Medida flexible de reporteros bioluminiscentes con un automatizado Luciferase Longitudinal imagen optimizada de Gas y temperatura grabadora (cocodrilo)

El objetivo general de este sistema es permitir la fácil observación de los reporteros bioluminiscentes en una amplia gama de condiciones extracelulares, incluso bajo perfusión constante del medio. Este método se puede utilizar para observar la bioluminiscencia longitudinalmente a partir de células y tejidos cultivados. La principal ventaja de esta técnica es que permite el registro desde células bajo diferentes medios extracelulares y condiciones de gas, lo que no es posible en la mayoría de los sistemas existentes.

Aunque aquí demostramos esta técnica en el contexto de experimentos de ritmo circadiano, podría aplicarse fácilmente a otros sistemas que requieren bioluminiscencia o registro fluorescente en escalas de tiempo de días a semanas. Para comenzar el procedimiento, siembre las células cultivadas en placas o placas de cultivo de tejidos. Incubar las células a 37 grados centígrados hasta que las monocapas hayan alcanzado el 100% de confluencia.

Inmediatamente antes del experimento, use una incubadora cíclica controlada por computadora para alternar entre 32 y 37 grados Celsius cada 12 horas durante un mínimo de 72 horas para sincronizar los ritmos celulares. La sincronización robusta de las oscilaciones circadianas celulares, tanto dentro como entre cultivos, es crucial para la reproducibilidad experimental. Esto lo logramos aplicando ciclos de temperatura diarios antes de cada registro que sincronizan las células imitando los ritmos de temperatura corporal.

Alternativamente, la sincronización farmacológica también puede ser bastante eficaz. A continuación, combine 8,3 gramos de polvo DMEM con alto contenido de glucosa con 900 mililitros de agua ultrapura. Revuelva la solución durante 30 minutos para disolver completamente el polvo.

Luego, agregue a la solución 50 mililitros de solución de glucosa de 100 gramos por litro, 20 mililitros de un pH 7.6, una solución MOPS molar y 10 mililitros de solución de estreptomicina 100 veces penicilina. Revuelve la mezcla durante 10 minutos. A continuación, añade 4,7 mililitros de una solución de bicarbonato de sodio al 7,5% y remueve la mezcla durante cinco minutos más.

Use ácido clorhídrico o hidróxido de sodio para ajustar el pH a 7.6 a temperatura ambiente. Agregue agua ultrapura a la solución para lograr un volumen final de un litro. Filtre la solución a través de un filtro estéril de 0,22 micrómetros en un matraz estéril.

Almacene el medio de culata filtrado a cuatro grados centígrados. Inmediatamente antes de realizar el experimento, suplementar la cantidad deseada de medio madre con 10% de suero, dos milimolares de GlutaMAX, 2%NS21 y un milimolar de luciferina. Pase el medio de trabajo resultante a través de un filtro estéril de 0,22 micrómetros.

Utilice una solución de cinco molares de cloruro de sodio para ajustar la osmolalidad del medio de trabajo a 350 miliosmoles. Luego, calienta el medio a 37 grados centígrados en un baño de agua. A continuación, para comenzar a enfocar la cámara de la incubadora de bioluminiscencia, desenrosque el filtro de densidad neutra calentado impermeable al agua.

En el software del instrumento, ajuste el tiempo de exposición a 0,2 segundos y el tiempo del ciclo cinético a 0,3 segundos. Verifique que la ganancia multiplicadora de electrones esté desactivada, luego cierre la ventana de configuración e inicie la grabación de video. Utilice el cilindro de enfoque para girar la lente de la cámara hasta que los elementos de prueba en el estante de muestras apropiado estén claramente enfocados.

Luego, detenga la grabación de video. Reemplace el filtro de densidad neutra y retire los elementos de prueba. A continuación, utilice el panel de control situado en la parte frontal de la incubadora de bioluminiscencia para establecer los niveles de oxígeno, dióxido de carbono y temperatura deseados para el experimento.

Para un experimento humidificado, llene la bandeja de agua en la base de la incubadora. Retire las células de la incubadora de cultivo de tejidos y reemplace el medio de cultivo con el medio de trabajo precalentado. Para experimentos humidificados con pequeños volúmenes, selle las placas con una película o cinta adhesiva permeable al gas.

Coloque las placas en la incubadora bioluminiscente. Cierre la incubadora y fije la tapa de la puerta para excluir la luz del sistema. Luego, en el software del instrumento, configure el modo de adquisición en cinético.

Establezca el tiempo de exposición deseado. Establezca las acumulaciones en uno, la longitud de la serie cinética en el número deseado de ciclos de adquisición y el tiempo del ciclo cinético en el intervalo de imagen deseado. Establezca una velocidad de cambio de 4,33 microsegundos, una ganancia de uno y una ganancia EM del nivel deseado.

A continuación, establezca el tipo de archivo de guardado automático en sif o tiff. Asigne un nombre al archivo de guardado automático y establezca su ruta de archivo. Establezca el tipo de archivo de cola en sif o tiff.

Asigne un nombre a la pila de archivos y establezca su ruta de acceso. Cierre la ventana de configuración y comience a registrar datos. Una vez finalizada la recopilación de datos, importe la pila de imágenes adquirida al software de procesamiento de imágenes.

Ajuste el brillo y el contraste para una visualización óptima de la bioluminiscencia. A continuación, seleccione las regiones de interés y exporte la señal media de las áreas seleccionadas. Copie los datos en el software de análisis para su posterior procesamiento.

Para comenzar el experimento, se utilizaron células semilla en portaobjetos de un solo canal con conectores Luer y una profundidad de canal de 0,6 o 0,8 milímetros. Cultivo y arrastre de las células. Prepare y caliente el medio de perfusión DMEM de baja glucosa tamponado con carbonato de hidrógeno.

A continuación, corte cinco secciones de dos centímetros de tubo de silicona con un diámetro interior de un milímetro. Corte tubos de etileno tetrafluoroetileno de 1,2 metros, 10 centímetros y 30 centímetros de diámetro interior. Esterilice el tubo con etanol al 70% y enjuague el tubo con PBS estéril.

Utilice el tubo de silicona esterilizado para conectar el tubo de ETFE de 1,2 metros a un conector Luer hembra estéril y a un conector Luer de codo estéril. Utilice este conjunto para conectar la jeringa del medio de perfusión a un portaobjetos de canal Luer vacío. A continuación, sustituya el medio de cultivo celular por un medio de perfusión precalentado.

Llene una jeringa estéril de 20 mililitros con medio de perfusión precalentado. Coloque el tubo de ETFE de 10 centímetros con conectores Luer utilizando el tubo de silicona y conecte el tubo a la corredera. Enjuague de tres a cinco mililitros de medio de perfusión a través del tubo y el portaobjetos del canal.

A continuación, coloque el tubo de ETFE de 30 centímetros en el portaobjetos del canal que contiene la célula. Conecte el extremo libre del tubo de ETFE de 10 centímetros al otro extremo del portaobjetos del canal celular para formar el sistema de perfusión completo. Enjuague un mililitro de medio de perfusión a través del tubo y los deslizadores para excluir las burbujas de aire.

Transportar el sistema de perfusión a la incubadora de bioluminiscencia. Asegure la jeringa llena de medio de perfusión en una bomba de jeringa, teniendo cuidado de no desconectar el tubo. Utilice la bomba de jeringa para enjuagar un mililitro de medio de perfusión a través del sistema de perfusión.

Introduzca el diámetro de la jeringa en la bomba y ajuste el caudal a 50 microlitros por hora. Es crucial que no haya burbujas en el sistema de perfusión al comienzo del experimento, ya que pueden interrumpir la señal de bioluminiscencia. Encienda la bomba y cierre inmediatamente la puerta de la incubadora de bioluminiscencia.

Fije la cubierta de la puerta para excluir la luz del sistema. Adquiera y analice los datos tal y como se describen para los cultivos de tejidos estáticos. Se arrastraron seis placas de fibroblastos PER2 LUC utilizando ciclos diarios de temperatura y se obtuvieron imágenes utilizando una incubadora de bioluminiscencia.

Se analizaron las imágenes de los pozos seleccionados y se cuantificó la producción de bioluminiscencia. También se obtuvieron imágenes de células LUC PER2 en condiciones de perfusión para evaluar los efectos de un inhibidor de la caseína quinasa en la expresión de LUC PER2. Los resultados se compararon con las células tratadas con la misma concentración del inhibidor en condiciones estáticas, que revelaron un alargamiento del período sustancialmente mayor en condiciones estáticas.

Se encontró que la magnitud del alargamiento del período en condiciones de perfusión era cercana a la observada in vivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de bioluminiscencia estática y perfundida con un ALLIGATOR.