Name: La ingestión de fluorescente, nanopartículas magnéticas para determinar capacidades de absorción de fluidos en insectos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprende a evaluar la ingesta de fluidos en insectos usando nanopartículas magnéticas fluorescentes con solución de sacarosa. Este método permite estudiar la relación entre la estructura de las piezas bucales y la eficiencia alimentaria en moscas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por National Science Foundation (NSF) subsidio no. IOS 1354956. Agradecemos al Dr. Andrew D. Warren (centro de McGuire para lepidópteros y biodiversidad, Florida Museo de Historia Natural, Universidad de Florida) permiso utilizar las imágenes de la mariposa.

1. insectos especies, preparación de soluciones y la configuración de la estación de alimentación
Nota: las mariposas de la col (Pieris rapae L., Pieridae) son seleccionados como la especie de Lepidoptera representante porque se han utilizado en estudios previos de capacidades de absorción de líquido y mouthpart morfología22,23. Moscas domésticas (Musca domestica L., Muscidae) y las moscas de botella azul (Calliphora vomitoria L., Calliphoridae) se usan porque se observan a menudo alimentándose de superficies porosas13.
<ol>
	<li>Orden p. rapae como larvas de un insecto proveedor y posterior en artificiales de la dieta (véase Tabla de materiales) hasta que pupan y emergen como adultos en una cámara ambiental de 23 ° C y un fotoperiodo de 18 L: 6. Orden M. domestica y C. vomitoria como pupas y posterior en las mismas condiciones ambientales que p. rapae. No alimentar moscas y mariposas adulto después de que emergen de las pupas antes de los experimentos de alimentación.</li>
	<li>Preparar una solución de sacarosa al 20% (control) y una solución de nanopartículas de sacarosa 20% para comprobar la absorción de líquido. Preparar la solución de nanopartículas mediante la adición de nanopartículas magnéticas fluorescentes (óxido de hierro con una capa de ácido poliacrílico, aproximadamente 20 nm de diámetro)24 a una solución de sacarosa 20% (1 mg/mL dH2O nanopartículas con 20% de sacarosa solución 1:1). Preparar una solución de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) (10 x diluido a 1 x en dH2O, pH 7.4), que se utiliza para disecciones.</li>
	<li>Configurar una estación de alimentación que consiste en un manipulador manual con una abrazadera y una etapa de alimentación separada (una plataforma plana) (figura 1). Colocar un portaobjetos cóncavo en la etapa de alimentación y filtros de red de nylon con un diámetro de tamaño de poro de 11, 20, 30, 41 y 60 μm y membrana filtros con diámetros de tamaño de poros de 1, 5, 8 o 10 μm cerca de los experimentos de alimentación.</li>
</ol>
2. Protocolo de alimentación
<ol>
	<li>Envolver los cuerpos, piernas y alas de los insectos en un papel doblado. Coloque el insecto de modo que sólo la cabeza y partes bucales están expuestos. Coloque las alas de los insectos entre dos portaobjetos, que se mantienen unidas por la pinza en el manipulador para que el insecto está suspendido por encima de la etapa de alimentación (figura 1).</li>
	<li>Administrar una gota de 30 μl de la solución de sacarosa al 20% o la solución al 20% sacarosa nanopartículas con una micropipeta en el centro de la diapositiva cóncava. Coloque un solo papel de filtro de un tamaño específico de poro portaobjetos cóncavo para que el centro del papel de filtro se alinea con la gota de la solución de nanopartículas. El contacto entre la gota y el papel de filtro da como resultado la solución que se separa a lo largo el papel de filtro, llenar los poros (figura 1). Nota: El papel de filtro se coloca sobre la gota, en lugar de al revés, para reducir al mínimo la presencia potencial de las nanopartículas sobre el papel de filtro donde se alimentan los insectos.</li>
	<li>Coloque el insecto con el manipulador de modo que sólo las regiones distales de las piezas bucales pueden contactar con el papel de filtro impregnado en la etapa de alimentación (figura 1). Utilice un pasador de insectos para extender las piezas bucales en el papel de filtro y permitir que el insecto para alimentarse de 45 s.</li>
	<li>Para minimizar la posibilidad de insectos alimentándose de películas líquidas que pueden estar presentes en la superficie del papel filtro, coloque las piezas bucales para que estén en contacto con una parte del papel de filtro que está tocando la parte plana de la diapositiva (es decir. no directamente sobre la parte cóncava de la diapositiva). Si el insecto no expresa un interés en la alimentación, las piezas bucales pueden guardarse para el papel de filtro con el pasador de insectos el tiempo de la alimentación.</li>
</ol>
3. disecciones
<ol>
	<li>Poner la solución de PBS en un vidrio de reloj de 50 mm que hay suficiente solución para cubrir el cuerpo de los insectos. Colocar el vidrio de reloj bajo un estereoscopio y posición insecto disección equipo (resorte micro disección, tijeras, alfileres insectos, pinzas de disección de punta fina) al lado del estereoscopio.</li>
	<li>Después de alimentar, retirar el insecto desde el papel de tejido y manténgalo con alas cerradas. Quitar la cabeza, las patas y las alas del insecto con las tijeras de disección micro muelle y coloque el insecto en la solución de PBS en el vidrio de reloj (figura 2).</li>
	<li>Si es necesario, anestesiar insectos antes de disecciones. Utilice pinzas para sujetar el insecto por la cutícula cerca de la región distal del abdomen. Con la mano dominante, utilizar el micro de primavera tijeras de disección para cortar la cutícula en sentido anterior a lo largo de la parte lateral del abdomen, comenzando en el extremo posterior, hasta el tórax. Tenga especial cuidado para asegurar que se corta sólo la cutícula y que el tubo digestivo en los insectos no está dañado (figura 2).</li>
	<li>Hacer recortes adicionales de la cutícula con las tijeras de disección para abrir el abdomen para revelar el tubo digestivo interior (figura 2). Quitar la cutícula abdominal, grasa corporal y otras estructuras con la ayuda de insectos pasadores y reubicarlas fuera el vidrio de reloj para la posterior eliminación, dejando sólo el tórax y el tubo digestivo en el vidrio de reloj. Nota: La disección revelará el cultivo, que es una estructura de forma de saco (una extensión del canal alimenticio) situada cerca de la confluencia del tórax y el abdomen.</li>
	<li>Si el cultivo no está expuesto, hacer incisiones adicionales en el tórax con las tijeras hasta que quede expuesto el cultivo. Una vez que el cultivo es visible, corte las partes restantes del insecto, dejando sólo el tubo digestivo con el cultivo en el vidrio de reloj (figura 2). Nota: El cultivo de lepidópteros es casi transparente y celofán-como en la naturaleza, que puede ser difícil de reconocer si no se llena de fluidos y ampliado o si se corta durante la disección.</li>
	<li>Utilice fórceps de disección de punta fina para colocar la cosecha en un cubreobjetos de (24 x 24 mm) para posterior proyección de imagen (figura 2).</li>
</ol>
4. determinación de nanopartículas ingeridas
<ol>
	<li>Posición del cultivo sobre el cubreobjetos con la pinza disección punta fina usando cuidado para evitar la ruptura de la cosecha. Utilice el canal CY3 (o contraste de fases) en un microscopio confocal invertido para obtener imágenes de 20 aumentos. El cultivo de la imagen inmediatamente después de la disección para evitar que se resequen.</li>
	<li>Mantenga una agitación magnética (41,3 mm de longitud y 8 mm de diámetro) en la mano que no está en control de la etapa de funcionamiento del microscopio.</li></ol>La barra de agitación magnética y hacia atrás cerca de la cosecha (aproximadamente 10 mm distancia cultivo) de la onda para que cada uno de un lado a otro movimiento tarda aproximadamente un segundo (figura 2).
	<li>Mientras que la barra de agitación magnética es agitada, inspeccione el cultivo de las nanopartículas. Mueva lentamente la etapa de funcionamiento hacia adelante y hacia atrás mientras mira a través de la lente ocular del microscopio para el movimiento de nanopartículas dentro el cultivo casi transparente. Si las nanopartículas están presentes en el cultivo, lo que indica la alimentación positiva, van a responder y onda al unísono con la magnética revuelva la barra (figura 2).</li>

<ol><li>Vijaysegaran, S., Walter, G. H., Drew, R. A. I. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/aesa/article-abstract/90/2/184/28469/Mouthpart-Structure-Feeding-Mechanisms-and-Natural">Mouthpart structure, feeding mechanisms, and natural food sources of adult Bactrocera (Diptera: Tephritidae).</a> Ann Entomol Soc Am. 90, 184-201 (1997).</li>
<li>Lehnert, M. S., Monaenkova, D., Andrukh, T., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic-hydrophilic+dichotomy+of+the+butterfly+proboscis%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic-hydrophilic dichotomy of the butterfly proboscis.</a> J R Soc Interface. 10, 1-10 (2013).</li>
<li>Zhao, J., Wu, J., Yan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erection+mechanism+of+glossal+hairs+during+honeybee+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+biol%22%5BJournal%5D)">Erection mechanism of glossal hairs during honeybee feeding.</a> J Theor biol. 386, 62-68 (2015).</li>
<li>Redak, R. A., Purcell, A. H., Lopes, J. R. S., Blua, M. J., Mizell, R. F. 3rd, Andersen, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+xylem+fluid-feeding+insect+vectors+of+Xylella+fastidiosa+and+their+relation+to+disease+epidemiology%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Review+Entomol%22%5BJournal%5D)">The biology of xylem fluid-feeding insect vectors of Xylella fastidiosa and their relation to disease epidemiology.</a> Ann. Review Entomol. 49, 243-270 (2004).</li>
<li>Büttiker, W., Krenn, H. W., Putterill, J. F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02526872">The proboscis of eye-frequenting and piercing Lepidoptera (Insecta).</a> Zoomorphology. 116, 77-83 (1996).</li>
<li>Light, J. E., Smith, V. S., Allen, J. M., Durden, L. A., Reed, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+history+of+mammalian+sucking+lice+%28Phthiraptera%3A+Anoplura%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary history of mammalian sucking lice (Phthiraptera: Anoplura).</a> BMC Evol Biol. 10, (2010).</li>
<li>Krenn, H. W., Aspock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form%2C+function+and+evolution+of+the+mouthparts+of+blood-feeding+Arthropoda%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Struct+Dev%22%5BJournal%5D)">Form, function and evolution of the mouthparts of blood-feeding Arthropoda.</a> Arthropod Struct Dev. 41, 101-118 (2012).</li>
<li>Lehnert, M. P., Pereira, R. M., Koehler, P. G., Walker, W., Lehnert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Cimex+lectularius+using+heat+combined+with+dichlorvos+resin+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Vet+Entomol%22%5BJournal%5D)">Control of Cimex lectularius using heat combined with dichlorvos resin strips.</a> Med Vet Entomol. 25, 460-464 (2011).</li>
<li>Zaspel, J. M., Kononenko, V. S., Goldstein, P. Z. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10905-007-9090-3">Another blood feeder? Experimental feeding of a fruit-piercing moth species on human blood in the Primorye Territory of far eastern Russia (Lepidoptera: Noctuidae: Calpinae).</a> J Insect Behav. 20, 437-451 (2007).</li>
<li>Barth, F. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarth%2C+FG+%22Insects+and+flowers%3A+the+biology+of+a+partnership%22">Insects and flowers: the biology of a partnership</a>. , Princeton University Press. Princeton. (1991).</li>
<li>Foil, L. D., Adams, W. V., McManus, J. M., Issel, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bloodmeal+residues+on+mouthparts+of+Tabanus+fuscicostatus+%28Diptera%3A+Tabanidae%29+and+the+potential+for+mechanical+transmission+of+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Bloodmeal residues on mouthparts of Tabanus fuscicostatus (Diptera: Tabanidae) and the potential for mechanical transmission of pathogens.</a> J Med Entomol. 24, 613-616 (1987).</li>
<li>Monaenkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butterfly+proboscis%3A+combining+a+drinking+straw+with+a+nanosponge+facilitated+diversification+of+feeding+habits%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Butterfly proboscis: combining a drinking straw with a nanosponge facilitated diversification of feeding habits.</a> J R Soc Interface. 9, 720-726 (2012).</li>
<li>Lehnert, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouthpart+conduit+sizes+of+fluid-feeding+insects+determine+the+ability+to+feed+from+pores%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Mouthpart conduit sizes of fluid-feeding insects determine the ability to feed from pores.</a> Proc. R. Soc. B. 284, (2017).</li>
<li>Grimaldi, D., Engel, M. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrimaldi%2C+D+%22Evolution+of+the+insects%22">Evolution of the insects</a>. , Cambridge University Press. New York, NY. (2005).</li>
<li>Adler, P. H., Foottit, R. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdler%2C+PH+%22Insect+biodiversity%3A+science+and+society%22">Insect biodiversity: science and society</a>. , Wiley Blackwell. Chichester, UK. (2009).</li>
<li>Tsai, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoporous+artificial+proboscis+for+probing+minute+amount+of+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoporous artificial proboscis for probing minute amount of liquids.</a> Nanoscale. 3, (2011).</li>
<li>Krenn, H. W. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s004350050053">Proboscis sensilla in Vanessa cardui (Nympahlidae, Lepidoptera): Functional morphology and significance of flower-probing.</a> Zoomorphology. 118, 23-30 (1998).</li>
<li>Plateau, J. A. F. Experimental and theoretical researches on the figures of equilibrium of liquid mass withdrawn from the action of gravity. (Transl). <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/14786445708642346">Annual Report of the Board Regents Smithsonian Institution</a>. , Government Printing Office. Washington, DC. 207-285 (1863).</li>
<li>Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+phase-contrast+x-ray+imaging%3A+a+new+technique+for+the+study+of+animal+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function.</a> BMC Biol. 5, 6(2007).</li>
<li>Westneat, M. W., Socha, J. J., Lee, W. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+biological+structure%2C+function+and+physiology+using+synchrotron+x-ray+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Advances in biological structure, function and physiology using synchrotron x-ray imaging.</a> Annu Rev Physiol. 70, 119-142 (2008).</li>
<li>Lee, W. -K., Socha, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+hemolymph+flow+in+the+heart+of+a+grasshopper+%28Schistocerca+americana%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiology%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of hemolymph flow in the heart of a grasshopper (Schistocerca americana).</a> BMC Physiology. 9, 2(2009).</li>
<li>Lehnert, M. S., Mulvane, C. P., Brother, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouthpart+separation+does+not+impede+butterfly+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Struct+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouthpart separation does not impede butterfly feeding.</a> Arthropod Struct Dev. 43, 97-102 (2014).</li>
<li>Lehnert, M. S., Beard, C. E., Gerard, P. D., Kornev, K. G., Adler, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+lepidopteran+proboscis+in+relation+to+feeding+guild%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Structure of the lepidopteran proboscis in relation to feeding guild.</a> J Morphol. 277, 167-182 (2016).</li>
<li>Yan, H., Sung, B., Kim, M. -H., Kim, C. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/2053-1591/1/4/045032">A novel strategy for functionalizable photoluminescent magnetic nanoparticles.</a> Mater. Res. Express. 1, 045032(2014).</li>
<li>Kingsolver, J. G., Daniel, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanics+and+energetics+of+nectar+feeding+in+butterflies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">On the mechanics and energetics of nectar feeding in butterflies.</a> J Theor Biol. 76, 167-179 (1979).</li>
<li>Krenn, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+mechanisms+of+adult+Lepidoptera%3A+Structure%2C+function%2C+and+evolution+of+the+mouthparts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Feeding mechanisms of adult Lepidoptera: Structure, function, and evolution of the mouthparts.</a> Ann Rev Entomol. 55, 307-327 (2010).</li>
<li>Tsai, C. -C., Monaenkova, D., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradox+of+the+drinking-straw+model+of+the+butterfly+proboscis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Paradox of the drinking-straw model of the butterfly proboscis.</a> J Exp Biol. 217, 2130-2138 (2014).</li>
<li>Bauder, J. A. S., Handschuh, S., Metscher, B. D., Krenn, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+morphology+of+the+feeding+apparatus+and+evolution+of+proboscis+length+in+metalmark+butterflies+%28Lepidoptera%3A+Riodinidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+J+Linn+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional morphology of the feeding apparatus and evolution of proboscis length in metalmark butterflies (Lepidoptera: Riodinidae).</a> Biol J Linn Soc. 110, 291-304 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Funcionalidad de insectos mouthpart históricamente se infiere de los estudios de morfología gruesa (e.g., funcionalidad de lepidópteros probóscide relacionadas con un consumo de paja de25,26); sin embargo, estudios recientes que incorporan evidencias experimentales han dado como resultado un cambio de paradigma en nuestra comprensión de la complejidad de partes bucales de insectos y las relaciones de estructura y función2,</s...

Muchos grupos de insectos tienen piezas bucales (probóscide) adaptado para alimentarse de líquidos, tales como néctar, frutas, la descomposición de sap flujos (por ejemplo 1de Diptera, Lepidoptera2, Hymenoptera3), xilema (Hemiptera4), lágrimas (Lepidoptera 5) y sangre (Phthiraptera6, Siphonaptera7, Diptera7,8de Hemiptera, Lepidoptera9). La capacidad de los insectos se alimentan de fluidos es relevante para la salud del ecosistema (por ejemplo, polinización,10), enfermedad transmisión4,11, biodiversification2,12y estudios de evolución convergente13. A pesar de la amplia variedad de fuentes de alimentos, un tema entre algunos insectos de alimentación de fluido es la capacidad de adquirir pequeñas cantidades de líquidos, que podrían limitarse a gotitas de tamaño micro o nano, películas líquidas o superficies porosas.
Dada la amplia diversidad de insectos de alimentación de líquido (más del 20% de las especies animales14,15) y su capacidad para alimentarse de una variedad de fuentes de alimentos, entendiendo su alimentación comportamientos y mecanismos de absorción de líquido es importante en muchos campos. Funcionalidad del mouthpart insectos, por ejemplo, ha desempeñado un papel en el desarrollo de tecnología biomimética, p. ej., dispositivos de microfluidos que pueden realizar tareas como la adquisición de pequeñas cantidades de líquidos utilizando métodos similares a los empleados por insectos16. Un problema fundamental en los estudios de los mecanismos de absorción de líquido, sin embargo, es determinar no sólo cómo insectos se alimentan de líquidos, pero adquirir evidencia experimental que apoya el mecanismo. Únicamente mediante el comportamiento (por ejemplo, sondeando con la probóscide12,17) como un indicador de alimentación es insuficiente porque no confirma la exitosa absorción de líquidos, ni provee un medio para determinar la ruta que fluidos de viaje su paso a través de los insectos. Además, realizar experimentos con pequeñas cantidades de líquidos mejor representa escenarios naturales de alimentación donde los fluidos son un recurso limitante2,12.
Fase de proyección de imagen de contraste se utilizó con la mariposa monarca (Danaus plexippus L.) para evaluar cómo las mariposas se alimentan de pequeñas cantidades de líquidos de superficies porosas12de rayos x. Mariposas monarca usa acción capilar a través de espacios entre proyecciones cuticulares (legulae dorsal) a lo largo de la probóscide para hacer fluidos confinados a pequeños poros en el canal de alimentación. Los fluidos entrantes forman una película en la pared del canal de alimentos que crece y se derrumba en un puente líquido por meseta inestabilidad12,18, que luego es transportada al intestino de la mariposa por la acción de la bomba de succión en la cabeza. Aunque la proyección de imagen contraste fase de rayos x es una herramienta óptima para la visualización de flujo de fluidos en insectos12,19,20,21, la técnica no es fácilmente disponible y más conveniente el método es necesario para la evaluación rápida de la capacidad de un insecto para líquidos de absorción e ingerirlos.
Para determinar si el mecanismo de alimentación de D. plexippus se aplica a otros lepidópteros y también a las moscas (Diptera) (ambos grupos se alimentan de líquidos de superficies porosas), Lehnert et al. 13 aplica una técnica para evaluar la capacidad de un insecto que se alimentan de pequeñas cantidades de líquidos de superficies porosas, que se divulga en detalle aquí. Aunque el protocolo descrito aquí es para estudios que utilizan húmedos y superficies porosas, la metodología puede modificarse para otros estudios, tales como abordar mecanismos de alimentación de piscina. Además, las aplicaciones se extienden a otros campos, incluyendo la tecnología microfluídica y Bioinspirados.

Solución salina <table><tbody>tamponada con fosfato al <tr><td>20%</td><td>Domino Sugar</td><td></td><td>necesaria para producir la solución de sacarosa con dH2</td></tr><tr><td>O Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>Concentración 10X diluida a 1X en dH2O para disecciones de insectos</td></tr><tr><td>Portaobjetos cóncavo de depresión simple</td><td>AmScope</td><td>BS-C6</td><td>Slide es necesario para la configuración</td></tr> <tr>de la etapa de alimentación<td>Papel de filtro</td><td>EMD Millipore</td><td>NY6004700 (60 &micro; m)</td><td>Filtros de red de nylon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>EMD Millipore</td><td>NY4104700 (41 &micro; m)</td><td>Filtros de red de nailon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>EMD Millipore</td><td>NY3004700 (30 &micro; m)</td><td>Filtros de red de nailon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>EMD Millipore</td><td>NY2004700 (20 &micro; m)</td><td>Filtros de red de nylon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>EMD Millipore</td><td>NY1104700 (11 &micro; m)</td><td>Filtros de red de nailon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>EMD Millipore</td><td>TCTP04700 (10 y micro; m)</td><td>Filtros de red de nailon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>EMD Millipore</td><td>TETP04700 (8 &micro; m)</td><td>Filtros de red de nailon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>EMD Millipore</td><td>TMTP04700 (5 &micro; m)</td><td>Filtros de red de nailon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>EMD Millipore</td><td>RTTP04700 (1 &micro; m)</td><td>Filtros de red de nailon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos</td></tr><tr><td>Tijeras de microdisección Iris</td> Carolina <td>Biological Supply Company</td><td>623555</td><td>Tijeras utilizadas para disecciones</td></tr><tr><td>Alfileres de insectos</td> <td>7Productos Bioquip</td><td>1208B1</td><td>Alfileres utilizados durante las disecciones y los ensayos de alimentación</td></tr><tr><td>Pinzas de disección de punta extrafina</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>624684</td><td>Equipo de disección</td></tr><tr><td>Estereoscopio Leica M205 C Leica</td><td>Microsystems</td><td>M205 C</td><td>Estereoscopio utilizado para disecciones</td></tr><tr><td>Microscopio confocal invertido</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>Microscopio fluorescente utilizado para detectar nanopartículas magnéticas</td></tr><tr><td>Fisherbrand PTFE Barra agitadora desechable</td><td>Fisherscientific</td><td>S68067</td><td>Imán utilizado para detectar nanopartículas</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34155</td><td>Pañuelos utilizados para asegurar insectos durante las pruebas de alimentación</td></tr><tr><td>Pupas de mosca doméstica (Musca domestica)</td><td>Mantisplace.com</td><td></td><td>insectos para experimentos</td></tr><tr><td>Pupas de mosca de botella azul (Calliphora vomitoria)</td><td>Mantisplace.com</td><td></td><td>insectos para experimentos Larvas de</td></tr><tr><td>mariposa de col (Pieris rapae)</td> Carolina <td>Biological Supply Company</td><td>144102</td><td>insectos para experimentos</td></tr><tr><td>Finnpipette F1&nbsp;</td><td>Micropipeta ThermoFisher Scientific</td><td>4641080N</td><td>para la dosificación de líquidos</td></tr><tr><td>Finntip 250 puntas de pipeta</td> Microscopio de <td>puntas de micropipeta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>9400250</td></tr><tr><td>(=cubreobjetos) (24 x 24 mm)</td><td>AmScope</td><td>CS-S24-100</td><td>cubreobjetos para ver el buche del insecto en el microscopio confocal</td></tr></tbody></table>

la ingestión de fluorescente, nanopartículas magnéticas para determinar capacidades de absorción de fluidos en insectos

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Líquido de alimentación insectos ingieren una gran variedad de líquidos, que están presentes en el ambiente como piscinas, películas, o confinados a pequeños poros. Estudios de adquisición líquido requieren evaluar las relaciones estructura y función del mouthpart; sin embargo, mecanismos de absorción de líquido históricamente se infieren de las observaciones de la arquitectura estructural, a veces acompañado con evidencia experimental. Aquí, Divulgamos un nuevo método para evaluar la capacidad de absorción de líquido con mariposas (Lepidoptera) y moscas (Diptera) con pequeñas cantidades de líquidos. Insectos se alimentan con una solución de sacarosa 20% mezclada con nanopartículas magnéticas, fluorescentes de papeles de filtro de tamaño de poro determinado. El cultivo (estructura interna para guardar líquidos) se extrae del insecto y colocado en un microscopio confocal. Un imán es agitado por el cultivo para determinar la presencia de nanopartículas, que indican si los insectos son capaces de ingerir líquidos. Esta metodología se utiliza para revelar un mecanismo alimentación generalizado (acción capilar y formación de puente líquido) que es potencialmente compartido entre Lepidoptera y Diptera cuando alimentación de superficies porosas. Además, este método puede utilizarse para estudios de mecanismos de entre una variedad de insectos de alimentación de líquido, los importantes incluidos en la transmisión de la enfermedad y biomimética y potencialmente otros estudios que implican tamaño nano o micro conductos de alimentación donde transporte líquido requiere verificación.

El estudio de patrones en la capacidad de absorción de líquido entre insectos de alimentación de líquido requiere determinación de alimentación cuando se produce. El protocolo aquí descrito se utiliza para probar la hipótesis limitación de tamaño de poro entre Lepidoptera y Diptera13. La hipótesis limitación de tamaño de poro afirma que insectos de alimentación de líquido no pueden alimentar de poros llenos de líquido, si el diámetro de tamaño de poro es más pequeñ...

Líquido de alimentación insectos tienen la capacidad de adquirir cantidades diminutas de líquido de superficies porosas. Este protocolo describe un método para determinar directamente la capacidad de los insectos a ingerir líquidos de superficies porosas utilizando soluciones de alimentación con nanopartículas magnéticas, fluorescentes.

La ingestión de fluorescente, nanopartículas magnéticas para determinar capacidades de absorción de fluidos en insectos

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar los parámetros fisiológicos de la alimentación de insectos que se alimentan de fluidos utilizando una solución de sacarosa mezclada con nanopartículas magnéticas fluorescentes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la entomología, como la estructura, la función, las relaciones de las partes bucales de los insectos y los mecanismos de alimentación de los insectos. La principal ventaja de esta técnica es que permite determinar si los insectos son capaces de ingerir fluidos que están presentes ya sea en forma de charcos o como películas líquidas.Esta demostración utiliza moscas de botella azules porque su capacidad de absorción de líquidos y la morfología de las partes de la boca están bien documentadas. Se pueden usar moscas domésticas, mariposas de repollo y otros insectos que se alimentan de fluidos. Obtén pupas de moscas y colócalas en una cámara ambiental con 18 horas de luz al día y a 23 grados centígrados.Después de que los adultos emerjan de sus pupas, no los alimente antes del experimento. Para el alimento experimental, prepare una solución de sacarosa al 20 por ciento con nanopartículas de 0,5 miligramos por mililitro. Luego, prepare una estación de alimentación que consta de un manipulador, una pinza y una etapa de alimentación.En la etapa de alimentación, sostenga la comida con un deslizador cóncavo. Además, prepare varios filtros de red de nailon y filtros de membrana de diferentes tamaños de poro para cubrir el portaobjetos cóncavo. Comienza envolviendo los cuerpos, las patas y las alas del insecto en un papel de seda doblado.Deje solo las partes de la cabeza y la boca expuestas. Mientras haces esto, mantén al insecto asegurado pellizcando sus alas juntas. Ahora, asegure las alas envueltas en papel de seda entre dos portaobjetos de microscopio.A continuación, sujete las dos correderas y fije la abrazadera a un manipulador. Luego, asegure el insecto por encima de la etapa de alimentación con el manipulador. A continuación, deposite 30 microlitros de solución de alimentación en el centro del portaobjetos cóncavo y cubra la solución con un trozo poroso de papel de filtro.La gota se esparcirá a lo largo del papel de filtro llenando los poros. A continuación, coloque el insecto de modo que las regiones distales de las partes de la boca puedan entrar en contacto con el papel de filtro humedecido de modo que solo se pueda alcanzar la parte plana del portaobjetos y el insecto no pueda alimentarse de la región cóncava. Ahora, use un alfiler para insectos para extender las partes de la boca sobre el papel de filtro y permita que el insecto se alimente durante 45 segundos.Si el insecto no expresa interés en alimentarse, sostenga las piezas bucales contra el papel de filtro durante 45 segundos con el alfiler. Esto completa el protocolo de alimentación. Para la disección, cargue un vidrio de reloj de 50 mililitros con suficiente PBS para cubrir el cuerpo del insecto.Configúralo junto con todas las herramientas de disección del microscopio. Ahora, retira el insecto del papel de seda manteniendo sus alas cerradas. Luego, retire la cabeza, las patas y las alas con unas tijeras de microdisección de resorte y coloque el tórax y el abdomen en el PBS.Para diseccionar el intestino, primero tome la cutícula distal del abdomen y corte la cutícula en dirección anterior a lo largo del lado lateral desde el extremo posterior hasta el tórax. Tenga especial cuidado para asegurarse de que solo se corte la cutícula y que no se dañe el canal digestivo. A continuación, retire la cutícula abdominal, el cuerpo graso y otras estructuras con la ayuda de alfileres de insectos hasta que solo queden el tórax y el canal alimentario en el vidrio del reloj.Ahora, identifica el cultivo. Es una estructura en forma de saco, ubicada cerca de la unión del tórax y el abdomen. Si es necesario, haga incisiones adicionales en el tórax para revelar el buche.Luego, corte el tórax restante dejando solo el canal alimentario y el buche. Para probar la presencia de nanopartículas ingeridas, comience usando una pinza de disección de punta fina para transferir el cultivo a un cubreobjetos para la obtención de imágenes. Tenga cuidado para evitar la ruptura del cultivo.Visualice inmediatamente el cultivo en un microscopio confocal invertido con un aumento de 20 veces utilizando el canal CY3 o el contraste de fase. Para identificar las nanopartículas ingeridas, agite una barra de agitación magnética a unos 10 milímetros del cultivo. Haz que cada movimiento hacia adelante y hacia atrás dure aproximadamente un segundo.Mientras agita el imán, mueva lentamente la etapa de operación para buscar el movimiento de nanopartículas dentro del cultivo casi transparente. Si las nanopartículas están presentes en el cultivo, se agitarán al unísono con la barra de agitación magnética. Un insecto que se alimenta de una solución de una superficie porosa debe crear un puente líquido estable a través de la inestabilidad de la meseta para superar la presión capilar que mantiene el líquido en los poros.Se predice que el tamaño del conducto de alimentación de un insecto determinará el tamaño de poro más pequeño del que pueden alimentarse. Después de diseccionar los insectos para evaluar si se ingirieron nanopartículas, se tomaron imágenes de sus partes bucales para medir el tamaño del conducto del canal alimenticio. En el caso de las moscas, se midió el diámetro de la pseudotráquea y la abertura oral.El análisis de las nanopartículas ingeridas sugiere una estrecha relación entre el tamaño del conducto de la parte distal de la boca y el tamaño de poro más pequeño del que puede alimentarse un insecto. Esta relación no se observa con las partes proximales de la boca. En consecuencia, la absorción de líquidos por los dípteros se produciría primero en la pseudotráquea en lugar de en la abertura oral y la acción capilar debe tener un papel importante en la alimentación.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo alimentar a los insectos con una solución de nanopartículas, diseccionarlos para aislar su cultivo y luego inspeccionar el cultivo en busca de nanopartículas. Al intentar este procedimiento, es importante tener cuidado durante las disecciones. Si el cultivo se rompe, puede derramar el contenido líquido y las nanopartículas, arruinando así su muestra.

the-ingestion-fluorescent-magnetic-nanoparticles-for-determining

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Nanopartículas fluorescentes producidos en nuestro laboratorio se utilizan para las concentraciones de iones de imágenes y los flujos de iones en los sistemas biológicos, como las células en el líquido intersticial y la señalización en la homeostasis fisiológica.

Las nanopartículas fluorescentes para la Medición de la concentración de iones en sistemas biológicos

En este artículo se describe un método que utiliza multi-espectral citometría de flujo de imágenes para cuantificar la internalización de nanopartículas polianhídrido o bacterias de las células RAW 264.7.

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Este video muestra una técnica para detectar contaminantes bacterianos en muestras de alimentos y agua utilizando nanosensores. Las bacterias patógenas objetivo se detectan mediante una combinación de modalidades de relajación magnética y emisión de fluorescencia.

Detección de contaminación bacteriana mediante nanosensores magnetofluorescentes

Este video muestra un sistema microfluídico para un inmunoensayo basado en nanopartículas magnéticas. El sistema de detección utiliza un dispositivo microfluídico que incorpora una trampa magnética dentro de sus canales. Se introducen en los canales inmunocomplejos preformados, compuestos por nanopartículas magnéticas recubiertas de antígenos unidas a anticuerpos primarios y secundarios conjugados con peroxidasa. Los inmunocomplejos se capturan en la trampa magnética porosa al aplicar un campo...

Un inmunoensayo basado en nanopartículas magnéticas que utiliza un dispositivo microfluídico

Análisis de la interacción de nanopartículas con subpoblaciones definidas de células inmunes por citometría de flujo.

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

El uso de fluoróforos para la obtención de imágenes in vivo puede verse muy limitado por la opsonización, el aclaramiento rápido, la baja sensibilidad de detección y los efectos citotóxicos en el huésped. La encapsulación de fluoróforos en liposomas mediante hidratación y extrusión de película conduce a la extinción y protección de la fluorescencia, lo que permite obtener imágenes in vivo con una alta sensibilidad de detección.

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para En Vivo Imagen Óptico

Este manuscrito describe una técnica novedosa que permite la detección de la expresión génica intracelular después de la endocitosis de nanopartículas marcadas con fluorescencia directamente en células vivas. El método no requiere manipulación de las células y no está restringido con respecto al gen o especie objetivo.

La detección de Intracelular expresión génica en células vivas de murino, humano y porcino Origen Utilizando nanopartículas fluorescencia marcado

El objetivo general del presente Protocolo es sintetizar funcional nanosensores para el portable, eficiente, y rápida detección de específicamente las bacterias patógenas a través de una combinación de relajación magnética y las modalidades de emisión de fluorescencia.

Patógenos de transmisión alimentaria proyección utilizando Magneto-fluorescente Nanosensor: Detección rápida de e. Coli O157: H7

Sondas específicas de objetivo representan una herramienta innovadora para el análisis de los mecanismos moleculares, como la expresión de proteínas en diversos tipos de enfermedad (p. ej., inflamación, infección y tumorigenesis). En este estudio, describimos una evaluación tomográfica tridimensional cuantitativa de la infiltración de macrófagos intestinales en un modelo murino de colitis con F4/80-específica mediada por fluorescencia tomografía.

Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación Intestinal murina relacionadas con macrófagos

Las nanopartículas de óxido de hierro se sintetizan a través de un procedimiento de gel sol noaqueoso y están recubiertas con moléculas cortas aniónicas o polímero. El uso de magnetometría para monitorear la incorporación y biotransformaciones de nanopartículas magnéticas dentro de células madre humanas se demuestra utilizando un magnetómetro de muestra vibratoria (VSM).

Uso de magnetometría para monitorear la incorporación celular y la posterior biodegradación de nanopartículas de óxido de hierro sintetizadas químicamente

El objetivo de este protocolo es entregar comidas de sangre artificiales y derivadas de animales a los mosquitos Aedes aegypti a través de un alimentador de membrana artificial y cuantificar con precisión el volumen de comida ingerida.

Alimentación y cuantificación de sangre de origen animal y comidas artificiales en mosquitos Aedes aegypti

Aprende a evaluar la ingesta de fluidos en insectos usando nanopartículas magnéticas fluorescentes con solución de sacarosa. Este método permite estudiar la relación entre la estructura de las piezas bucales y la eficiencia alimentaria en moscas.

La ingestión de fluorescente, nanopartículas magnéticas para determinar capacidades de absorción de fluidos en insectos

Explorar más videos