La ingestión de fluorescente, nanopartículas magnéticas para determinar capacidades de absorción de fluidos en insectos

El objetivo general de este procedimiento es evaluar los parámetros fisiológicos de la alimentación de insectos que se alimentan de fluidos utilizando una solución de sacarosa mezclada con nanopartículas magnéticas fluorescentes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la entomología, como la estructura, la función, las relaciones de las partes bucales de los insectos y los mecanismos de alimentación de los insectos. La principal ventaja de esta técnica es que permite determinar si los insectos son capaces de ingerir fluidos que están presentes ya sea en forma de charcos o como películas líquidas.

Esta demostración utiliza moscas de botella azules porque su capacidad de absorción de líquidos y la morfología de las partes de la boca están bien documentadas. Se pueden usar moscas domésticas, mariposas de repollo y otros insectos que se alimentan de fluidos. Obtén pupas de moscas y colócalas en una cámara ambiental con 18 horas de luz al día y a 23 grados centígrados.

Después de que los adultos emerjan de sus pupas, no los alimente antes del experimento. Para el alimento experimental, prepare una solución de sacarosa al 20 por ciento con nanopartículas de 0,5 miligramos por mililitro. Luego, prepare una estación de alimentación que consta de un manipulador, una pinza y una etapa de alimentación.

En la etapa de alimentación, sostenga la comida con un deslizador cóncavo. Además, prepare varios filtros de red de nailon y filtros de membrana de diferentes tamaños de poro para cubrir el portaobjetos cóncavo. Comienza envolviendo los cuerpos, las patas y las alas del insecto en un papel de seda doblado.

Deje solo las partes de la cabeza y la boca expuestas. Mientras haces esto, mantén al insecto asegurado pellizcando sus alas juntas. Ahora, asegure las alas envueltas en papel de seda entre dos portaobjetos de microscopio.

A continuación, sujete las dos correderas y fije la abrazadera a un manipulador. Luego, asegure el insecto por encima de la etapa de alimentación con el manipulador. A continuación, deposite 30 microlitros de solución de alimentación en el centro del portaobjetos cóncavo y cubra la solución con un trozo poroso de papel de filtro.

La gota se esparcirá a lo largo del papel de filtro llenando los poros. A continuación, coloque el insecto de modo que las regiones distales de las partes de la boca puedan entrar en contacto con el papel de filtro humedecido de modo que solo se pueda alcanzar la parte plana del portaobjetos y el insecto no pueda alimentarse de la región cóncava. Ahora, use un alfiler para insectos para extender las partes de la boca sobre el papel de filtro y permita que el insecto se alimente durante 45 segundos.

Si el insecto no expresa interés en alimentarse, sostenga las piezas bucales contra el papel de filtro durante 45 segundos con el alfiler. Esto completa el protocolo de alimentación. Para la disección, cargue un vidrio de reloj de 50 mililitros con suficiente PBS para cubrir el cuerpo del insecto.

Configúralo junto con todas las herramientas de disección del microscopio. Ahora, retira el insecto del papel de seda manteniendo sus alas cerradas. Luego, retire la cabeza, las patas y las alas con unas tijeras de microdisección de resorte y coloque el tórax y el abdomen en el PBS.

Para diseccionar el intestino, primero tome la cutícula distal del abdomen y corte la cutícula en dirección anterior a lo largo del lado lateral desde el extremo posterior hasta el tórax. Tenga especial cuidado para asegurarse de que solo se corte la cutícula y que no se dañe el canal digestivo. A continuación, retire la cutícula abdominal, el cuerpo graso y otras estructuras con la ayuda de alfileres de insectos hasta que solo queden el tórax y el canal alimentario en el vidrio del reloj.

Ahora, identifica el cultivo. Es una estructura en forma de saco, ubicada cerca de la unión del tórax y el abdomen. Si es necesario, haga incisiones adicionales en el tórax para revelar el buche.

Luego, corte el tórax restante dejando solo el canal alimentario y el buche. Para probar la presencia de nanopartículas ingeridas, comience usando una pinza de disección de punta fina para transferir el cultivo a un cubreobjetos para la obtención de imágenes. Tenga cuidado para evitar la ruptura del cultivo.

Visualice inmediatamente el cultivo en un microscopio confocal invertido con un aumento de 20 veces utilizando el canal CY3 o el contraste de fase. Para identificar las nanopartículas ingeridas, agite una barra de agitación magnética a unos 10 milímetros del cultivo. Haz que cada movimiento hacia adelante y hacia atrás dure aproximadamente un segundo.

Mientras agita el imán, mueva lentamente la etapa de operación para buscar el movimiento de nanopartículas dentro del cultivo casi transparente. Si las nanopartículas están presentes en el cultivo, se agitarán al unísono con la barra de agitación magnética. Un insecto que se alimenta de una solución de una superficie porosa debe crear un puente líquido estable a través de la inestabilidad de la meseta para superar la presión capilar que mantiene el líquido en los poros.

Se predice que el tamaño del conducto de alimentación de un insecto determinará el tamaño de poro más pequeño del que pueden alimentarse. Después de diseccionar los insectos para evaluar si se ingirieron nanopartículas, se tomaron imágenes de sus partes bucales para medir el tamaño del conducto del canal alimenticio. En el caso de las moscas, se midió el diámetro de la pseudotráquea y la abertura oral.

El análisis de las nanopartículas ingeridas sugiere una estrecha relación entre el tamaño del conducto de la parte distal de la boca y el tamaño de poro más pequeño del que puede alimentarse un insecto. Esta relación no se observa con las partes proximales de la boca. En consecuencia, la absorción de líquidos por los dípteros se produciría primero en la pseudotráquea en lugar de en la abertura oral y la acción capilar debe tener un papel importante en la alimentación.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo alimentar a los insectos con una solución de nanopartículas, diseccionarlos para aislar su cultivo y luego inspeccionar el cultivo en busca de nanopartículas. Al intentar este procedimiento, es importante tener cuidado durante las disecciones. Si el cultivo se rompe, puede derramar el contenido líquido y las nanopartículas, arruinando así su muestra.