Name: Medida flexible de reporteros bioluminiscentes con un automatizado Luciferase Longitudinal imagen optimizada de Gas y temperatura grabadora (cocodrilo) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprende a medir reporteros bioluminiscentes con el sistema ALLIGATOR para estudios longitudinales de expresión génica en células cultivadas. Esta técnica automatizada permite monitorear ritmos circadianos bajo diversas condiciones extracelulares de gas y temperatura.

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Nos gustaría agradecer a Cairn investigación por trabajar con nosotros para desarrollar este sistema, en especial Mark Henson, Jeremy Graham y Joao Correia. También agradecemos a David Welsh y Akhilesh Reddy valiosa discusión durante la fase de diseño, así como Peter Laskey (antes de Hamamatsu) para organizar el préstamo de una cámara de demo y David Wong por su aporte crítico al manuscrito.

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</ol>

No hay conflictos de intereses existentes.

El protocolo descrito aquí es para cultura de células de mamífero, tanto bajo condiciones de perfusión y estática. Sin embargo, el cocodrilo puede ser fácilmente adaptado a otros sistemas modelo. De hecho, ya se ha demostrado para proporcionar una excelente plataforma para la monitorización simultánea de locomoción, el sueño y ritmos de expresión periférica gene en Drosophila melanogaster mantenida en oscuridad constante15. También se observa que, dependiendo de la aplicación, tipo de cámara que no sea mencionado aquí puede ser apropiado. Prevemos que con los filtros adecuados, una versión modificada de la actual configuración podría en principio utilizar para la cuantificación de la fluorescencia.
Las aplicaciones sólo para que el cocodrilo no sería apropiado son los que se requiere, como proyección de imagen de la organización espacio-temporal de la expresión PER2::LUC en rodajas organotypic de los mamíferos particularmente alta resolución espacial núcleo supraquiasmático, u otros sectores pequeños de tejido.
El cocodrilo permite muchos experimentos a realizar que hasta ahora no han sido fácilmente alcanzables por técnicas de grabación convencional. En comparación con los métodos actuales para la medición de la bioluminiscencia, el caimán ofrece mayor flexibilidad en el tipo de placa de cultivo celular o diapositiva que puede ser utilizado, las condiciones de medios externos, sensibilidad y procesividad.
Esto es particularmente relevante en un momento cuando hay un alejamiento de los modelos de cultura estándar celular 2D a 3D organoides y el flujo de los sistemas de cultivo. Como tal, se prevé que el caimán proporcionará un método adaptable que puede medirse bioluminiscencia durante muchos días bajo una amplia gama de condiciones.

El uso de luciferasas como reporteros de expresión génica y actividad de la proteína se ha convertido en una técnica popular en la investigación de la biología molecular y celular. Esto es cierto en el campo circadiano, siendo particularmente idóneo para informar los cambios longitudinales en la expresión génica que ocurren durante el ciclo circadiano h aproximadamente 24 la cinética de inactivación catalítica y de síntesis de luciferasa de luciérnaga. Como tal, luciferasa se emplea como un reportero circadiano a través de una amplia gama de microorganismos, incluyendo hongos, plantas, moscas y mamíferos1,2,3,4.
Cuando la cuantificación de la expresión de genes circadianos en vitro, un tubo fotomultiplicador (PMT) se utiliza comúnmente para grabar la señal bioluminiscente. Medidas basadas en el PMT es limitada flexibilidad sin embargo, generalmente se limita a un determinado tamaño de plato o plato. También no es posible recabar toda la información espacial de las muestras monitoreadas usando un PMT, que puede conducir a una pérdida de información cuando las muestras que indican variación espacial en la expresión de la luciferasa de la proyección de imagen. Además, como el PMT y el asociado son propensos a un mal funcionamiento cuando se expone al ambiente humidificado de una incubadora de cultivo de célula estándar, grabación longitudinal luciferase usando PMT se realiza siempre en incubadoras no humidificado. En consecuencia, platos de cultivo celular deben sellarse herméticamente para evitar la pérdida de humedad por evaporación y los medios de cultivo por lo tanto debe ser protegido con 3-(N- morfolino) el ácido propanesulfonic (MOPS) o 4-(2-hidroxietil) -1- -1-ácido ácido (HEPES), más que el CO2/bicarbonate buffering sistema que funciona en vivo y se utiliza rutinariamente en cultivo de tejidos de mamífero.
Como resultado de estas limitaciones, medición de bioluminiscencia por PMTs generalmente impone restricciones apretadas sobre las condiciones bajo las cuales las células se mantienen durante los experimentos. Para superar estos problemas y también para aumentar el rango de condiciones experimentales, utilizamos una estándar CO2/N2 170 L cultivo de tejidos incubadora que ha sido adaptada por la adición de una agua fría electrón-multiplicar dispositivo de carga acoplada (EMCCD) cámara con ópticas antiniebla y control digital de temperatura y gas. Esto ha sido denominado un automatizado la proyección de imagen de Luciferase Longitudinal Gas y grabadora de Temperature-Optimized o cocodrilo. El cocodrilo permite flexibilidad substancialmente creciente de imágenes bioluminiscentes, tanto para la proyección de imagen de alto rendimiento de las placas de cultivo de tejidos estándar (hasta 6 x 96 o 384-bien placas al mismo tiempo) y también para los sistemas de cultivo de tejidos no estándar, tales como perfusión células cultivadas en dispositivos microfluídicos. Este instrumento también permite la proyección de imagen para ocurrir bajo condiciones humidificadas y con control variable de tanto CO2 y presión parcial de O2 así como temperatura.
El protocolo a continuación describe un método para la grabación bioluminiscente de células de mamífero y sistemas de cultivo de tejidos con un caimán (en adelante referido como 'incubadora' de bioluminiscencia). Sin embargo, cabe señalar que el sistema sería idóneo para la proyección de imagen bioluminiscente y también, con alguna modificación, fluorescente de la proyección de imagen, en un número de otros sistemas biológicos y contextos.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FetalClone III Suero</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30109.03</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Thermofisher 21103049</td><td></td><td>medio basal</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Catalasa</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Glutatión</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>Superóxido Dismutasa</td><td>Sigma</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>Holotransferrina</td><td>Calbiochem</td><td>616424</td><td></td></tr><tr><td>T3 (triyodo-L-tironina</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>L-Carnitina</td><td>Sigma</td><td>C7518</td><td></td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Sigma</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-Galactosa</td><td>Sigma</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de Sodio</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Corticosterona</td><td>Sigma</td><td>C2505</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Linoleico</td><td>Sigma</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Linolénico</td><td>Sigma</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Lipoico</td><td>Sigma</td><td>T1395</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Retinol Sigma</td><td></td><td>R7882</td><td></td></tr><tr><td>Retinol, todo trans</td><td>Sigma</td><td>95144</td><td></td></tr><tr><td>D,L-alfa-Tocoferol</td><td>Sigma</td><td>95240</td><td></td></tr><tr><td>D,Acetato de L-alfa-Tocoferol</td><td>Sigma</td><td>T3001</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Bicarbonato de Sodio Sigma</td><td></td><td>S8761-100ML</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Galaxy 170R incubadora&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>CO17301001</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Biosynth</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>D -(+)-Solución de glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM polvo</td><td>Sigma</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>PHG0007</td><td></td></tr><tr><td>tubo de silicona de 1 mm de diámetro interior&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>19-4692-01</td><td></td></tr><tr><td>Conector luer de codo</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Racores luer macho</td><td>Ibidi</td><td>10826</td><td></td></tr><tr><td>Racores luer hembra</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-slide luer I 0.6</td><td>Ibidi</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>BD plastipak Jeringa 20ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1mm Tubo I.D. ETFE GE</td><td>Healthcare</td><td>18-1142-38</td><td></td></tr><tr><td>PF670462</td><td>Sigma</td><td>SML0795</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento (50x)</td><td>Cámara ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon 888</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A Prisma</td><td></td></tr><tr><td>7.0</td><td>Graphpad Software</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypan azul</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla isotérmica Deltaphase</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de densidad neutra calentado&nbsp;</td><td>Cairn Research</td><td>Artículo</td><td></td>personalizado</tr><tr><td>Osmomat 030</td><td>Gonotech</td><td>Descatalogado</td><td></td></tr><tr><td>300 mOsmol/kg estándar de calibración</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0020</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de medición</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0010</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de enfoque</td><td>Cairn Research</td><td>Artículo</td><td></td>personalizado</tr><tr><td>NE-1600 bomba de jeringa programable Pump</td><td>Systems inc. </td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis Software</td><td>Andor</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

medida flexible de reporteros bioluminiscentes con un automatizado luciferase longitudinal imagen optimizada de gas y temperatura grabadora (cocodrilo)

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Reporteros de luciferasa basado de la expresión génica celular son de uso generalizado para ambos longitudinal y punto final ensayos de actividad biológica. En la investigación de los ritmos circadianos, por ejemplo, fusiones de genes reloj con luciferasa de luciérnaga dan lugar a ritmos robustos en bioluminiscencia celular que persisten durante muchos días. Limitaciones técnicas asociadas con los tubos de fotomultiplicador (PMT) o métodos convencionales basados en la microscopía para la cuantificación de la bioluminiscencia han exigido normalmente que las células y los tejidos se mantenga en condiciones absolutamente fisiológico durante grabación, con una relación inversa entre la sensibilidad y rendimiento. Aquí, Divulgamos un refinamiento de métodos anteriores que permite imágenes de bioluminiscencia a largo plazo con alta sensibilidad y rendimiento que apoya una amplia gama de condiciones de cultivo, incluyendo gas variable y control de humedad, y que acepta muchas diferentes platos y placas de cultivo de tejidos. Este luciferase longitudinal automatizada optimizada de gas y temperatura grabadora (cocodrilo) la proyección de imagen también permite la observación de las variaciones espaciales en la expresión de luciferasa en una monocapa de células o tejido, que no puede ser observado fácilmente por el tradicional métodos. Destacamos cómo el cocodrilo proporciona flexibilidad mucho mayor para la detección de actividad de luciferasa en comparación con los métodos existentes.

Este artículo describe un protocolo para la proyección de imagen bioluminiscente de las células mamíferas usando un cocodrilo (incubadora de bioluminiscencia). Esta técnica permite flexibilidad de configuración física y condiciones extracelulares cuando proyección de imagen sistemas bioluminiscentes. Se describen métodos para cultivo de células inundado (figura 2, 2 de Video suplementaria) y simple cultura estática del tejido (figura 1, 1 de Video suplementaria), pero muchas otras configuraciones podrían ser reflejadas mediante este sistema. Todos los datos fueron cuantificados mediante los métodos descritos en la sección 7.
Figura 1A se muestra un ejemplo video de una bioluminiscencia grabación de placas 6 x 96 pocillos que contienen fibroblastos PER2::LUC4. Los pozos exteriores no contienen células como éstos no fueron necesarios para este experimento. Las células han sufrido arrastre diferencial de temperatura, por el que se someten a cualquier ciclo de temperatura de 12 h a 32 ° C, seguida por 12 h 37 ° C por 72 h o converse (12 h, a 37 ° C seguida por 12 h, a 32 º C durante 72 h), antes recluidos en constante de 37 ° C para la grabación. exposiciones de 60 min fueron tomadas cada hora. Dos de estas condiciones se cuantifican en la figura 1B.
Figura 2A muestra un esquema de la instalación de un sistema de cultivo de tejidos perfundido. Esto consiste en dos muestras de canal conectados con la tubería. Los medios de comunicación es conducido a través de las células por una bomba de jeringa. La primera de estas diapositivas actúa como una trampa de burbuja permeable al gas (diapositiva de buffer) y no contiene ninguna célula, con el segundo que contiene las células que se registra la bioluminiscencia. Un representante de grabación de video de este sistema se muestra en la figura 2B. exposiciones de 15 minutos fueron tomadas cada 15 minutos. Aquí, las células se mantienen en condiciones de perfusión estándar o en presencia de inhibidor de la quinasa de la caseína PF670462, que se ha demostrado previamente para alargar período circadiano y reducir la amplitud de ritmos de expresión de genes reloj en cultivo las células mamíferas14. El efecto sobre la expresión de PER2::LUC se muestra en la figura 2 (panel superior) contra las células tratadas con la misma concentración de droga bajo condiciones de cultivo de célula estática estándar que se muestra en la figura 2 (panel inferior), con cuantificación de período se muestra en la Figura 2D. Es claro de esto que el tratamiento con PF670462 influye en la expresión de PER2::LUC en ambos grupos de condiciones. Sin embargo, mientras que las células trataron con PF670462 bajo condiciones perfundidas Mostrar alargamiento período de aproximadamente 3 h (3 h ±0.9), las células en condiciones estáticas tratadas con el fármaco mostraron alargamiento período sustancialmente mayor a un periodo de &gt; 48 h. Esto puede caber por un coseno amortiguado, como se describe en la sección 7, (extra suma de cuadrados F prueba frente a una línea recta, p &lt; 0.0001). Curiosamente, la magnitud del alargamiento período bajo perfusión es mucho más cercana al observado en vivo14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2.jpg"> 
Figura 1: ejemplo de datos. (A) ejemplo video snapshot de bioluminescence de PER2::LUC inmortalizado en 6 x 96 bien las placas en la incubadora de la bioluminiscencia. Pozos para cuantificar se han destacado en amarillo en el Video complementario 1. (B) cuantificación de bioluminiscencia A. Dos juegos de 3 placas de células fueron atrapados con los ciclos de temperatura (12 h a 32 ° C, 12 h, a 37° C) que eran anti-fásicos entre sí para producir frente a fases de expresión de la proteína PER2 (n = 6, media ± SEM). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2.jpg"> 
Figura 2: perfusión con inhibidores de la CK1δ. (A) diagrama esquemático del sistema de perfusión. (B) ejemplo de vídeo instantánea de una bioluminiscencia grabación de PER2::LUC de las células bajo perfusión. Un área de muestra de cuantificación es resaltada en amarillo. (C) cuantificación de bioluminescence de los fibroblastos PER2::LUC en perfusión y en condiciones estáticas con y sin inhibidor de CK1 de 3 μm PF670462 (n = 3, media ± SEM). Bioluminiscencia ha sido normalizada a los valores mínimos y máximos. (D) análisis de período (ANOVA de dos vías, test de comparaciones múltiples de Holm-Sidak).<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Concentración media final (μM)</td>
			<td>Valores (mg/mL)</td>
			<td>Para 400 mL NS21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albúmina bovina</td>
			<td>37</td>
			<td>-</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalasa</td>
			<td>0.01</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutatión</td>
			<td>3.2</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulina</td>
			<td>0.6</td>
			<td>10</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superóxido dismutasa</td>
			<td>0.077</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrina</td>
			<td>0,062</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (triyodotiroacético-L-tironina)</td>
			<td>0.0026</td>
			<td>2</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitina</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etanolamina</td>
			<td>16</td>
			<td>Líquido (1 g/ml)</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+)-galactosa</td>
			<td>83</td>
			<td>-</td>
			<td>300 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescina</td>
			<td>183</td>
			<td>-</td>
			<td>322 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenito de sodio</td>
			<td>0.083</td>
			<td>1</td>
			<td>280 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterona</td>
			<td>0.058</td>
			<td>2</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido linoleico</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido linolénico</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido lipoico</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterona</td>
			<td>0.02</td>
			<td>3.2</td>
			<td>0,04 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetato de retinol</td>
			<td>0.2</td>
			<td>20</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol, todo el transporte</td>
			<td>0.3</td>
			<td>10</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alfa-tocoferol</td>
			<td>2.3</td>
			<td>100</td>
			<td>0. 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alfa-tocoferol acetato</td>
			<td>2.1</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: NS21 preparación.
1 Video complementario: video ejemplo de bioluminiscencia de las placas bien. Captura video de ejemplo de bioluminiscencia de PER2::LUC inmortalizado en placas bien 6 x 96 en la incubadora de la bioluminiscencia. Pozos para cuantificar se resaltan en amarillo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_1A_Revision-1.avi">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
2 Video complementario: captura video de ejemplo de una bioluminiscencia grabación de PER2::LUC de las células bajo perfusión. Un área de muestra de cuantificación es resaltada en amarillo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_2B_Revision-1.avi">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Luciferase genéticamente codificado es un popular reportero no invasivo de la expresión génica. Uso de un automatizado luciferase longitudinal imagen optimizada de gas y temperatura grabadora (cocodrilo) permite la grabación longitudinal de células bioluminiscentes bajo una amplia gama de condiciones. Aquí mostramos cómo cocodrilo puede utilizarse en el contexto de la investigación de los ritmos circadianos.

Medida flexible de reporteros bioluminiscentes con un automatizado Luciferase Longitudinal imagen optimizada de Gas y temperatura grabadora (cocodrilo)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

El objetivo general de este sistema es permitir la fácil observación de los reporteros bioluminiscentes en una amplia gama de condiciones extracelulares, incluso bajo perfusión constante del medio. Este método se puede utilizar para observar la bioluminiscencia longitudinalmente a partir de células y tejidos cultivados. La principal ventaja de esta técnica es que permite el registro desde células bajo diferentes medios extracelulares y condiciones de gas, lo que no es posible en la mayoría de los sistemas existentes.Aunque aquí demostramos esta técnica en el contexto de experimentos de ritmo circadiano, podría aplicarse fácilmente a otros sistemas que requieren bioluminiscencia o registro fluorescente en escalas de tiempo de días a semanas. Para comenzar el procedimiento, siembre las células cultivadas en placas o placas de cultivo de tejidos. Incubar las células a 37 grados centígrados hasta que las monocapas hayan alcanzado el 100% de confluencia.Inmediatamente antes del experimento, use una incubadora cíclica controlada por computadora para alternar entre 32 y 37 grados Celsius cada 12 horas durante un mínimo de 72 horas para sincronizar los ritmos celulares. La sincronización robusta de las oscilaciones circadianas celulares, tanto dentro como entre cultivos, es crucial para la reproducibilidad experimental. Esto lo logramos aplicando ciclos de temperatura diarios antes de cada registro que sincronizan las células imitando los ritmos de temperatura corporal.Alternativamente, la sincronización farmacológica también puede ser bastante eficaz. A continuación, combine 8,3 gramos de polvo DMEM con alto contenido de glucosa con 900 mililitros de agua ultrapura. Revuelva la solución durante 30 minutos para disolver completamente el polvo.Luego, agregue a la solución 50 mililitros de solución de glucosa de 100 gramos por litro, 20 mililitros de un pH 7.6, una solución MOPS molar y 10 mililitros de solución de estreptomicina 100 veces penicilina. Revuelve la mezcla durante 10 minutos. A continuación, añade 4,7 mililitros de una solución de bicarbonato de sodio al 7,5% y remueve la mezcla durante cinco minutos más.Use ácido clorhídrico o hidróxido de sodio para ajustar el pH a 7.6 a temperatura ambiente. Agregue agua ultrapura a la solución para lograr un volumen final de un litro. Filtre la solución a través de un filtro estéril de 0,22 micrómetros en un matraz estéril.Almacene el medio de culata filtrado a cuatro grados centígrados. Inmediatamente antes de realizar el experimento, suplementar la cantidad deseada de medio madre con 10% de suero, dos milimolares de GlutaMAX, 2%NS21 y un milimolar de luciferina. Pase el medio de trabajo resultante a través de un filtro estéril de 0,22 micrómetros.Utilice una solución de cinco molares de cloruro de sodio para ajustar la osmolalidad del medio de trabajo a 350 miliosmoles. Luego, calienta el medio a 37 grados centígrados en un baño de agua. A continuación, para comenzar a enfocar la cámara de la incubadora de bioluminiscencia, desenrosque el filtro de densidad neutra calentado impermeable al agua.En el software del instrumento, ajuste el tiempo de exposición a 0,2 segundos y el tiempo del ciclo cinético a 0,3 segundos. Verifique que la ganancia multiplicadora de electrones esté desactivada, luego cierre la ventana de configuración e inicie la grabación de video. Utilice el cilindro de enfoque para girar la lente de la cámara hasta que los elementos de prueba en el estante de muestras apropiado estén claramente enfocados.Luego, detenga la grabación de video. Reemplace el filtro de densidad neutra y retire los elementos de prueba. A continuación, utilice el panel de control situado en la parte frontal de la incubadora de bioluminiscencia para establecer los niveles de oxígeno, dióxido de carbono y temperatura deseados para el experimento.Para un experimento humidificado, llene la bandeja de agua en la base de la incubadora. Retire las células de la incubadora de cultivo de tejidos y reemplace el medio de cultivo con el medio de trabajo precalentado. Para experimentos humidificados con pequeños volúmenes, selle las placas con una película o cinta adhesiva permeable al gas.Coloque las placas en la incubadora bioluminiscente. Cierre la incubadora y fije la tapa de la puerta para excluir la luz del sistema. Luego, en el software del instrumento, configure el modo de adquisición en cinético.Establezca el tiempo de exposición deseado. Establezca las acumulaciones en uno, la longitud de la serie cinética en el número deseado de ciclos de adquisición y el tiempo del ciclo cinético en el intervalo de imagen deseado. Establezca una velocidad de cambio de 4,33 microsegundos, una ganancia de uno y una ganancia EM del nivel deseado.A continuación, establezca el tipo de archivo de guardado automático en sif o tiff. Asigne un nombre al archivo de guardado automático y establezca su ruta de archivo. Establezca el tipo de archivo de cola en sif o tiff.Asigne un nombre a la pila de archivos y establezca su ruta de acceso. Cierre la ventana de configuración y comience a registrar datos. Una vez finalizada la recopilación de datos, importe la pila de imágenes adquirida al software de procesamiento de imágenes.Ajuste el brillo y el contraste para una visualización óptima de la bioluminiscencia. A continuación, seleccione las regiones de interés y exporte la señal media de las áreas seleccionadas. Copie los datos en el software de análisis para su posterior procesamiento.Para comenzar el experimento, se utilizaron células semilla en portaobjetos de un solo canal con conectores Luer y una profundidad de canal de 0,6 o 0,8 milímetros. Cultivo y arrastre de las células. Prepare y caliente el medio de perfusión DMEM de baja glucosa tamponado con carbonato de hidrógeno.A continuación, corte cinco secciones de dos centímetros de tubo de silicona con un diámetro interior de un milímetro. Corte tubos de etileno tetrafluoroetileno de 1,2 metros, 10 centímetros y 30 centímetros de diámetro interior. Esterilice el tubo con etanol al 70% y enjuague el tubo con PBS estéril.Utilice el tubo de silicona esterilizado para conectar el tubo de ETFE de 1,2 metros a un conector Luer hembra estéril y a un conector Luer de codo estéril. Utilice este conjunto para conectar la jeringa del medio de perfusión a un portaobjetos de canal Luer vacío. A continuación, sustituya el medio de cultivo celular por un medio de perfusión precalentado.Llene una jeringa estéril de 20 mililitros con medio de perfusión precalentado. Coloque el tubo de ETFE de 10 centímetros con conectores Luer utilizando el tubo de silicona y conecte el tubo a la corredera. Enjuague de tres a cinco mililitros de medio de perfusión a través del tubo y el portaobjetos del canal.A continuación, coloque el tubo de ETFE de 30 centímetros en el portaobjetos del canal que contiene la célula. Conecte el extremo libre del tubo de ETFE de 10 centímetros al otro extremo del portaobjetos del canal celular para formar el sistema de perfusión completo. Enjuague un mililitro de medio de perfusión a través del tubo y los deslizadores para excluir las burbujas de aire.Transportar el sistema de perfusión a la incubadora de bioluminiscencia. Asegure la jeringa llena de medio de perfusión en una bomba de jeringa, teniendo cuidado de no desconectar el tubo. Utilice la bomba de jeringa para enjuagar un mililitro de medio de perfusión a través del sistema de perfusión.Introduzca el diámetro de la jeringa en la bomba y ajuste el caudal a 50 microlitros por hora. Es crucial que no haya burbujas en el sistema de perfusión al comienzo del experimento, ya que pueden interrumpir la señal de bioluminiscencia. Encienda la bomba y cierre inmediatamente la puerta de la incubadora de bioluminiscencia.Fije la cubierta de la puerta para excluir la luz del sistema. Adquiera y analice los datos tal y como se describen para los cultivos de tejidos estáticos. Se arrastraron seis placas de fibroblastos PER2 LUC utilizando ciclos diarios de temperatura y se obtuvieron imágenes utilizando una incubadora de bioluminiscencia.Se analizaron las imágenes de los pozos seleccionados y se cuantificó la producción de bioluminiscencia. También se obtuvieron imágenes de células LUC PER2 en condiciones de perfusión para evaluar los efectos de un inhibidor de la caseína quinasa en la expresión de LUC PER2. Los resultados se compararon con las células tratadas con la misma concentración del inhibidor en condiciones estáticas, que revelaron un alargamiento del período sustancialmente mayor en condiciones estáticas.Se encontró que la magnitud del alargamiento del período en condiciones de perfusión era cercana a la observada in vivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de bioluminiscencia estática y perfundida con un ALLIGATOR.

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Medida flexible de reporteros bioluminiscentes con un automatizado Luciferase Longitudinal imagen optimizada de Gas y temperatura grabadora (cocodrilo) (Video) | JoVE Journal

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