Name: Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprende a aislar mitocondrias intactas y puras de Arabidopsis thaliana para estudiar respiración y metabolismo energético vegetal. Este método permite obtener organelos funcionales a partir de pequeñas cantidades de tejido.

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Este estudio fue apoyado por un australiano Consejo centro de excelencia en la investigación en planta de energía CE140100008 de biología, un australiano Consejo futuro beca de investigación (FT130100112) y MWM, una beca de investigación de Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fundación, Alemania) a JS.

Este protocolo se utiliza para el aislamiento de las mitocondrias intactas de Arabidopsis thaliana órganos cultivados en suelo mediante gradientes de densidad coloidal continua. Después de la recolección de material todos los procedimientos se llevan a cabo a 4 ° C.
1. preparación del tampón de lavado, medio y soluciones de gradiente
<ol><li>Preparar 300 mL de pulido medio (menos ascorbato y cisteína) y 200 mL de tampón de lavado x 2 según la tabla 1 un día antes del aislamiento, mantenerlos en frío a 4 ° C. Nota: Agregar ascorbato de sodio y L-cisteína (base libre) a una concentración final de 17,84 m y 20,36 m, respectivamente, en el medio de moliendo en la mañana de la aislamiento. Si se utilizan las mitocondrias para inmunoblot o azul nativo-poliacrilamida gel análisis de electroforesis (BN-PAGE), hacer 2 x solución de lavado sin BSA.</li>
	<li>Preparación de gradientes en la mañana del aislamiento mitocondrial (figura 1 y tabla 1).<ol>
<li>Hacer las soluciones gradiente pesadas y ligeras en dos vasos; 35 mL de cada uno es suficiente para dos tubos de gradiente.</li>
		<li>Lavar las cámaras del pourer del gradiente y tubería peristáltica de PVC con agua desionizada y asegurar un flujo uniforme a través del tubo de todos los tubos.</li>
		<li>Colocar 2 tubos de centrífuga (50 mL) en un ángulo leve en el hielo con las salidas de tubería peristáltica de PVC pegada en el interior de los tubos para asegurar que la solución gradiente corre por el lado de los tubos.</li>
		<li>Cierre la conexión entre las cámaras internas y externas (palanca negra hacia abajo). Coloque el pourer del gradiente en un agitador magnético con una barra de agitación pequeño en la cámara interior.</li>
		<li>Verter la solución gradiente pesado de 35 mL en la cámara interior (cámara con salida de la tubería). Pipetear en los tubos de dos centrífuga colocados en hielo hasta la mitad queda con la velocidad de la bomba peristáltica para rápido (300 mL/h) la solución gradiente fuerte.</li>
		<li>Verter la solución de gradiente ligero 35 mL en el externa (cámara sin salida de la tubería). Abra la conexión entre las cámaras (palanca de empuje negro para arriba hasta la mitad) y permite soluciones mezclar suavemente. Mezclar las soluciones con el agitador magnético.</li>
		<li>Que las soluciones se ejecute lentamente (60 mL/h) hasta que toda la mezcla degradada ha salido de las cámaras dando por resultado dos 0 - 4.4% (w/v) tubos de relleno de degradado de polivinilpirrolidona (PVP). Mantener los gradientes en el hielo hasta que esté listo para usar en paso 2.12. Nota: Una vez que el gradiente se ha preparado, diluir 2 x medio de lavado 1 x con agua desionizada prechilled y mantenga frío a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. homogeneización y aislamiento mitocondrial
<ol><li>Cortar tejido entero roseta de 4 - semanas de edad plantas Arabidopsis cultivadas en suelo con tijeras, por lo menos 80 plantas será requeridas para 1 preparación. Nota: 10-14 días agua culturas, mínimo 5 preparación de macetas o 2 semana de edad plántulas cultivadas en placas de agar de Murashige y Skoog Basal sal mezcla (MS), mínimas de 4 platos, también pueden ser utilizadas.</li>
	<li>Colocar la mitad del material vegetal que ha sido cortado en trozos pequeños en un mortero grande previamente refrigerado 4 ° C con 75 mL de medio de molienda (tabla 1) y moler extensivamente durante varios minutos hasta que no se quedan grandes piezas de tejido.</li>
	<li>Humedezca previamente 4 capas de material de la filtración (22-25 μm tamaño de poro) con pulido medio y filtrar el homogeneizado las 4 capas de material de la filtración a través de un embudo de plástico en un erlenmeyer de 500 mL.</li>
	<li>Moler la mitad restante de tejido con otro 75 mL de medio de molienda.</li>
	<li>Combinar homogenados en los materiales de filtración y tanto como posible homogeneizado a través del filtro.</li>
	<li>Moler el tejido restante restante en el material de filtración otra vez con lo restantes 150 mL de pulido medio, filtro otra vez en el frasco cónico de 500 mL.</li>
	<li>Centrifugar el homogeneizado filtrado en 8 tubos de centrífuga plástico de 50 mL previamente enfriada a 2.500 x g a 4 ° C en un rotor de ángulo fijo durante 5 minutos.</li>
	<li>Vierta el sobrenadante en tubos de centrífuga limpio (50 mL; evitar perturbar el sedimento verde) y centrifugar a 17.500 x g a 4 ° C por 20 min en un rotor de ángulo fijo.</li>
	<li>Deseche todo pero < 3 mL del sobrenadante por aspiración (o retirar suavemente sin perturbar el pellet). Con cuidado Resuspender el precipitado en el sobrenadante residual con un pequeño pincel fino.</li>
	<li>Añadir 10 mL de 1 x de tampón de lavado a cada tubo y combinar 4 tubos en tubo de centrífuga limpio 1 (es decir, resultante en 2 tubos).</li>
	<li>Rellenar estos tubos con tampón de lavado 1 x 50 mL y repetir pasos 2.7-2.9.</li>
	<li>Piscina crudos pellets mitocondriales en 1 tubo con un gotero y dispersan uniformemente con el pincel fino (puede usarse una pequeña cantidad de tampón de lavado pero el volumen final debe ser menos de 3 mL para caber en la parte superior del gradiente). Suavemente la capa la suspensión mitocondrial con un gotero en los 2 continua 0 - 4.4% (w/v) PVP gradientes.</li>
	<li>Equilibrar los tubos por peso (1 x de tampón de lavado) y centrifugar a 40.000 x g a 4 ° C durante 40 minutos Asegúrese de que la rotura se ha apagado. Las mitocondrias se migrarán a una banda cerca del fondo del tubo, o pueden estar presentes en la solución de pesado en la parte inferior del tubo (identificado por una banda turbia, amarillenta; Figura 2).</li>
	<li>Retire con cuidado la superior 5 cm de la solución por encima de la banda mitocondrial por la aspiración.</li>
	<li>Distribuir la solución restante que contiene la mitocondria en 2 tubos limpios y llenan de 1 x de tampón de lavado. Distribuir uniformemente el gradiente de densidad coloidal y mitocondrias que cubre la boca del tubo con una película plástica de la parafina y invirtiendo varias veces. Centrifugar 15 min a 31.000 x g a 4 ° C con el frenado lento. Nota: Antes de la centrifugación, asegúrese de que las mitocondrias y el gradiente de densidad coloidal restante se distribuyen uniformemente. De lo contrario, el gradiente de densidad coloidal puede concentrarse en la parte inferior del tubo y prevenir la granulación de las mitocondrias.</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante por aspiración, llene el tubo de lavado 1 x 50 mL de tampón e invertir otra vez para asegurar una mezcla. Centrifugar 15 min a 31.000 x g a 4 ° C con el frenado lento.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y recoger los pellets mitocondriales en tan pequeña un volumen (~ 500 μl) como sea posible usando una pipeta con modificada 200 μL puntas (cortadas la punta un poco por encima de su extremo para aumentar su apertura). Coloque las mitocondrias en un tubo de 1,5 mL y mantener en hielo para su uso inmediato o tienda a-80 ° C. Nota: Si las mitocondrias se utilizará para la electroforesis del gel de la sulfato-poliacrilamida de sodio dodecyl (SDS-PAGE), BN-PAGE, o análisis del immunoblot, usan 1 x de tampón de lavado sin BSA para el lavado final (es decir, paso 2.15 y 2.16).</li>
	<li>Determinar la concentración de proteínas de las mitocondrias mediante el método de Bradford. Nota: Para alícuotas de BN-PAGE centrifugar a 4 ° C y pellets tienda a-80 ° C hasta su uso. Para mediciones de consumo de oxígeno, pueden utilizarse sólo las mitocondrias recién aisladas.</li>
</ol>3. mediciones de consumo de oxígeno
Nota: El consumo de oxígeno por recién aislada planta mitocondrias pueden analizarse con un electrodo de oxígeno de Clark-tipo, permitiendo la determinación de la integridad mitocondrial, citocromo c vía actividad y actividad de la vía alternativa.
<ol><li>Instalación del software<ol>
<li>Instalar licencia oxígeno control de software en el equipo utilizado para las mediciones de consumo de oxígeno.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de medio de la respiración, sustratos, soluciones químicas y el electrodo de oxígeno de Clark-tipo<ol>
<li>Preparar el medio de la respiración (300 mM sacarosa, 10 mM NaCl, 5 m m KH2PO4, 2 mM de MgSO4, 0.1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA), TES (pH 7.2) de 10 mM) utilizado para los ensayos de consumo de oxígeno.</li>
		<li>Preparación de sustratos, inhibidores y efectores utilizados para medir la respiración mitocondrial (tabla 2). Puede ser preparados antes y almacenados a-20 ° C. Nota: Neutralizar el pH de soluciones ácidas tales como ácidos orgánicos a pH 7,0 con NaOH antes de uso.</li>
		<li>Caliente el medio de la respiración a la misma temperatura que la cámara de ensayo (25 ° C).</li>
		<li>Montar el electrodo de oxígeno de Clark-tipo como se describe en el protocolo del fabricante.</li>
		<li>Colocar 1 mL de agua saturada de aire (agua saturada de aire se obtiene agitando vigorosamente una pequeña cantidad de agua desionizada en un matraz cónico grande) en la cámara de medición. Para encender el agitador, haga clic en el botón "Velocidad de agitado". Haga clic en el botón "On" y seleccione la velocidad del agitador a 65 rpm. Haga clic en "Aceptar" para continuar. Agitar continuamente el agua a 25 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibración del electrodo de oxígeno<ol>
<li>Caliente el agua que se utilizarán para la calibración a la misma temperatura que la cámara de ensayo (25 ° C).</li>
		<li>Espere a que la corriente estabilizar y calibrar el electrodo de oxígeno.</li>
		<li>Para iniciar la calibración del electrodo de oxígeno, haga clic en el botón "Calibrate", seleccione "Calibración de fase líquida" y "Agua saturada de aire".</li>
		<li>(Calibración del oxígeno (fase líquida) - paso 1 de 5) abrirá una ventana nueva. Seleccione el canal para calibrar (el canal de) que la caja de control del electrodo está conectada) e introducir variables (juego "Temperatura de la cámara" a 25 ° C y la "Presión atmosférica" a 101,32 kPa). Haga clic en "Aceptar" para continuar.</li>
		<li>En el siguiente paso (paso 2 de 5), configurar la velocidad del agitador (65 rpm) y haga clic en "Aceptar" para continuar.</li>
		<li>En el paso 3 de 5, esperar la señal llegar a una meseta. El término "Meseta alcanzado, presione OK para continuar" aparecerá en la caja. Haga clic en "Aceptar" para continuar.</li>
		<li>En el paso 4 de 5, establecer cero oxígeno en la cámara mediante la adición de Ditionito de sodio 5 mg. Haga clic en "Aceptar" para continuar. Nota: Una disminución en la concentración de oxígeno debe ser visible en el rastro y debe llegar a 0.</li>
		<li>En el último paso de calibración (paso 5 de 5), esperar la señal llegar a una meseta. El término "Meseta alcanzado, presione OK para continuar" aparecerá en la caja. Haga clic en "Aceptar" para continuar.</li>
		<li>Haga clic en "Guardar calibración" para guardar la calibración. Se abrirá una nueva ventana. Haga clic en "Aceptar" para confirmar para guardar la nueva calibración de la caja de control de oxígeno. Nota: Después de la calibración, el etiquetado "oxígeno (nmol/mL)" aparecerán en el eje y.</li>
		<li>Después de la calibración, limpiar la cámara de medición de enjuague la cámara con agua (al menos 5 - 10 veces) para asegurar la limpieza apropiada. Coloque 1 mL del medio de la respiración en la medición de la cámara y permitir que la membrana se equilibre durante unos minutos hasta que la huella del consumo de oxígeno es lineal.</li>
		<li>Adaptar la escala de la huella de consumo de oxígeno para obtener una visión de buena pendiente. Haga clic en "Zoom XY" e introduzca variables (posición "Oxígeno" 0 - 300 y el "tiempo eje" 0 - 45 minutos).</li>
	</ol></li>
	<li>Determinación de la integridad mitocondrial<ol>
<li>Con el émbolo abierto, añadir 970 μl de medio de respiración de aire saturado a la cámara de reacción.</li>
		<li>Añadir 30 mitocondrias μl aislado o 150 μg de la proteína mitocondrial total determinada después de aislamiento de las mitocondrias (proteína total debe incluirse en los cálculos luego) a la cámara de reacción mediante una pipeta con una punta de corte.</li>
		<li>Agitar la suspensión mitocondrial continuamente con un agitador magnético de la barra (65 rpm) a 25 ° C para aire-saturar la solución.</li>
		<li>Sellar la cámara con el émbolo, haga clic en "Iniciar grabación" para registrar el consumo de oxígeno y permite el seguimiento de consumo de oxígeno estabilizar (1-2 min).</li>
		<li>Determinar la tasa de consumo de oxígeno manualmente después de añadir 10 mM ascorbato y 25 μm citocromo c durante 5 minutos obtener la tasa de "antes de detergente". Nota: Para la adición de sustratos, inhibidores y efectores directamente en el rastro de la etiqueta, haga clic en el botón "Agregar evento Mark" e introduzca la correspondiente designación de etiqueta. Haga clic en "Aceptar" para continuar.</li>
		<li>Determinar la tasa de consumo de oxígeno manualmente por 3 min después de añadir el detergente de 0,05% (v/v) para dar el tipo "después de detergente". Haga clic en "Detener grabación".</li>
		<li>Haga clic en el botón "Tabla de tasas de cambio". 2 cursores aparecerán como líneas verticales en la pantalla graph. Haga clic y arrastre el par de cursores de tasa a las posiciones necesarias en el rastro para definir el intervalo de frecuencia. Mover el intervalo de frecuencia a lo largo de la traza usando los cursores izquierdo tasa. Establecer el intervalo de frecuencia utilizando el cursor de derecha tasa. El oxígeno monitoreo software automáticamente dibuja una línea de mejor ajuste entre los dos cursores mientras se mueven los cursores de intervalo de velocidad a lo largo de la traza.</li>
		<li>Una vez definido el intervalo de la tasa deseada y la posición, introduce el índice en la tabla con un clic derecho en 1 de los 2 cursores y seleccionar "Añadir velocidad a mesa". Haga clic en el botón "Agregar" para confirmar para mostrar el índice en la tabla de índice principal.</li>
		<li>Calcular la integridad mitocondrial dividiendo la tasa de "antes de detergente" la tasa "después de detergente", expresada como un porcentaje y restar de 100.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinación de la respiración mitocondrial<ol>
<li>Con el émbolo abierto, añadir 970 μl del medio de la respiración de aire saturado a la cámara de reacción. Añadir 500 μm ATP y mitocondrias μl aislado 30 o 150 μg de la proteína mitocondrial total usando una pipeta con una punta cortada al medio de la respiración en la cámara de reacción.</li>
		<li>Agitar la suspensión mitocondrial continuamente con un agitador magnético de la barra (65 rpm) a 25 ° C.</li>
		<li>Cerca de émbolo, haga clic en "Iniciar grabación" para registrar el consumo de oxígeno y esperar 1-2 min para la tasa de consumo de oxígeno se estabilice (cuando la huella del consumo de oxígeno es lineal). Añadir succinato 5 mM. Registro de la tasa de consumo de oxígeno durante unos 2 minutos. Nota: Para la adición de sustratos, inhibidores y efectores directamente en el rastro de la etiqueta, haga clic en el botón "Agregar evento Mark" e introduzca la correspondiente designación de etiqueta. Haga clic en "Aceptar" para continuar.</li>
		<li>Añadir 1 mM adenosina difosfato (ADP). Continúan registrando la tasa de consumo de oxígeno durante 2 minutos.</li>
		<li>Añadir 1 mM NADH. Registro de la tasa de consumo de oxígeno durante 4-8 minutos. Esta tasa es la capacidad de la respiración a través de la citocromo oxidasa.</li>
		<li>Añadir 1 mM cianuro de potasio (KCN) (o 2.5 myxothiazol μm o 5 μm antimycin A) para inhibir la vía de citocromo c y continuar a grabar durante unos 2 minutos observar el consumo de oxígeno a través de la oxidasa alternativa.</li>
		<li>Añadir 5 mM Ditiotreitol (DTT) y piruvato de 10 mM para activar completamente la oxidasa alternativa. Continuar a grabar durante 5-7 min: es la capacidad de la oxidasa alternativa.</li>
		<li>Añadir 500 μm n-propil galato (nPG) y grabación de 2 minutos. Esto evalúa la tasa de consumo de oxígeno residual que no puede ser químicamente inhibido. Reste esta tasa de las otras tasas registradas, ya que no es probable ser mitocondrial en origen. Consumo de oxígeno sigue produciendo después de la inhibición de la citocromo c y camino AOX (por KCN y nPG) es muy probable que venga de peroxidasas presentes como contaminantes en la mitocondria aislada9.</li>
		<li>Haga clic en "Detener grabación".</li>
		<li>Haga clic en el botón "Tabla de tasas de cambio" introduce la tasa de la tabla con un clic derecho en uno de los dos cursores y seleccionar "Añadir a la tabla de tasas". Haga clic en el botón "Agregar" para confirmar para mostrar el índice en la tabla de índice principal. Nota: Cuando agrega efectores disuelto en solventes orgánicos (por ej., antimicina A, nPG, myxothiazol), la cámara y el émbolo debe ser aclarados con etanol y agua entonces para asegurar la limpieza apropiada.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Por lo general, aislamiento de mitocondrias de Arabidopsis deja rendimientos encima de 3 mg de mitocondrias de aproximadamente 80-100 3 - 4 semana - viejas plantas, aunque a menudo se logra rendimientos de más de 5 mg con fondo pulido. El rendimiento varía con condiciones de crecimiento y disminuye dramáticamente como hojas marchitaron, aunque las mitocondrias estructura parece mantenerse bien durante la senescencia9. Una de las características más importantes para obtener un buen rendimiento es e...

La historia de la investigación mitocondrial planta va detrás más de 100 años1. Las mitocondrias intactas se aisló por primera vez en la temprana década de 1950 utilizando centrifugación diferencial. La aparición de un gradiente de densidad coloidal en la década de 1980 permitió que las mitocondrias ser purificada sin sufrir ajuste osmótico. Mientras que las mitocondrias purificadas gradiente son convenientes para la mayoría de los casos, debido a la sensibilidad de la espectrometría de masas, contaminantes aún relativamente de menor importancia pueden ser detectados y pueden ser asignados inadecuadamente una localización mitocondrial2. El uso de electroforesis de flujo libre puede quitar ambos plastidic y peroxisoma contaminación3, pero sin flujo de electroforesis es una técnica altamente especializada y no es necesaria para la gran mayoría de los estudios. Además, cuando determinar la ubicación de una proteína debe ser recordado doble o múltiples objetivos de proteínas ocurre en las células. Más de 100 proteínas específicas duales se describen para cloroplastos/plástidos y mitocondrias4y un número de proteínas dirigida a las mitocondrias y los peroxisomas también se conocen5. Además, la reubicación de proteínas bajo estímulos específicos, por ejemplo, el estrés oxidativo, es un tema emergente en la biología de la célula6. Por lo tanto, debe ser considerado en el contexto de la biología que estudia la localización de las proteínas, y una variedad de métodos se utilizan para determinar y verificar la ubicación2.
Las mitocondrias son generalmente aisladas de los tejidos vegetales por homogeneización, un equilibrio es necesario entre rompiendo la pared celular para liberar las mitocondrias y no dañar las mitocondrias. Tradicionalmente con patata y coliflor, homogeneización implica el uso de aparatos domésticos licuadora/exprimidor para hacer un extracto líquido en un tampón con varios componentes para mantener la actividad. Aislamiento de mitocondrias de hojas de guisante, (un material popular para aislamiento mitocondrial utilizando plantas de semillero jóvenes (~ 10 días), utiliza una batidora para lyse las células como el material de la hoja es suave. Con la disponibilidad de líneas de knock-out insertional T-DNA de Arabidopsis thaliana , la necesidad de ser capaz de purificar las mitocondrias para llevar a cabo estudios funcionales ha requerido el desarrollo de métodos para aislar mitocondrias de hoja, raíz o flor tejido. En general los métodos desarrollados para otras plantas trabajaban bien7, con la gratificación que moler del material necesario para ser optimizado. Para Arabidopsis esto puede lograrse en una variedad de maneras (véase abajo) y difiere entre tipos de tejidos (raíz versus shoot). El uso de la gradiente continuo también puede ser optimizado como la densidad de las mitocondrias de distintos órganos o etapas de desarrollo medio pueden migran diferentemente. Así, para la separación máxima la densidad del gradiente puede ser refinada para lograr la mejor separación.
Una vez purificada la mitocondria puede utilizarse para una variedad de estudios, incluyendo los experimentos de absorción de proteína y tRNA, ensayos de actividad enzimática, las medidas de la cadena respiratoria y mancha blanca /negra occidental análisis. Las mitocondrias aisladas pueden utilizarse también para los análisis de espectrometría de masas de la abundancia de la proteína. Objetivo reacción múltiple monitoreo análisis (MRM) permite la cuantificación de definido de las proteínas, pero requieren el desarrollo de los ensayos significativos. En cambio, cuantificación por dimetil u otro isótopo etiquetas8, proporciona un enfoque de descubrimiento en la identificación de las diferencias en el proteoma completo que puede utilizarse para descubrir nuevos conocimientos biológicos.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina química A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Químico, disuelva en etanol</td></tr><tr><td>anticuerpo AOX</td><td>de Tom Elthon</td><td></td><td>Elthon et al., 1989</td></tr><tr><td>Ascorbato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0157</td><td>Ascorbato oxidasa de Cucurbita sp.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina química (BSA)</td><td>Bovogen</td><td>BSAS 1.0</td><td>Claridad química</td></tr><tr><td>Sustrato ECL occidental</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1705061</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Criterion Chemical Free Prefabricados 8-16% 18 pocillos</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>5678104</td><td>Cianuro químico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60178</td><td>químico</td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3131</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Difco Agar, granulado</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Químico Dithiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Sal disódica EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Gamborg B-5 Medio basal</td><td>Austratec</td><td>G398-100L</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Gamborg Solución Vitamínica (1000x)</td><td>Austratec</td><td>G219-100ML</td><td>Producto químico</td></tr><tr><td>de cabra Anti-ratón IgG (H + L)-HRP Conjugado</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1706516-2ml</td><td>Químico</td></tr><tr><td>de Cabra Anti-Conejo IgG (H + L)-HRP Conjugado</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1706515-2ml</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td> química <td>Sigma</td><td>C7352-100G</td><td>Sulfato</td></tr> <tr><td></td><td>de magnesio químicoSigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Mezcla de sales basales (MS)</td><td>Austratec</td><td>M524-100L</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Myxotiazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5580</td><td>Químico, disuelva en etanol</td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8129</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Anticuerpo Ndufs4</td><td>de Etienne Meyer</td><td></td><td>Meyer et al., 2009</td></tr><tr><td>n-Galato de propilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td>Químico, disuelva en etanol</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td>Químico, gradiente de densidad coloidal</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona (PVP40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Cianuro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60178</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td> químico <td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Chem-Supply</td><td>SA046</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Ditionito de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td>químico</td></tr><tr><td>L-ascorbato de sodio</td><td>Sigma</td><td>A4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>Químico Succinato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Chem-Supply</td><td>SA030</td><td>Químico</td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfato tetrasódico químico (Na4P2O7 &middot; 10H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221368</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo RTA Midi Kit de transferencia de nitrocelulosa</td><td>Bio-Rad Laboratories 1704271 Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Químico, detergente</td></tr><tr><td>Reactivo de bloqueo occidental</td><td>Sigma</td><td>11921681001</td><td>Equilibrio químico</td></tr><tr><td></td><td>Mettler Toledo</td><td>XS204</td><td>Equipos</td></tr><tr><td>Vasos de precipitados</td><td>Isolab</td><td>50 mL</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-26XP</td><td></td></tr><tr><td>Equipos Tubos de centrífuga</td><td>Nalgene</td><td>3117-9500</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Circulador</td><td>Julabo</td><td>1124971</td><td>Acoplado a cámara de electrodos de oxígeno</td></tr> matraz <tr><td>cónico</td><td>Isolab</td><td>500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Gotero</td><td></td><td>3 mL</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ángulo fijo</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA25.5</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Embudo</td><td>por alimento</td><td>14 cm</td><td>Para filtrar</td></tr><tr><td>Vertedor de gradiente</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4120</td><td>Para la preparación de gradientes</td></tr><tr><td>Agitador magnético ATE</td><td>Equipo de F20300165 VELP Scientifica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>VWR</td><td>EM475855-1R</td><td>Material de filtración</td></tr><tr><td>Mortero y mortero</td><td>Jamie Oliver</td><td>Granito, equipo de 6 pulgadas</td><td></td></tr><tr><td>O2view</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td>Software de monitorización de oxígeno</td></tr><tr><td>Sistema Oxygraph Plus</td><td>Hansatech Instruments</td><td>1187253</td><td>Electrodo de oxígeno tipo Clark</td></tr><tr><td>Pincel</td><td>Artist primera elección</td><td>1008R-12</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>película de parafina plástica</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Gilson</td><td>F155001</td><td>Para la preparación de gradientes</td></tr><tr><td>Tubo peristáltico de PVC</td><td>Gilson</td><td>F117930</td><td>Para la preparación de gradientes Baño de</td></tr><tr><td>agua</td><td>VELP Scientifica</td><td>OCB</td><td>Equipo</td></tr></tbody></table>

aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Las mitocondrias son organelos esenciales involucrados en numerosas vías metabólicas en las plantas, en particular la producción de trifosfato de adenosina (ATP) de la oxidación de compuestos reducidos como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y flavina adenina dinucleótido (FADH2). La anotación completa del genoma de Arabidopsis thaliana ha establecido como el más ampliamente utilizado sistema de modelo de planta, y así la necesidad de purificar las mitocondrias de una variedad de órganos (hojas, raíz o flor) es necesaria aprovechar las herramientas que ya están disponibles para Arabidopsis estudiar biología mitocondrial. Las mitocondrias están aisladas por la homogeneización del tejido usando una variedad de enfoques, seguido por una serie de pasos de centrifugación diferencial produce un pellet mitocondrial cruda que más se purifica mediante gradiente de densidad coloidal continua centrifugación. Posteriormente se retira el material coloidal densidad por múltiples pasos de centrifugación. A partir de 100 g de tejido foliar fresco, 2-3 mg de mitocondrias puede rutinariamente obtener. Experimentos respiratorios en las mitocondrias Mostrar tasas típicas de 100-250 nmol O2 min-1 mg proteína mitocondrial total-1 (tasa de NADH-dependiente) con la capacidad de utilizar diferentes sustratos e inhibidores para determinar que sustratos son ser oxidados y la capacidad de las alternativa y citocromo oxidasas terminales. Este protocolo describe un método de aislamiento de las mitocondrias de las hojas de Arabidopsis thaliana mediante gradientes de densidad coloidal continua y un eficiente mediciones respiratoria de las mitocondrias planta purificada.

Mediante este protocolo, hemos podido detectar diferentes proteínas mitocondriales por SDS-PAGE e immunoblotting. Como se muestra en la Figura 3A, la proteína aislada de tejido de la cultura del agua es suficiente para detectar una banda débil (2 μg). Intensidad de la señal aumenta proporcionalmente a las cantidades cargadas. De las mitocondrias aisladas de tejidos cultivados en placas (figura 3B), la respuesta al estrés de luz a...

Como las mitocondrias son sólo un pequeño porcentaje de la célula de la planta, tienen que ser purificado para una gama de estudios. Las mitocondrias pueden ser aisladas de una variedad de órganos de la planta de homogeneización, seguido de centrifugación gradiente diferencial y densidad para obtener una fracción altamente purificada mitocondrial.

Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

El objetivo general de aislar mitocondrias vegetales intactas y puras es estudiar la respiración, la composición mitocondrial, la biogénesis y el metabolismo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología energética de las plantas, como la importancia de las mitocondrias y la tolerancia al estrés, en condiciones ambientales cambiantes. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden aislar cantidades suficientes de mitocondrias puras, intactas y funcionales a partir de cantidades relativamente pequeñas de tejido vegetal.Demostrando el procedimiento estarán Wenhui Lyu, y Jennifer Selinski, de mi laboratorio. El día del aislamiento mitocondrial, lave el vertedor de gradiente y el tubo peristáltico de PVC con agua desionizada para preparar los gradientes. Inclínese para colocar dos tubos de centrífuga de 50 ml sobre hielo, de modo que la salida del tubo peristáltico toque la pared de los tubos.A continuación, gire la palanca negra hacia abajo para cerrar la conexión entre las cámaras interior y exterior. Coloque el vertedor de gradiente con la barra de agitación magnética dentro de la cámara interior sobre un agitador magnético. A continuación, vierta 35 ml

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Un protocolo espectrofluorométrico para la medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el corazón de ratón mitocondrias aisladas se presenta aquí. El ensayo involucra la medición simultánea de las mitocondrias...

Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas

Muchos ARNm que codifican proteínas mitocondriales se asocian con la membrana externa mitocondrias. Se describe un procedimiento de fraccionamiento subcelular destinada a aislamiento de las mitocondrias de levadura con sus ARNm y ribosomas asociados. Este protocolo se puede aplicar a las células cultivadas bajo diversas condiciones con el fin de revelar los mecanismos de la localización del mRNA y la traducción localizada cerca de las mitocondrias.

Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada

La comparación del potencial de membrana mitocondrial entre muestras proporciona información valiosa sobre el estado celular. Se describen los pasos detallados para aislar las mitocondrias y evaluar la respuesta a los inhibidores y desacopladores mediante fluorescencia. El método y la utilidad de este protocolo se ilustran mediante el uso de un cultivo celular y un modelo animal de estrés celular.

Aislamiento y análisis funcional de las mitocondrias de las células cultivadas y ratón de Tejidos

Los métodos presentados proporcionan instrucciones paso a paso para la realización de una colección de ensayos respirométricos basados en microplacas utilizando mitocondrias aisladas de cantidades mínimas de músculo esquelético de ratón. Estos ensayos son capaces de medir los cambios/adaptaciones mecanicistas en el consumo de oxígeno mitocondrial en un modelo animal comúnmente utilizado.

Uso de mitocondrias aisladas a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para alta microplacas rendimiento Mediciones respiratorias

Aquí, presentamos una modificación de un método previamente reportado que permite el aislamiento de mitocondrias purificadas y de alta calidad a partir de cantidades más pequeñas de músculo esquelético de ratón. Este procedimiento da como resultado mitocondrias altamente acopladas que respiran con alta función durante los ensayos respirometirc basados en microplacas.

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

Aquí, se toma una muestra de músculo cuádriceps de un cerdo anestesiado y se aíslan las mitocondrias por centrifugación diferencial. A continuación, se determinan las frecuencias respiratorias de los complejos de cadenas respiratorias mitocondriales I, II y IV mediante respirometría de alta resolución.

Aislamiento de mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial para Medidas respirometría de alta resolución

Aquí, presentamos un protocolo de captura interactome aplicado a Arabidopsis thaliana protoplastos hoja mesófilo. Este método depende crıticamente de la reticulación UV in vivo y permite el aislamiento e identificación de proteınas de unión a mRNA de plantas desde un entorno fisiológico.

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

Se proporciona un protocolo de alto rendimiento para la esterilización superficial de semillas de Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), optimizando los pasos de manejo de líquidos con un dispositivo de succión simple construido con una bomba de vacío. Cientos de muestras de semillas pueden ser esterilizadas superficialmente en un día.

Método de alto rendimiento, robusto y altamente flexible en el tiempo para la esterilización superficial de semillas de Arabidopsis

Aquí, describimos un método detallado para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón y el posterior análisis de la respiración por tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas. Esta tubería se puede aplicar para estudiar los efectos de múltiples intervenciones ambientales o genéticas en el metabolismo mitocondrial.

Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos

Describimos un enfoque para medir los cambios en la eficiencia fotosintética en plantas después del tratamiento con bajoCO2 utilizando fluorescencia de clorofila.

Evaluación de la eficiencia fotosintética en mutantes fotorrespiratorios mediante análisis de fluorescencia de clorofila

La viabilidad y efectividad de los métodos scRNA-seq de alto rendimiento anuncian una era unicelular en la investigación de plantas. Aquí se presenta un procedimiento robusto y completo para aislar tipos específicos de células de raíz de Arabidopsis thaliana y la posterior construcción y análisis de la biblioteca del transcriptoma.

Análisis de aislamiento y transcriptoma de tipos de células vegetales

Aprende a aislar mitocondrias intactas y puras de Arabidopsis thaliana para estudiar respiración y metabolismo energético vegetal. Este método permite obtener organelos funcionales a partir de pequeñas cantidades de tejido.

Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana

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