Flujo de trabajo integral para la identificación de todo el genoma y Meta-análisis de la expresión de la familia del Gene del ATL E3 ubiquitina ligasa en Grapevine

El objetivo general de este procedimiento es lograr una caracterización exhaustiva de una familia de genes en plantas con un enfoque global que incluya la definición de la estructura del gen, los motivos de las proteínas en cuestión, la ubicación cromosómica, las duplicaciones de genes y los patrones de expresión. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la clasificación de las plantas en familias, como la identificación genómica mundial de los miembros de la familia, y su transcriptomía proporciona esto a través del análisis de la expresión génica. La principal ventaja de todo el procedimiento es proporcionar una lista exhaustiva de pasos experimentales para lograr una caracterización completa de la familia de genes.

Este procedimiento se puede aplicar a cualquier familia de genes de cualquier especie vegetal para la que se disponga de datos genéticos. Además, este enfoque proporciona información valiosa para identificar candidatos interesantes para estudios funcionales. El encargado de demostrar todo el procedimiento será Pietro Ariani, de mi laboratorio.

Abra la página web de Blast y haga clic en la sección de blastos de proteínas. En el campo Introducir secuencia de consulta, introduzca la secuencia de aminoácidos de la proteína que se utilizará como sonda para identificar a los demás miembros de la familia. Use una proteína que tenga todas las características importantes que caracterizan a la familia.

A continuación, en el campo elija conjunto de búsqueda, seleccione la base de datos de proteínas de referencia y el organismo de interés. Ahora, en la selección del programa de campo, seleccione el algoritmo PSI-BLAST. Si lo desea, haga clic en los parámetros del algoritmo para ajustar los parámetros avanzados, como la secuencia de objetivos máximos y la matriz de puntuación.

El valor E es el umbral, que para esta búsqueda se reduce de 005 a 001. Haga clic en el botón BLAST para ejecutar el análisis. De todas las secuencias que muestran coincidencias relativas a la consulta, anule la selección de las entradas que claramente no pertenecen a la familia.

Para ello, haga clic en la marca de verificación de la columna seleccionar para PSI-BLAST. A continuación, ejecute una segunda iteración de PSI-BLAST haciendo clic en el botón Ir. Todas las secuencias recién identificadas se resaltarán en amarillo.

De nuevo, anule la selección de los hits que no pertenezcan a la familia. Continúe este proceso hasta que el algoritmo no encuentre ninguna entrada relevante o alcance la convergencia. Una vez que se hayan eliminado todos los falsos positivos, recoja las secuencias de aminoácidos en un archivo con formato FASTA y cargue el archivo en el paquete de software bioinformático.

A continuación, seleccione todas las secuencias importadas de la lista y haga clic en el botón alinear/ensamblar de la barra de herramientas. A continuación, haga clic en Alineación múltiple por pares y seleccione Alineación MUSCULAR y Aceptar. La alineación ahora se realizará utilizando los valores predeterminados. Ahora visualice el logotipo de la secuencia de la alineación e inspeccione los genes visualmente para buscar falsos positivos.

En el protocolo de texto se describen análisis adicionales de los parámetros físicos y dominios de las proteínas, la distribución cromosómica, las duplicaciones y la organización de los intrones de exones. A continuación, se analizan las relaciones entre los miembros de la familia ATL a través de la construcción de un árbol filogenético de alta calidad y la definición de una nomenclatura familiar. En primer lugar, recupere las secuencias árabes de ATL, necesarias como referencias para una nomenclatura genética de la vid de uva, de la base de datos UmoProt como referencia.

A continuación, haga un archivo FASTA que incluya todas las secuencias de nucleótidos de la vid y los miembros de la familia de genes Arabidopsis para el análisis filogenético. Ahora navegue por la página de inicio de phylogeny France y seleccione la canalización de análisis de filogenia. Un clic es adecuado en la mayoría de los casos, pero si es necesario, es posible seleccionar configuraciones avanzadas específicas utilizando las opciones avanzadas o incluso un análisis totalmente personalizado utilizando las opciones a la carta.

A continuación, introduzca un nombre para el análisis y cargue el archivo FASTA. A continuación, haga clic en Enviar para ejecutar el análisis. Si este procedimiento da como resultado un mensaje de error, complete cada paso de la canalización del conjunto de filogenia individualmente.

Primero, vaya a la página de inicio del software MUSCLE y cargue el archivo FASTA. Seleccione Pearson FASTA como formato de salida y envíelo. A continuación, descargue el archivo en formato FASTA y elimine las posiciones mal alineadas.

Abra la herramienta de servidor de bloques G, cargue el archivo FASTA de alineación, seleccione ADN como tipo de secuencia y elija la rigurosidad que mejor se adapte al análisis. Para una alineación de la familia de genes ATL de la vid, seleccione las tres opciones propuestas para una selección menos estricta debido a la alta divergencia de secuencia. A continuación, haga clic en obtener bloques para ejecutar el análisis.

Para guardar los resultados, haga clic en la alineación resultante en la parte inferior de la página de salida y cree un nuevo archivo FASTA. Los bloques G eliminan la posición mal alineada en regiones divergentes de un ADN o la alineación de empuje para que sea más adecuado para un análisis filogenético. Para este paso, la selección de parámetros impericle para la rigurosidad de las columnas es crucial para garantizar que sean una responsabilidad de los tres.

Para completar el árbol, acudimos a la página de inicio de Phylogeny France. Allí, seleccione la canalización a la carta y anule la selección de las siguientes opciones:alineación múltiple y curación de alineación. A continuación, haga clic en crear flujo de trabajo, cargue el archivo FASTA seleccionado de bloques G, seleccione el procedimiento de arranque y utilice los parámetros y la configuración predeterminados.

Por último, haga clic en Enviar para ejecutar el análisis. Esto completa el proceso paso a paso. Ahora que el árbol filogenético está hecho, colapse las ramas mal soportadas con valores de bootstrap de menos del 70%Luego descargue los resultados finales en el formato Newick para un análisis más detallado.

El protocolo de texto proporciona instrucciones sobre la asignación de un nombre de gen en función de la filogenia. Para este protocolo, cree un archivo de formato de texto roscado y lineal de valores de expresión normalizados por arma tomados de una biblioteca de expresión génica. Organice los valores de cada gen de la familia en las mismas filas de patrón.

A continuación, realice el análisis jerárquico biagrupado utilizando el software de visualización de experimentos múltiples. Primero, cargue la matriz de datos de trabajo y seleccione el archivo de texto. Seleccione la matriz de un solo color y quite la marca de carga de la anotación cuando no se proporcione una anotación automática.

Seleccione el valor de expresión situado en la parte superior izquierda de la vista previa de la tabla de expresiones y haga clic en el botón cargar. A continuación, ajuste los datos, aplicando la transformación Log2 y la normalización de genes/filas. A continuación, establezca el límite de escala adecuado.

Ahora calcule la agrupación jerárquica. En el campo Optimización de pedidos, seleccione optimizar el orden de las hojas de los genes y Optimizar el orden de las hojas de muestra. A continuación, en el campo de selección del método de vinculación, seleccione la agrupación en clústeres de vinculación promedio y, en el campo de selección de la matriz de distancias, elija la correlación de Pearson.

A continuación, haga clic en Aceptar para ejecutar el análisis. Vea los resultados en el panel izquierdo de la ventana y exporte el mapa de calor haciendo clic en guardar imagen en el menú de archivo. El gen más similar a arabidopsis thaliana ATL2, según una búsqueda BLAST-P, se utilizó para estudiar los miembros de la familia ATL en el genoma de la vid

El análisis PSI BLAST convergió después de unos pocos ciclos, proporcionando una lista de genes putativos en la familia de genes. La presencia del dominio canónico H2 del anillo para cada candidato se evaluó mediante la inspección visual de la alineación MUSCLE. Esto redujo la búsqueda a 96 genes de vid de uva.

Para la nomenclatura se utilizó un análisis filogenético de los genes identificados, comparándolos con la familia de genes ATL de arabidopsis. 13 de los 96 ATLs de vid de uva recibieron un identificador específico como ortólogo del gen ATL de arabidopsis. El mapeo de los genes identificados en el atlas de expresión génica global de la vid mediante un análisis jerárquico bi-clustered mostró que los 96 se expresan en al menos un tejido y se pueden identificar cinco grupos de expresión.

Se aplicó un enfoque similar para estudiar la expresión de estos genes en respuesta a estreses bióticos. Hubo una participación directa de la familia de genes ATL en respuesta a la infección por patógenos, con 62 genes que mostraron una modulación significativa en al menos dos condiciones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo lidiar con los softwares utilizados para caracterizar una familia de genes.

Al intentar este procedimiento, es importante definir cuidadosamente las características de una familia de genes determinada y la sonda correspondiente utilizada para la identificación de los miembros de la familia del genoma completo. Siguiendo este procedimiento, es posible investigar la evolución de la familia de genes y la función de P30 mediante la creación de árboles filogenéticos adicionales basados en algunas especies distintas de las especies requeridas para la atribución de la nomenclatura de familias de genes.