puede utilizar para fabricar segmentos de otros tipos de tejido, como el cartílago, el músculo esquelético y el tejido cardíaco. Este método proporciona una forma sencilla para que los investigadores creen moldes personalizados para fabricar anillos de tejido en 3D con diferentes dimensiones. Estos anillos se pueden utilizar para evaluar la estructura, las propiedades mecánicas y la función de los tejidos de ingeniería hechos de diferentes tipos de células.