Name: En Vivo EPR evaluación de pH, pO2, estado Redox y concentraciones de fosfato y glutatión en el microambiente tumoral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprende a evaluar el microambiente tumoral mediante resonancia paramagnética electrónica in vivo en modelos murinos de cáncer de mama. Esta técnica cuantifica oxígeno, pH y glutatión de forma no invasiva.

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Este trabajo fue parcialmente financiado por los NIH concede CA194013, CA192064 y U54GM104942. El WVCTSI es reconocido para la puesta en marcha para VVK, AB y TDE. Los autores agradecen la ayuda con los experimentos ilustrativos Dr. M. Gencheva y K. Steinberger. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de los NIH.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos presentados permiten para la evaluación no invasiva en vivo de los parámetros críticos de la TME química, es decir pO2, pH, estado redox y concentraciones de GSH intracelular y Pi intersticial. Técnicas de resonancia magnética, MRI como EPR bajo campo, son los métodos de elección para no invasiva en vivo perfiles de estos parámetros TME. MRI visualiza estructuras anatómicas pero carece de sensibilidad funcional. En contraste con RMN, EPR técnicas proporcionan sensibilidad...

Un papel clave de lo TME en la progresión del cáncer y terapia es cada vez más apreciado1. Entre los parámetros fisiológicos importantes de TME en tumores sólidos tejidos hipoxia2, acidosis3,4, reducción alta capacidad5, concentraciones elevadas de GSH intracelular6,7, e intersticial Pi8 están bien documentados. No invasiva in vivo pO2, pH, Pi, GSH y redox evaluaciones proporcionan perspectivas únicas en los procesos biológicos en TME y ayudar a avance de herramientas para la detección preclínica de fármacos contra el cáncer y estrategias terapéuticas dirigidas de TME. Una profundidad de penetración razonable por radiofrecuencia en los tejidos por la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI) y las técnicas basadas en la EPR bajo campo hace que los enfoques más apropiados para la evaluación no invasiva de estos parámetros TME. MRI se basa en gran medida en la proyección de imagen de los protones de agua y es ampliamente utilizado en contextos clínicos para proporcionar resolución anatómica pero carece de resolución funcional. Las mediciones de resonancia magnética fósforo-31 (31P-NMR) de extracelular concentración de Pi y de pH basado en una señal de fosfato endógeno son potencialmente atractivas para la caracterización de TME, pero normalmente son enmascaradas por varias veces mayor intracelular Pi concentraciones9,10. En contraste con esto, las medidas del EPR dependen de espectroscopia y proyección de imagen especialmente diseñado sondas paramagnéticas para proporcionar resolución funcional. Nota que exógeno EPR sondas tienen una ventaja sobre exógeno NMR sondas debido a la mucha mayor sensibilidad intrínseca de EPR y la ausencia de señales EPR fondo endógeno. El reciente desarrollo de una función dual pH y redox nitroxyl sonda11 y multifuncional trityl sonda12 ofrece oportunidades sin igual para en vivo mediciones simultáneas de varios parámetros TME y sus Análisis de correlación independientes en la distribución de la sonda y el tiempo de medición. A nuestro conocimiento, no existen otros métodos disponibles para evaluar simultáneamente en vivo parámetros TME químicos fisiológico importantes en temas de la vida, como pO2, pHe, Pi, redox y GSH.
Sondas para En Vivo Funcionales medidas:
La figura 1 muestra las estructuras químicas de las sondas paramagnéticas utilizadas para acceder a los parámetros TME, que incluyen sondas solubles y particuladas. Alta sensibilidad funcional, estabilidad en tejido vivo y mínima toxicidad son algunos de los beneficios que hacen sondeos partículas preferidos sobre sondas soluble para oximetría de EPR en vivo . Por ejemplo, sondas de partículas aumentaron tiempos de retención en el sitio de implante de tejido comparado con sondas soluble, lo que permite la medición longitudinal de tejido pO2 durante varias semanas. Por el contrario, solubles sondas superan sondas partículas proporcionando mediciones espacial resuelto mediante EPR-técnicas de imagen así como permitiendo análisis concomitantes de múltiples funcionalidades (pO2, pH, Pi, redox, y GSH).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56624/56624fig1.jpg"> Figura 1. Estructuras químicas de las sondas paramagnéticas que ensayo de evaluación de TME. Esto incluye la punta de prueba de partículas pO2 , LiNc-BuO (R = - O (CH2)3CH3) y solubles sondas: sonda de pH y redox de doble función, NR; GSH-sensible a la sonda, RSSR; y múltiples funciones pO2, pH y sonda de Pi del microambiente extracelular, la sonda de esperanza. La síntesis de estas sondas se ha descrito en las referencias proporcionado 11,12. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56624/56624fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Espectrómetro EPR de banda L</td><td>Magnettech, Alemania</td><td></td><td>Espectrómetro de resonancia paramagnética electrónica (EPR) de banda L (1,2 GHz) para la recopilación de espectros in vitro e in vivo de moléculas paramagnéticas</td></tr><tr><td>&nbsp; Temperatura & Controlador de gas&nbsp;</td><td>Noxygen, Alemania</td><td></td><td>Temperatura & Controlador de gas diseñado para controlar y ajustar la temperatura y la composición del gas&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH (L-Glutatión reducido)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>MMTV-PyMT&nbsp; ratones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td></td> Met-1 células <td></td><td></td>de<td>cáncer de mama murinas</td></tr><tr><td>C57Bl/6 ratones de tipo salvaje&nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de exclusión de azul de tripano &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Ohmeda Fluotec 3&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (IsoFlo)</td><td>Abbott Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S07051</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosa oxidasa</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lauda Circulator E100</td><td>Lauda-Brikmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH Orion</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda de LiNc-BuO</td><td>En casa</td><td></td><td>La sonda de octa-n-butoxi-naftalocianina se sintetizó de acuerdo con la sonda ref 13</td></tr><tr><td>NR</td><td>En casa</td><td></td><td>La sonda de nitrógeno se sintetizó de acuerdo con la ref 11</td></tr><tr><td>Sonda RSSR</td><td>En casa</td><td></td><td>La sonda de di-Nitroxide se sintetizó de acuerdo con la ref 15</td></tr><tr><td>HOPE probe</td><td>En casa</td><td></td><td>La sonda monofosfonada Triarilmetilo se sintetizó de acuerdo con la ref 12</td></tr></tbody></table>

en vivo epr evaluación de ph, po2, estado redox y concentraciones de fosfato y glutatión en el microambiente tumoral

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Este protocolo demuestra la capacidad de resonancia paramagnética electrónica de bajo campo (EPR)-basado en técnicas en combinación con sondas paramagnéticas funcionales para proporcionar información cuantitativa sobre el microambiente tumoral química (TME), incluyendo p O2, pH, estado redox, concentraciones de fosfato inorgánico intersticial (Pi) e intracelulares del glutatión (GSH). En particular, una aplicación de una sonda de trityl multifuncional soluble recientemente desarrollado proporciona oportunidad sin igual para en vivo mediciones simultáneas de pH, pO2 y Pen E xtracellular espacio (sonda de esperanza). Las mediciones de tres parámetros con una sola sonda permiten sus análisis de la correlación independientes de distribución de la sonda y el tiempo de las mediciones.

Tejido p O 2 Puntas de prueba de evaluación utilizando el LiNc-BuO:
Utilizando el procedimiento descrito en el paso 1.1, se realizó la calibración de la suspensión de microcristales de LiNc-BuO recién preparada. La figura 2 muestra la dependencia de oxígeno típica del grosor de la línea de la son...

Resonancia paramagnética electrónica de bajo campo (banda L, 1.2 GHz) usando puntas de prueba nitroxyl y trityl soluble se demuestra para la evaluación de parámetros fisiológicamente importantes en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama.

En Vivo EPR evaluación de pH, pO2, estado Redox y concentraciones de fosfato y glutatión en el microambiente tumoral

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

El objetivo general de esta tecnología de resonancia paramagnética electrónica in vivo es evaluar cuantitativamente y de forma no invasiva los parámetros fisiológicamente relevantes del microambiente tisular local en entornos preclínicos en modelos animales de cáncer. Esta técnica se basa en la combinación de APR de fluorocampo con sondas paramagnéticas funcionales de diseño especial para proporcionar información cuantitativa sobre la oxigenación tisular como CDT en estado de muelle, así como las concentraciones intersticiales de fosfato orgánico e intercelular. Esta técnica no invasiva proporciona una visión única del mundo del microambiente tumoral y la regénesis tumoral, y puede contribuir al futuro diseño racional de terapias anticancerosas dirigidas al microambiente tumoral.La aplicación de esta técnica se extiende hacia la correlación cerebral entre los parámetros de aplicación de las sondas APR multifuncionales. Por lo tanto, proporciona información adicional sobre los mecanismos biológicos subyacentes. Además de Andrey y yo, harán la demostración del procedimiento Marieta Gencheva y el Dr. Benoit Driesschaert y una estudiante graduada, Kayla Steinberger del Centro IMMR.Para preparar la sonda sensible al oxígeno de partículas, primero pese 60 miligramos de los microcristales. Para la calibración de la sensibilidad al oxígeno, suspenda los microcristales en tres mililitros de medios de águila modificados con dolbeckas. Sonicar durante cinco minutos, en hielo, con un sonicador de sonda a 20 kilohercios utilizando siete vatios de potencia en un tubo de fondo redondo de vidrio de cinco mililitros.A continuación, coloque un mililitro de los microcristales sonicados en un tubo de vidrio en el resignador de la bobina de superficie del espectrómetro EPR de banda L. Adquiera espectros EPR de ondas continuas a la temperatura fisiológica de 37 grados Celsius y concentraciones de oxígeno de cero, uno, dos, cuatro, ocho y 20,9 por ciento. Para preparar la sonda de pH y redox de doble función, disuelva 6,34 miligramos de la sonda en un mililitro de solución salina.Ajuste el pH a 7.2 con pequeñas cantidades de ácido clorhídrico o hidróxido de sodio usando un medidor de pH. Para realizar la calibración del pH de la sonda de nitrógeno, primero agregue 0,1 mililitros de la solución madre de la sonda a 0,9 mililitros de tampón de fosfato de sodio de dos milimolares, cloruro de sodio de 150 milimolares. A continuación, valore la solución de sonda milimolar obtenida con asignaciones de ácido clorhídrico o hidróxido de sodio al pH requerido utilizando un medidor de pH.Registre los espectros EPR de las muestras en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros utilizando el espectrómetro EPR de banda L. Para preparar la sonda RSSR sensible al GSH, disuelva 4,05 miligramos de la sonda en un mililitro de solución de DMSO. A continuación, determine el valor de la constante de velocidad de la reacción de RSSR con GSH.Para ello, primero añada 20 microlitros de la solución madre RSSR a 0,98 mililitros de un milímetro de tampón de fosfato pH 7,2, cloruro de sodio 150 milimolares para obtener una solución de sonda RSSR de 0,2 milimolares. A continuación, mezcle volúmenes iguales de solución RSSR de 0,2 milimolares en una de las soluciones de GSH para obtener una concentración final de la sonda de 0,1 milimolar y de GSH de 0,5, uno o 2,5 milimolares. Inmediatamente después de mezclar la solución de RSSR y GSH, coloque la muestra en el resignador EPR y registre los espectros EPR cada 12 segundos durante 10 minutos.A continuación, calcule la cinética del aumento de la amplitud espectral monorradical para la sonda HOPE multifuncional para la evaluación del pH del oxígeno y el Pi. Disuelva 10,7 miligramos de la sonda en un mililitro de solución salina y ajuste el pH a 7,4. A continuación, añada 20 microlitros de la solución madre preparada a 0,98 mililitros de solución salina para obtener una solución de sonda de 0,2 milimolares.Para la calibración del pH de la sonda, titule 0,2 milimolares de la solución de la sonda mediante la adición de un pequeño volumen de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico de modo que la dilución final de la muestra sea inferior al 1%. Para la calibración de la sonda de sensibilidad al oxígeno, adquiera espectros EPR de la sonda a varias concentraciones de oxígeno como se describe en el protocolo de texto. Para la calibración de la sonda de Pi, adquiera una muestra EPR de la sonda a varias concentraciones de fosfato.Utilice la solución radical con un valor de pH cercano a la PKA y puntúela con varias concentraciones de fosfato. Mantenga la temperatura y la composición del gas como antes. En el caso del modelo tumoral MET1 para la internalización de la sonda de partículas en células MET1, se añadan 100 microlitros de la suspensión sonicada a un matraz T75 con 10 mililitros de medio de cultivo que contenga células MET1.Todos los procedimientos se llevan a cabo en una cabina de bioseguridad y el medio contiene penicilina y estreptomicina para minimizar la posible infección. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 72 horas o hasta que alcancen aproximadamente el 80% de confluencia. Aspire el medio y lave las células cinco veces con 10 mililitros de PBS.Separe las celdas con cinco mililitros de tripson EDTA. Después de recolectar las células y centrifugar como antes, tiña la muestra de células con el colorante de exclusión para determinar la viabilidad y la cantidad celular. Suspender las células a una concentración de un millón de células por cada 100 microlitros en un DMEM mínimo.Usando una jeringa de insulina, inyecte lentamente 100 microlitros de la suspensión celular que contiene los microcristales internalizados en las almohadillas de grasa mamaria número cuatro de un ratón hembra de tipo salvaje de ocho semanas de edad, como se describe en el protocolo de texto. Monitorear el inicio y el crecimiento del tumor. Para las mediciones espectroscópicas de EPR, anestesiar a los ratones mediante la inhalación de una mezcla de aire e isoflorano utilizando una máquina de anestesia como se describe en el protocolo de texto.Realice mediciones funcionales utilizando un espectrómetro EPR de banda L colocando el resignador de bobina de superficie sobre una glándula mamaria normal o un tumor mamario. Proceda a sintonizar el espectrómetro. En el caso de sondas solubles, adquiera los espectros EPR inmediatamente después de la inyección de la sonda durante cinco a 10 minutos.Adquiera los espectros EPR de la sonda de partículas implantada durante cinco a 10 minutos durante varias semanas después de la implantación. Por último, analice los espectros EPR y las sondas tal y como se describen en el protocolo de texto. Aquí se muestra la sensibilidad espectral EPR de la sonda de LiNc-BuO de partículas al oxígeno.El espectro EPR se midió al 0% de la pO2 y a 37 grados Celsius. Se muestran los dependientes representativos del ancho de línea del espectro EPR de la suspensión de la sonda en la presión parcial de oxígeno. El ancho de la línea aumenta linealmente con pO2.Un espectro medido en el tejido tumoral mamario de una hembra de ratón anestesiada corresponde a un tejido con oxígeno parcial de 7,5 milímetros de mercurio. Los espectros EPR de banda L de la solución de sonda NR se adquirieron a 37 grados Celsius a varios niveles de pH. Se trazan los dependientes de la constante de división hiperfina observada en el pH y se ajustan con la curva de valoración estándar.Aquí se muestra la evaluación multifuncional del microambiente tumoral que combina la sonda LiNc-BuO sensible al oxígeno en la sonda de pH de doble función en la sonda NR redox. El espectro triplete observado del NR se superpone con la única línea EPR de la sonda LiNc-BuO incrustada dentro del tumor. Aquí se muestra la evaluación in vivo de la EPR de las concentraciones de glutatión en los tejidos intracelulares.Se muestra la cinética del cambio de intensidad espectral monorradical medido por EPR en banda L en tumor mamario en glándula mamaria normal de ratones FVBN inmediatamente después de la inyección intratissual de la sonda RSSR. La cinética más rápida refleja la mayor concentración de GSH en el tejido tumoral. La técnica ayuda a los investigadores en el campo de la investigación del cáncer con una oportunidad insuperable para la realización in vivo de parámetros fisiológicos celulares importantes del microambiente tumoral y el transpotencial para la traducción.La sensibilidad de las sondas de acuerdo con los procedimientos anteriores requiere experiencia en química sintética y es fundamental para la presentación. Nuestro centro informó de la dificultad de esta tecnología y a los sitios de forma colaborativa.

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Investigación

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Cancer Research

Investigación del cáncer

Imágenes de bioluminiscencia de inducible por hipoxia-1α factor de actividad se aplica al seguimiento del desarrollo de la hipoxia tumoral intracraneal en un modelo de ratón de cáncer de mama metástasis cerebrales.

Imágenes in vivo de tumores bioluminiscencia Dinámica hipoxia de la metástasis cerebral cáncer de mama en un modelo de ratón

Aquí, la monitorización en tiempo real del metabolismo de las células tumorales, combinada con un modelo de metástasis de membrana corioalantoidea (CAM) de embrión de pollo in vivo, se utiliza para evaluar nuevos objetivos/agentes anticancerígenos por su capacidad para sensibilizar las células tumorales a los quimioterapéuticos que dañan el ADN.

Evaluación de la efectividad del medicamento para el cáncer Sensibilización<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Un método nuevo de resonancia paramagnética electrónica (EPR), rápidos de escaneo de EPR (RS-EPR), se demuestra para la imagen espacial espectral 2D que es superior a la técnica tradicional de onda continua (CW) y abre nuevos lugares para formación de imágenes in vivo. Los resultados se demostraron a 250 MHz, pero la técnica es aplicable a cualquier frecuencia.

El rápido escaneo de electrones resonancia paramagnética abre nuevas vías para Imaging fisiológicamente parámetros importantes<em&gt; En Vivo</em

Este manuscrito describe el desarrollo de un modelo animal que permite probar directamente los efectos de la hipoxia tumoral sobre la metástasis y descifrar los mecanismos de su acción. Aunque los experimentos que se describen aquí se centran en el sarcoma de Ewing, se puede aplicar un abordaje similar a otros tipos de tumores.

Modelo In Vivo para Pruebas Efecto de la hipoxia sobre la metástasis tumoral

Describimos una invasiva en vivo imagen protocolo que es sencilla y económica, utilizando L-012, un análogo de quimioluminiscente luminol, para visualizar y cuantificar las especies de oxígeno reactivo (ROS) generadas en un modelo de ratón por escisión de la herida.

En Vivo Proyección de imagen de especies reactivas de oxígeno en un murino herida modelo

Espectroscopia de resonancia paramagnética (EPR) del electrón es un método inequívoco para medir a los radicales libres. El uso de puntas de prueba de giro selectivo permite la detección de radicales libres en diferentes compartimentos celulares. Se presenta un método práctico y eficiente para recolectar muestras biológicas que facilitan el tratamiento, almacenamiento y transferencia de muestras para mediciones de EPR.

Uso de resonancia paramagnética electrónica en muestras biológicas a temperatura ambiente y 77 K

Describimos dos métodos para evaluar la permeabilidad vascular transitoria asociada con el microambiente tumoral de la función de la puerta de metástasis (TMEM) y la intravasación de células cancerosas mediante inyección intravenosa de dextran de alto peso molecular (155 kDa) en ratones. Los métodos incluyen imágenes intravitales en animales vivos y análisis de tejido fijo utilizando inmunofluorescencia.

Evaluación del microambiente tumoral de la permeabilidad vascular mediada por la puerta de la puerta asociada con la diseminación de células cancerosas mediante imágenes intravitales y análisis de tejido fijo

Desarrollamos un método reproducible para visualizar la internalización del trifosfato de adenosina fluorescente no hidrolizable (ATP), un sustituto de ATP, con alta resolución celular. Validamos nuestro método utilizando ensayos independientes in vitro e in vivo: líneas celulares tumorales humanas y ratones inmunodeficientes xenoinjertados con tejido tumoral humano.

Microscopía de fluorescencia para internalización de ATP mediada por macropinocitosis en células tumorales humanas y ratones xenoinjertados con tumores

Describimos un protocolo para la producción, cultivo y visualización de cánceres humanos, que han hecho metástasis a las superficies peritoneales. Las muestras tumorales resecadas se cortan con un vibratomo y se cultivan en insertos permeables para aumentar la oxigenación y la viabilidad, seguidas de imágenes y análisis posteriores mediante microscopía confocal y citometría de flujo.

Cultivo e imágenes de cortes tumorales organotípicos ex vivo de pseudomixoma peritonei a partir de muestras tumorales humanas resecadas

Se obtuvieron imágenes cuantitativas de mapas cuantitativos de oxígeno en 3D de tumores murinos de forma no invasiva mediante resonancia paramagnética de electrones de pulso. Para la anatomía y la estructura vascular se utilizaron el ultrasonido en modo B y el Doppler de potencia. Las imágenes de ambas modalidades se superpusieron para el análisis tumoral multiparamétrico.

Evaluación de la hipoxia tumoral: imágenes de oxígeno en 3D in vivo mediante resonancia paramagnética electrónica 

Aprende a evaluar el microambiente tumoral mediante resonancia paramagnética electrónica in vivo en modelos murinos de cáncer de mama. Esta técnica cuantifica oxígeno, pH y glutatión de forma no invasiva.

En Vivo EPR evaluación de pH, pO₂, estado Redox y concentraciones de fosfato y glutatión en el microambiente tumoral

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