Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana

El objetivo general de aislar mitocondrias vegetales intactas y puras es estudiar la respiración, la composición mitocondrial, la biogénesis y el metabolismo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología energética de las plantas, como la importancia de las mitocondrias y la tolerancia al estrés, en condiciones ambientales cambiantes. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden aislar cantidades suficientes de mitocondrias puras, intactas y funcionales a partir de cantidades relativamente pequeñas de tejido vegetal.

Demostrando el procedimiento estarán Wenhui Lyu, y Jennifer Selinski, de mi laboratorio. El día del aislamiento mitocondrial, lave el vertedor de gradiente y el tubo peristáltico de PVC con agua desionizada para preparar los gradientes. Inclínese para colocar dos tubos de centrífuga de 50 ml sobre hielo, de modo que la salida del tubo peristáltico toque la pared de los tubos.

A continuación, gire la palanca negra hacia abajo para cerrar la conexión entre las cámaras interior y exterior. Coloque el vertedor de gradiente con la barra de agitación magnética dentro de la cámara interior sobre un agitador magnético. A continuación, vierta 35 ml de solución de gradiente pesado en la cámara interior.

Dispense la mitad de la solución de gradiente pesado a través de la bomba peristáltica, a 300 ml por hora, en dos tubos de centrífuga, mantenidos en hielo. A continuación, vierta 35 ml de solución de gradiente de luz en la cámara exterior. Inmediatamente, gire la palanca negra hasta la mitad para reanudar la conexión entre las cámaras interior y exterior, para que las soluciones se mezclen suavemente.

Expulse toda la mezcla de gradiente de las cámaras, a una velocidad de 60 ml por hora, para formar dos gradientes continuos de 0% a 4.4% PVP. Mantenga siempre los gradientes en hielo antes de usar. Es importante no moler demasiado el tejido de la planta, de lo contrario, las mitocondrias se descompondrán.

Para una sola preparación, corte todo el tejido de la roseta de al menos 80 plantas de Arabidopsis de cuatro semanas de edad, cultivadas en tierra. A continuación, añada la mitad de los tejidos vegetales cortados a un mortero grande enfriado, que contenga 75 mL de medio de molienda. A continuación, utilice un medio de molienda para humedecer cuatro capas de material de filtración, con un tamaño de poro de 20 a 25 m.

Utilice un embudo de plástico para filtrar la homogeneidad a través de las cuatro capas de material de filtración y recójala en un matraz cónico de 500 ml. Utilice 75 ml adicionales de medio de molienda para triturar la otra mitad del tejido. A continuación, combine todo el homogeneizado en el material de filtración, para filtrar la mayor cantidad posible.

Utilice 150 ml de medio de molienda para triturar todo el tejido restante en el material de filtración y filtre en un matraz cónico de 500 ml. Distribuya el homogeneizado filtrado en ocho tubos de centrífuga de plástico preenfriados de 50 ml. Y centrifugar a 2.500 g a cuatro grados centígrados, en un rotor de ángulo fijo, durante cinco minutos.

Después de verter el sobrenadante en tubos de centrífuga limpios, vuelva a centrifugar a 17, 500 g, a cuatro grados centígrados, durante 20 minutos, en un rotor de ángulo fijo. Deje 3 mL de sobrenadante en el tubo. A continuación, utilice un pincel fino para volver a suspender suavemente el pellet en el sobrenadante restante.

Agregue 10 mL de tampón de lavado de concentración simple a cada uno de los tubos y agrupe los cuatro tubos en un tubo de centrífuga, lo que da como resultado dos tubos en total. Ajuste el volumen a 50 ml con tampón de lavado de concentración única y repita los pasos de centrifugación. Usando una cantidad muy pequeña de tampón de lavado, disperse el pellet con el pincel fino y luego use un gotero para agrupar el pellet mitocondrial crudo en un tubo.

A continuación, coloque cuidadosamente la suspensión mitocondrial en capas con un gotero, en dos gradientes continuos de 0% a 4% PVP. Utilice un tampón de lavado de concentración única para equilibrar el peso de los tubos y realice una centrifugación a 40.000 g a cuatro grados centígrados, durante 40 minutos. Recuerde apagar el freno.

Aspire con cuidado los cinco centímetros superiores de solución por encima de la banda mitocondrial. A continuación, distribuya la solución mitocondrial en dos tubos limpios y llénelos con tampón de lavado de concentración única. Cubra la boca del tubo con una película de parafina plástica e inviértala varias veces para distribuir uniformemente el gradiente de densidad coloidal y las mitocondrias.

A continuación, centrifugar a 31.000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados, con freno lento. Aspire el sobrenadante y ajuste el volumen del tubo hasta 50 ml con tampón de lavado de concentración única. Invierta varias veces para una mezcla adecuada.

Centrifugar la solución a 31.000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados con freno lento. Aspirar el sobrenadante y, a continuación, recoger el pellet mitocondrial en 500 l de tampón de lavado de concentración única, utilizando una pipeta con punta modificada de 200 l. Con el émbolo abierto, añada 970 l de medio respiratorio saturado de aire a la cámara de reacción.

A continuación, añada 150 g de proteína mitocondrial total, utilizando una pipeta modificada, y 500 M de trifosfato de adenosina a la cámara de reacción, para determinar la respiración mitocondrial. Utilice una barra de agitación magnética para agitar continuamente la suspensión mitocondrial. Después de cerrar el émbolo, haga clic en Iniciar grabación para registrar el consumo de oxígeno.

Espere uno o dos minutos para verificar si hay una traza lineal de consumo de oxígeno, lo que indica un consumo de oxígeno estable. A continuación, añada 5 mM de succinato y registre el consumo de oxígeno durante aproximadamente dos minutos. Agregue 1 mM de difosfato de adenosina y siga registrando la tasa de consumo de oxígeno durante otros dos minutos.

A continuación, agregue 1 mM de hidrógeno de nicotinamida adenina dinucleótido y continúe registrando el consumo de oxígeno durante aproximadamente cuatro a ocho minutos. A continuación, añada reactivos para inhibir la vía del citocromo C, y siga registrando el consumo de oxígeno a través de la oxidasa alternativa, durante unos dos minutos. El KCN, el mixotiazol y la antimicina A son venenos respiratorios.

Es importante seguir las instrucciones de seguridad de las hojas de datos de seguridad del edificio. Tenga en cuenta que los diferentes países tendrán diferentes legislaciones para el uso de estos inhibidores en nuestros experimentos. A continuación, agregue 5 mM de ditiotreitol y 10 mM de piruvato para activar la oxidasa alternativa.

Y sigue grabando durante otros cinco a siete minutos. Finalmente, agregue 500 mM de galato de N-propilo y grabe durante dos minutos. Un gradiente representativo, que muestra la presencia de una fracción mitocondrial de color blanco verdoso cerca de la parte inferior de la solución de gradiente.

Los tilacoides y otros contaminantes presentes en la parte superior de la solución de gradiente se indican en bandas de color verde oscuro. Trazas representativas del consumo de oxígeno por parte de las mitocondrias, para mostrar la integridad de la membrana externa antes de la medición del consumo de oxígeno. La integridad de la membrana externa estaba bien conservada y aproximadamente en un 90% intacta.

Trazas representativas del consumo de oxígeno por parte de las mitocondrias, después de agregar sustratos, inhibidores y efectores. Los resultados muestran un citocromo c comprometido y una vía alternativa de oxidasa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y analizar las mitocondrias de las plantas.