Name: Síntesis de monocito-targeting Peptide Amphiphile micelas para la proyección de imagen de la aterosclerosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende a sintetizar micelas de péptidos anfifílicos dirigidas a monocitos para mejorar la imagenología de la aterosclerosis. Este método permite diferenciar entre lesiones tempranas y avanzadas con mayor especificidad diagnóstica.

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Los autores desean reconocer el apoyo financiero de la Universidad de California del sur, el corazón nacional, pulmón y sangre Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli y Edythe amplio Premio a la innovación y el L.K. Whittier Fundación no-cáncer Premio investigación traslacional al EJC. Los autores agradecen el centro de microscopía electrónica y microanálisis, centro de excelencia en NanoBiophysics, centro de excelencia para la caracterización Molecular y traslacional Imaging Center en la Universidad de California meridional para asistencia en configuraciones instrumentales.

Nota: Lea la MSDS de reactivos y siga todas las medidas de seguridad química según lo requerido por la institución local.
1. preparación de PAMs de MCP-1
<ol><li>
Preparación de péptido de MCP-1
	<ol>
<li>Pesar 0.25 mmol de Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang en un recipiente de reacción (RV). Enjuague la parte de la caravana con 5 mL dimethylforamide (DMF) en una campana de humos químicos.</li>
		<li>La RV a un sintetizador de péptidos automatizada de banco de carga. Frascos de ácido aminos pre-empacados, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', de la C a N-terminal de carga. Incluye un frasco vacío en el extremo para el paso de la final de la desprotección. Nota: Un péptido codificado por secuencia, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', puede también ser sintetizado utilizando el mismo protocolo.</li>
		<li>Una vez terminada la síntesis, transferencia los péptidos en la resina de la RV para el vial de centelleo con 2-3 mL de metanol hasta que todas las resinas son transferidos. Después de la resina se ha hundido hasta el fondo, retire el sobrenadante de metanol y se evapore el resto hasta que se seque. Aspiradora seco por un adicional 2 h o durante la noche a temperatura ambiente.</li>
		<li>Hacer solución de escote de 12 mL que contiene:ethanedithiol:water:triisopropylsilane de (TFA) ácido trifluoracético 94:2.5:2.5:1 vol % en una campana de humos químicos. Agitar la solución escote para asegurarse que está mezclado uniformemente. PRECAUCIÓN: Porque Triisopropilsilano y Etanoditiol son sensibles al aire, argón purgar frascos de stock de Triisopropilsilano y Etanoditiol para 1 minuto antes de volver a ponerlos.</li>
		<li>Coloque el recipiente de síntesis (SV) en una coctelera de brazo de sujeción en la parte inferior de la mitad de la SV. Transferencia de resina de péptido a la SV con 2 mL de solución de escote hasta que todas las resinas del péptido se transfieren.</li>
		<li>Lavar los lados del SV con 3 mL de solución de escote. Cierre la tapa de la SV y sacuda a 300 oscilaciones/min durante 4 h.</li>
		<li>Pesar un tubo de centrífuga de 50 mL vacía. Registrar la masa.</li>
		<li>Después de 4 h, vaciar la solución del peptide hendido de la SV en el tubo de centrífuga de 50 mL. Enjuague el SV varias veces con la solución restante del escote.</li>
		<li>Se evaporan peptide hendido solución con nitrógeno hasta que haya menos de 4 mL en el tubo de centrífuga.</li>
		<li>Añadir 36 mL de éter helada a la solución de péptido-hendida.</li>
		<li>Vórtice la solución hasta que es totalmente blanco o amarillo. Centrifugar a 3.000 x g durante 5 min a 4 ° C y decantar el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 40 mL de éter de helada en el tubo. Vórtice y someter a ultrasonidos otra vez. Repita el proceso de centrifugación. Decantar el sobrenadante.</li>
		<li>Secar el pellet PA crudo con purga con gas nitrógeno hasta que el éter se evapora visiblemente.</li>
		<li>Añadir 20 mL de agua de doble agua, vortex y someter a ultrasonidos hasta que el péptido se disuelve completamente en solución.</li>
		<li>Congelación de la solución y liofilizar hasta que se seque.</li>
		<li>Una vez que el péptido es secado, pesar la masa del tubo de centrífuga que contiene el péptido crudo. Disolver el péptido crudo en 5 mg/mL de agua.</li>
		<li>Disolver 25 mg de crudo péptido de MCP-1 en 5 mL de agua destilada doble para hacer una concentración total de 5 mg/mL. Purificar el péptido de MCP-1 crudo por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con 0,1% TFA en el agua (solvente A) y 0.1% TFA en acetonitrilo (solvente B) como fases móviles en una columna de fase reversa C8. Inyectar lo 5 mL del péptido en el HPLC. Nota: La fase móvil inicial consistió en 100% de disolvente A en un caudal de 9,0 mL/min reducir solvente A lentamente a 30% en el minuto 27 y sostenga en este composición para 3 minutos regreso el degradado 100% solvente A 3 min y sostenga en este composición para 1 minuto dar una duración total de 34 minutos mantener la temperatura de la columna a 55 ° C. Utilice el modo de fuente de iones positivos para el análisis. El ácido fórmico puede usarse en lugar de TFA, si TFA es demasiado ácida para la columna HPLC. Se recomienda que la velocidad de rampa de composición solvente orgánica no debe superar 2%/min para una mejor separación.</li>
		<li>Analizar cada fracción usando espectrometría de masas (MALDI) de desorción/ionización láser asistida por matriz para el producto esperado m/z en 2.890. Nota: Disolver el ácido α-ciano-4-hidroxicinámico en 1 mg/mL, en acetonitrilo/agua (50: 50 vol %) como la solución de la matriz. Punto 0,75 μl de solución de la matriz en la placa MALDI, seguida de 0,75 μl de cada fracción. Llevar a cabo el análisis utilizando el modo ion reflexivo positivo en un total rango de 500-5.000 Da.</li>
		<li>Combinar fracciones de producto, descargue acetonitrilo, congelar y liofilizar péptidos purificados hasta que se seque.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de MCP-1 PA
	<ol>
<li>Preparar un 1.1 exceso molar de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maleimida al péptido en viales de centelleo separados. Disolver ambos compuestos en agua doble destilada para hacer ~ 15 mg/mL. Someter a ultrasonidos durante 15 min o hasta que ambas soluciones son totalmente claras. Nota: DSPE-PEG (2000)-Cy5 es sintetizada usando el mismo protocolo con DSPE-PEG (2000)-amina y Cy5 funcionalizados éster N-hydroxysuccinimide (NHS), excepto el paso 1.2.3, donde el pH de la solución se ajusta a 8.5.</li>
		<li>Agregue una solución de (2000)-maleimida DSPE PEG a la solución del péptido. Vórtice y someter a ultrasonidos.</li>
		<li>Añadir 1 M NaOH gota a gota (1 μl) en un momento hasta que el pH de la solución es 7.</li>
		<li>Solución de purga de nitrógeno para 5 minutos agitar la solución durante la noche.</li>
		<li>Congelación de la solución y liofilizar hasta que se seque.</li>
		<li>Una vez que el producto crudo es secado, disolver el sólido en 5 mg/mL de agua.</li>
		<li>Purificar con HPLC como se describió anteriormente. Nota: Péptido no conjugada y DSPE-PEG(2000) deben eluir entre 15-30% concentración orgánica (vol %), mientras que DSPE-PEG (2000)-MCP-1 conjugado debe eluir entre 40-50% de concentración orgánica.</li>
		<li>Analizar cada fracción usando espectrometría de masa MALDI la correspondiente m/z. DSPE-PEG (2000)-MCP-1 debe tener un pico amplio m/z en 5.760. Nota: el ácido 2, 5-dihydroxybenzoic se utiliza mejor como matriz para DSPE-PEG (2000)-MCP-1 con MALDI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Asamblea de PAMs de MCP-1
	<ol>
<li>Disolver 1,75 mg PAs de MCP-1 con 3 mL de metanol en un frasco de 1 dram. Someter a ultrasonidos hasta el PA de MCP-1 se haya disuelto completamente. Nota: Cy5 Anfífilos pueden incorporarse en una proporción molar de 10:90 MCP-1 PA para aplicaciones.</li>
		<li>Evapore el metanol bajo nitrógeno en un movimiento circular mientras se aclara el metanol restante del lado de la cubeta hasta que se forma una película uniforme en la parte inferior del frasco. Secado de vacío la película durante la noche.</li>
		<li>Hidratar la película con 3 mL de agua o fosfato buffer salino (PBS) para hacer una solución de 100 μm de PAMs de MCP-1. Suavemente vortex y someter a ultrasonidos la solución hasta el claro. Incubar a 80 ° C por 30 minutos. Nota: La temperatura elevada se ha demostrado para acelerar el proceso uno mismo-Asamblea y permite que el componente del péptido formar la estructura secundaria más estable, reduciendo la micelar crítica (CMC) de concentración42,43.</li>
		<li>Enfríe la dispersión resultante a la temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Caracterización de PAMs de MCP-1
<ol><li>
Dispersión ligera dinámica (DLS) y potencial zeta
	<ol>
<li>Coloque 100 μm de MCP-1 PAM o PAM revuelta en una cubeta siguiendo las instrucciones del instrumento potencial DLS o zeta. Nota: Cubetas potencial DLS y zeta pueden ser diferentes basado en las instrucciones del instrumento.</li>
		<li>Equilibrar el instrumento a la temperatura ambiente. Medir el tamaño y la carga superficial del PAM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
	<ol>
<li>Añadir 7 μl de 50 μm PAM de MCP-1 o PAM revuelta hacia una rejilla TEM suspendido dentro de una pinza de cierre automático por 5 min mecha la gota con un trapo de tarea delicada.</li>
		<li>Añadir 7 μl de agua para lavar la rejilla. Mecha a la gota.</li>
		<li>Añadir 7 μl de 1 wt % fosfotúngstico de ácido durante 2 min mecha la gota. Repetir el punto 2.2.2.</li>
		<li>Secar la rejilla TEM antes del análisis TEM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Espectroscopía de dicroísmo circular (CD)
	<ol>
<li>Encienda el nitrógeno durante 5-10 minutos antes de utilizar el instrumento.</li>
		<li>Coloque 300 μL del blanco (agua o PBS) en cubeta.</li>
		<li>Medir espectros en 190-265 nm, camino de 0,2 mm de longitud con un tiempo de integración de 1 s y un ancho de 1 banda nm en temperatura ambiente. Recoger 3 repeticiones.</li>
		<li>Medida 100 μm de péptido de MCP-1, MCP-1 PAM, revueltos de péptido y revueltos PAM bajo la misma condición descrita en el paso 2.3.3. Restar el espacio en blanco.</li>
		<li>Ajuste los datos mediante una interpolación lineal de los espectros de base polylysine.</li>
		<li>Apagar el instrumento. Espere 10 minutos antes de apagar el nitrógeno.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. análisis in Vitro de PAMs de MCP-1
<ol><li>
In vitro de biocompatibilidad
	<ol>
<li>Cultura y ampliar WEHI 274.1 murinos monocitos en modificado Eagle suplementado de Dulbecco con 10% suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina y 0,05 mM 2-Mercaptoetanol en 37 ° C debajo del 5% de CO2 al paso 5. Nota: WEHI 274.1 son células de suspensión. Al cultivo, los medios de comunicación deben ser reemplazados cada 2-3 días.</li>
		<li>Monocitos de pipeta en los medios de comunicación en un tubo de centrífuga estéril 50 mL. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Aspirar viejos media y resuspender en medio fresco 10 mL en el tubo de centrífuga. Mezcla lentamente hasta que las células se distribuyen uniformemente en los medios de comunicación. Contar las células con tinción de azul de tripano y un hemocitómetro.</li>
		<li>Diluir las células que hay 4.000 monocitos por 90 μl de medio por pozo. Agregar 90 μl de células en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Incubar durante 24 h. Nota: Evite el uso de los pozos en el borde exterior de la placa para evitar diferencias en la evaporación y cambios térmicos en la placa. Se llenan los pocillos exteriores 100 μl PBS.</li>
		<li>Disuelva 0.15 μmol de péptido MCP-1, MCP-1 PAM, péptido codificado o revueltos-PAM en 150 μL PBS en tubos de microcentrífuga separado, esterilizado. Realice la dilución serial para hacer 65 μl de 1, 10 y 100 μm de cada muestra.</li>
		<li>Añadir 10 μl PBS de cada concentración en pocillos que contengan 274.1 WEHI (volumen total: 100 μl por pozo, 6 líneas, 96 pocillos total). Incuban durante 72 h.</li>
		<li>Añadir 10 μl (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) en cada pocillo. Incubar durante 1 h.</li>
		<li>Analizar la absorbancia utilizando un lector de placas a 490 nm o en base a las instrucciones del fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
In vitro el enlace de la micela
	<ol>
<li>Monocitos de semilla 500.000 en cada pocillo de una placa de 6 pozos en 2 mL de medio conteniendo 100 μm marcado con Cy5 PAM de MCP-1 (fracción molar 10:90 DSPE-PEG (2000)-Cy5 y MCP-1 PA). Incubar durante 1 h.</li>
		<li>Recoger WEHI 274.1 por centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspire los medios de comunicación.</li>
		<li>Suspender y lavar las células en 2 mL de PBS. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspire el PBS. Repita el proceso de lavado con 2 mL de PBS. Aspire el PBS.</li>
		<li>Añadir 2 mL de frío paraformaldehído al 4% para fijar las células. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
		<li>Pipetear las células fijas en un cubreobjetos de vidrio estéril dentro de pocillos de una placa de 6 pozos. Centrifugar a 400 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Retire el paraformaldehído. Lave y enjuague una vez con 2 mL de PBS. Suspender con 1 mL PB Nota: Al enjuagar, evitar interrumpir las células sobre cubreobjetos.</li>
		<li>Coloque 10 μl de glicerol 90% en PBS en una diapositiva. Use una aguja y pinzas para recoger el cubreobjetos. Secar el borde del cubreobjetos. Coloque con cuidado el cubreobjetos sobre un portaobjetos boca abajo.</li>
		<li>Cierre suavemente el borde del cubreobjetos con el pulimento de clavo claro. Coloque en el refrigerador hasta que esté listo para la proyección de imagen.</li>
		<li>Utilizar un láser confocal de barrido microscopio (CLSM) instalado con láseres para Cy5 λexcitación = 650 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

PAMs de MCP-1 es una plataforma de proyección de imagen molecular prometedora, que consiste en un péptido targeting hidrofílica y cola hidrofóbica que impulsa la naturaleza uno mismo-montada de la nanopartícula. Esta micela metas de monocitos puede prepararse por síntesis simple y pasos de la purificación de la MCP-1 péptido DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs tienen muchas características beneficiosas para en vivo imagen molecular como su autoensamblaje bajo condiciones suaves, Biodegradabilidad intrínseca y diversidad...

Las enfermedades cardiovasculares están pendientes de las principales causas de muerte a nivel mundial con aproximadamente 17,3 millones de muertes en todo el mundo1. Las enfermedades cardiovasculares son aportadas por la ateroesclerosis, una condición en la que las placas se acumulan en las arterias, la sangre de tal modo inhibiendo y el flujo de oxígeno a las células del cuerpo2,3. La progresión de la ateroesclerosis consiste en el engrosamiento y endurecimiento de las arterias por una acumulación de placa, lleva a placa4,de ruptura e infarto de miocardio5, respuesta inflamatoria y metabolismo lipídico irregular. Las células endoteliales expresan moléculas de citocinas y de la adherencia, como MCP-1 que enlaza con el C-C chemokine receptor (CCR2) encuentran en la superficie de monocitos6,7,8. Colesterol oxidado convierte monocitos en macrófagos durante la etapa temprana de formación de la placa, que amplifica la respuesta inflamatoria en la región y lleva a la lesión tisular y la formación de placas inestables o vulnerables9, 10.
Tradicionalmente, la ateroesclerosis se evalúa mediante la evaluación de estenosis luminal por la proyección de imagen anatómica con ecografía o angiografía11,12. Sin embargo, estos métodos pueden determinar sólo estrechamiento severo de la pared arterial y no la etapa temprana de la aterosclerosis, como causas de crecimiento de la placa inicial remodelado arterial mantener el tamaño de la arteria y de la sangre flujo tasa12,13, 14. Por lo tanto, los angiogramas ricas prevalencia de ateroesclerosis. Además, técnicas de imagen no invasivas como la sola emisión del fotón computan la tomografía, tomografía por emisión de positrones y la resonancia magnética se han utilizado recientemente para caracterizar la morfología de la placa como pueden proporcionar información inicial y caracterización de las placas. Sin embargo, estas modalidades son limitadas a menudo por la falta de sensibilidad, resolución espacial, o requieren el uso de radiaciones ionizantes, que imagen progresión de placa en diferentes etapas mucho más desafiante15,16, 17. Un sistema de entrega imagen que identificara concretamente las placas en diferentes etapas de la aterosclerosis es a desarrollar.
Las nanopartículas han demostrado ser una plataforma emergente para en vivo placa orientación y diagnóstico18,19,20,21. En particular, PAMs son ventajosas debido a su diversidad química y capacidad para acomodar una variedad de grupos, composiciones, tamaños, formas y funcionalización de superficies22. Péptido Anfífilos (PAs) consiste en un péptido "headgroup hidrofílico," unido a una cola hidrofóbica, que suelen ser lípidos; Esta estructura anfifílicas confiere capacidades de uno mismo-montaje y permite una visualización multivalente de péptidos en la superficie de la partícula22,23,24. El péptido contiene puede afectar la forma de la partícula a través de plegables y el hidrógeno de la vinculación entre péptidos25. Péptidos que se dobla a través de la interacción β-hoja han demostrado formar micelas alargadas, mientras que α-helicoidal confirmación puede formar dos micelas esféricas y alargada22,23,24, 2526,de,27. Enlazadores de polietilenglicol (PEG) que proteja la carga superficial del péptido pueden colocarse entre el péptido hidrofílico y cola hidrofóbica de PAMs, mejorar la disponibilidad de la nanopartícula en circulación sistémica28, 29 , 30 , 31. PAM también es ventajosa porque son biocompatibles y se ha demostrado que tienen una amplia gama de aplicaciones32,33. La solubilidad en agua de micelas ofrece una ventaja sobre otros sistemas basados en nanopartículas como ciertas nanopartículas poliméricas que no son solubles en agua y tienen que ser suspendido en solubilizantes para inyecciones34. Además, la habilidad de crear PAMs que desmontarán en respuesta a un estímulo específico hace PAM un candidato atractivo para la entrega controlada de drogas intracelular35.
Por Unión al receptor CCR2 y acumulando en el arco aórtico, PAMs fueron desarrolladas previamente para monocitos targeting para monitorear las diferentes etapas de las lesiones ateroscleróticas en la aorta9. En ratones ApoE- / - acumulación de monocitos aumenta proporcionalmente a la progresión de placa36. Además, se encontró que los pacientes con placas propensas a la ruptura, última etapa contienen altas cantidades de monocitos37. Por lo tanto, la modificación de los PAMs para incorporar MCP-1 es útil porque permite mayor especificidad segmentación y diferenciación entre las lesiones ateroscleróticas de etapa temprana y tardía. Estos estudios de prueba de concepto también verificaron que la PAMs son lo suficientemente seguras como ser utilizado pre-clinically y se borran renally38. Puesto que los monocitos y la inflamación son característicos de otras enfermedades, PAMs de MCP-1 tienen el potencial de ser utilizado para los usos terapéuticos y de diagnósticos en otras enfermedades más allá de ateroesclerosis8,39,40 , 41.
Adjunto, divulgamos la fabricación altamente escalable y uno mismo-montado PAMs de MCP-1 que demostró tamaño óptimo de partícula, carga superficial y focalización selectiva a monocitos para aplicaciones de imágenes mejoradas en la aterosclerosis.

<table><tbody><tr><td>1,2-etanedithiol</td><td>VWR</td><td>E0032</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>10 mL pipetas serológicas desechables</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 mL, polipropileno</td><td>VWR</td><td>89401-566</td><td>para diversas aplicaciones</td></tr><tr><td>Ácido 2,5-dihidroxibenzoico, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC165200050</td><td>para MALDI</td></tr><tr><td>25 mL desechable pipetas serológicas</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol, 50 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>5 mL pipetas serológicas desechables</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>para diversas aplicaciones</td></tr><tr><td>matraz de cultivo de 75 cm2</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-65</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>Recipiente de reacción de 75 ml</td><td>Protein Technologies</td><td>3000005</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 96 pocillos</td><td>VWR</td><td>40101-346</td><td>para ensayo MTS</td></tr><tr><td>Acetonitrilo, grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998SK-4</td><td>para purificación por HPLC</td></tr><tr><td>Vidrio de borosilicato, 1 dram</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>para síntesis de PAM</td></tr><tr><td>Pipeta de vidrio de borosilicato, puntas largas</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>para diversas aplicaciones</td></tr><tr><td>Cubreobjetos, 0,16-0,19 mm, 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td>para microscopía confocal</td></tr><tr><td>Amina Cy5</td><td>Abcam</td><td>ab146463</td><td>para la conjugación de péptidos</td></tr><tr><td>Éter dietílico, grado ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td>para precipitación de péptidos</td></tr><tr><td>Desechable jeringas, 20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td>para purificación por HPLC</td></tr><tr><td>Hemocitómetro con regla de Neubauer doble</td><td>VWR</td><td>63510-13</td><td>para recuento de células</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) amina</td><td>Avanti</td><td>880128P</td><td>para la conjugación de péptidos</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) maleimida</td><td>Avanti</td><td>880126P</td><td>para la conjugación de péptidos</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000)-NHS ester&nbsp;</td><td>Nanocs</td><td>PG2-DSNS-10K</td><td>para conjugación con Cy5</td></tr><tr><td>Águila modificada de Dulbecco glucosa media-alta</td><td>Sigma</td><td>Aldrich D5796-500ML</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, calificado, inactivado por calor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10438026</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ala-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-A</td><td>para la síntesis</td></tr> <tr><td>de péptidosFmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-RBF</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-NT</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-CT</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-QT</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ile-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-I</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Leu-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-L</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-KBC</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-F</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-SB</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-TB</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-YB</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Val-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-V</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Resina Fmoc-Lys(Boc)-wang, malla 100-200</td><td>856013 Novabiochem</td><td></td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Ácido fórmico, grado óptimo LC/MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td>para la purificación por HPLC</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>VWR</td><td>M152-1L</td><td>para microscopía confocal</td></tr><tr><td>Contador manual</td><td>Fisher Scientific</td><td>S90189</td><td>para el recuento de células</td></tr><tr><td>Barras de agitación magnéticas, en forma de huevo</td><td>VWR</td><td>58949-006</td><td>para la conjugación de péptidos</td></tr><tr><td>Metanol, certificado por la ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>para la síntesis de PAM</td></tr><tr><td>Proliferación celular MTS kit de ensayo colorimétrico</td><td>VWR</td><td>10191-104</td><td>para ensayo MTS</td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamida, grado de secuenciación</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>N-Metilmorfolina</td><td>Protein Technologies</td><td>S-1L-NMM</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416780250</td><td>para la fijación de células</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>para diversas aplicaciones</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina, 10.000 U/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>Recipiente de síntesis de péptidos, 25 mL& nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>CG186011</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Ácido fosfotúngstico &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A248-25</td><td>para TEM</td></tr><tr><td>Espectro de piperidina</td><td></td><td>P1146-2.5LTGL</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de vidrio liso 75 x 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>para microscopía confocal</td></tr><tr><td>Depósitos de reactivos, estériles&nbsp;</td><td>VWR</td><td>95128093</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>Pinza de cierre automático</td><td>TedPella</td><td>515</td><td>para TEM</td></tr><tr><td>Película de soporte TEM</td><td>TedPella</td><td>01814F</td><td>para TEM</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP618-500</td><td>para la escisión de péptidos y la purificación por HPLC</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano</td><td>VWR</td><td>TCT1533-5 ml</td><td>para la escisión de péptidos Solución de</td></tr><tr><td>azul de tripán, 0,4 %</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td>para el recuento de células</td></tr><tr><td>Pinza, dentada de uso general</td><td>VWR</td><td>231-SA-SE</td><td>para microscopía confocal</td></tr><tr><td>WEHI-274.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp; CRL-1679</td><td>monocito murino</td></tr><tr><td>sintetizador de péptidos de sobremesa</td><td>automatizado Protein Technologies</td><td></td><td>PS3 Sintetizador de péptidos de sobremesa</td></tr><tr><td>&alpha;- ácido ciano-4-hidroxicinámico, 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>476870-2G</td><td>para MALDI</td></tr></tbody></table>

síntesis de monocito-targeting peptide amphiphile micelas para la proyección de imagen de la aterosclerosis

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

La ateroesclerosis es una importante contribución a las enfermedades cardiovasculares, la principal causa de muerte en todo el mundo, que afirma 17,3 millones de vidas anualmente. La aterosclerosis es también la principal causa de muerte súbita e infarto de miocardio, instigado por las placas inestables que se rompen y ocluyan los vasos sanguíneos sin previo aviso. Corriente de las modalidades de la proyección de imagen no puede diferenciar entre placas estables e inestables que la ruptura. Micelas de Anfífilos péptido (PAMs) pueden superar esta desventaja puede ser modificado con una variedad de dirigidos a grupos que se unen específicamente al tejido enfermo. Monocitos han demostrado ser marcadores tempranos de la aterosclerosis, mientras que la gran acumulación de monocitos se asocia con placas propensas a la ruptura. Por lo tanto, nanopartículas que pueden dirigirse a monocitos pueden utilizarse para discriminar diferentes etapas de la aterosclerosis. Para ello, aquí, se describe un protocolo para la preparación de monocito-PAMs (monocito chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). PAMs de MCP-1 uno mismo-se ensamblan a través de síntesis condiciones suaves en forma de nanopartículas de 15 nm de diámetro con cerca de carga superficie neutra. In vitro, PAM fueron encontrada para ser biocompatible y tenían una alta afinidad para monocitos. Los métodos descritos en este documento muestran promesa para una amplia gama de aplicaciones en la aterosclerosis, así como otras enfermedades inflamatorias.

Preparación del PAM de MCP-1 El motivo del CCR2-enlace (residuos 13-35) de la proteína MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] o péptido codificado [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] fue modificado mediante la adición de un residuo de cisteína en el N-terminal. El péptido de MCP-1 fue sintetizado por un método de fase sólida Fmoc-mediada mediante un sintetizador de péptidos automatizada. El péptido crudo fue purificado por HPLC fase inversa en una columna C8 a 50 ° C con 0.1% TFA en mez...

Este documento presenta un método que implica la síntesis y caracterización de micelas de amphiphile péptido monocito-targeting y los correspondientes ensayos para prueba de biocompatibilidad y capacidad de la micela a monocitos.

Síntesis de monocito-targeting Peptide Amphiphile micelas para la proyección de imagen de la aterosclerosis

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

El objetivo general de este protocolo es sintetizar micelas de anfifílicos peptídicos dirigidos a monocitos para la obtención de imágenes de aterosclerosis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo cardiovascular sobre el diagnóstico por imagen de la placa aterosclerótica. La principal ventaja de esta técnica es que la incorporación de micelas de anfifílos peptídicos con MCP-1 permite una mayor especificidad de diana y diferenciación entre lesiones ateroscleróticas tempranas y tardías.Las implicaciones de esta técnica se extienden al diagnóstico de la placa en diferentes estadios de la aterosclerosis, ya que los pacientes con placas propensas a la rotura en estadio tardío contienen un mayor número de monocitos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la aterosclerosis, también se puede aplicar a otras enfermedades, como el cáncer. Demostrando el procedimiento conmigo estará Jonathan Wang, un estudiante graduado de nuestro laboratorio.Comience pesando 0,25 milimoles de resina fmach-L-lisina-bach-wong en un recipiente de reacción. Transfiera el recipiente a una campana de gases químicos y enjuague los lados del recipiente con cinco mililitros d

synthesis-monocyte-targeting-peptide-amphiphile-micelles-for-imaging

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Bioengineering

Bioingeniería

Para demostrar la imagen molecular del cáncer de MR con un pequeño péptido agente de contraste de MRI específica a las proteínas plasmáticas coagulados en estroma tumoral en un modelo de cáncer de próstata de ratón dirigido.

MR Imagen Molecular del cáncer de próstata con un agente de contraste dirigidos Pequeño Molecular CLT1 Péptido

Un ejemplo de un fármaco de nano a base de ácido polimálico se presenta hacia el diseño racional de la medicina personalizada que es aplicable al cáncer. En él se describe la síntesis de un fármaco nano para tratar el cáncer de mama HER2-positivo humano en un ratón desnudo.

Biopolímeros Nano basados ​​en ácido polimálico de Focalización de múltiples Marcadores tumorales: una oportunidad para la medicina personalizada?

Mostramos la preparación y abordamos la viabilidad de vehículos celulares que contienen nanovarillas de oro para la obtención de imágenes fotoacústicas del cáncer.

Análisis preparación y fotoacústica de Vehículos celulares que contienen oro Nanorods

La tecnología de microondas permite la síntesis extremadamente rápido de las nanopartículas de óxido de hierro para la caracterización de placas de aterosclerosis. El uso de un aminobisfosfonato en el lado externo de la nanopartícula proporciona una acumulación rápida en el área aterosclerótica.

Síntesis microondas impulsada de nanopartículas de óxido de hierro para la detección rápida de la aterosclerosis

Para administrar fármacos contra el cáncer a sitios tumorales con alta especificidad y efectos secundarios reducidos, se requieren nuevos métodos basados en nanopartículas. Aquí, describimos micelas reticuladas de disulfuro que se pueden preparar fácilmente mediante oxidación mediada por peróxido de hidrógeno y son capaces de disociarse de manera eficiente en un entorno tumoral reductor para liberar cargas útiles.

Un enfoque Facile y eficiente para la producción de micelas reticuladas reversible disulfuro

Péptidos virales derivados juntados a conjugados de anticuerpos (ACs) es un enfoque ganando impulso debido a la posibilidad de entregar cargas moleculares con la acumulación de células de tumores aumentado. Utilizando métodos comunes para evaluar verbal de péptido, AC y acumulación intracelular de carga útil y tumor targeting, este protocolo ayuda a los investigadores durante las fases de desarrollo inicial clave.

Evaluación inicial de los conjugados de anticuerpos modificados con péptidos virales derivados para aumentar la acumulación celular y mejorar Tumor Targeting

Los monocitos son importantes mediadores de la Arteriogénesis en el contexto de la enfermedad arterial periférica. Utilizando una matriz similar a la membrana del sótano y microscopia intravital, este protocolo investiga monocito recalada y relacionados con el tumor angiogénesis después de la inyección de monocitos en el modelo murino de la ligadura de la arteria femoral.

Microscopia intravital de monocito autoguiado hacia el blanco y la angiogénesis tumorales en un modelo murino de la enfermedad Arterial periférica

Se describe un protocolo para medir la transmigración por monocitos a través de monocapas endoteliales humanas y su posterior maduración en células espumosas. Esto proporciona un método versátil para evaluar las propiedades aterogénicas de monocitos aislados de personas con diferentes enfermedades y evaluar factores en sangre que puede aumentar esta propensión.

Cuantificación de transmigración de monocitos y formación de la célula de la espuma de individuos con enfermedades inflamatorias crónicas

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la actividad quimiotáctica de los monocitos sanguíneos en modelos de ratón, para evaluar los efectos de las intervenciones nutricionales, farmacológicas y genéticas en los monocitos sanguíneos y para caracterizar los monocitos sanguíneos derivados de los macrófagos en modelos de ratón utilizando tapones de gel de membrana de sótano cargados de monocitos-quimioattractant-1 (MCP-1).

Cuantificación de la actividad quimiotáctica monocitos en Vivo y caracterización de los macrófagos derivados de monocitos sanguíneos

A continuación se describe el uso de un auto-montaje de andamios de 3 dimensiones para cultivo de células progenitoras neurales humanas. Se presenta un protocolo para liberar las células de los andamios para ser analizados posteriormente por ejemplo, mediante citometría de flujo. Este protocolo puede ser adaptado a otros tipos de células para llevar a cabo estudios detallados de manera mecánica.

Cultivo de Células progenitoras neurales en un hidrogel de péptidos 3-dimensional de auto-montaje

Aprende a sintetizar micelas de péptidos anfifílicos dirigidas a monocitos para mejorar la imagenología de la aterosclerosis. Este método permite diferenciar entre lesiones tempranas y avanzadas con mayor especificidad diagnóstica.

Síntesis de monocito-targeting Peptide Amphiphile micelas para la proyección de imagen de la aterosclerosis

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