Name: Aplicación de medición de electrofisiología para estudiar la actividad de transportadores de Electro-neutro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Aprende a medir flujos de protones generados por el intercambiador sodio-hidrógeno (NHE) mediante parches gigantes combinados con microelectrodos selectivos de protones y técnicas de patch clamp. Este método electrofisiológico permite estudiar la regulación molecular del transporte iónico en membranas celulares con alta sensibilidad y control del entorno intracelular.

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Los autores desean agradecer a Eric Fishback (Universidad de Des Moines, Des Moines, Iowa, Estados Unidos) por su asistencia con rodaje y edición del video. PS120 fibroblasto-como las células expresando estable NHE3 wt o NHE3 YRK fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).

Nota: Los dos amplificadores son necesarios para registrar la actividad de transportadores electroneutral de una auto referencia ISE junto con el parche de fijación, un amplificador de abrazadera de parche para mantener la célula en una configuración de células enteras y un (amplificador de alta impedancia electrómetro) para grabar la actividad de transportista por el ISE (véase tabla de materiales). El amplificador de abrazadera del remiendo está conectado directamente a la tarjeta de adquisición de terminal. El electrómetro está conectado al amplificador diferencial utilizado para filtrar y amplificar la señal. El amplificador diferencial se conecta a la tarjeta de adquisición de terminal. Capmeter, software de abrazadera del remiendo que monitorea la capacidad de la célula, se ha utilizado en estudios anteriores20 (véase tabla de materiales). Las soluciones de grabación de cámara y de la perfusión se mantienen a 37 ° C.
1. preparación de las pipetas de ISEs
<ol><li>Tire de las pipetas de Capillares de vidrio de borosilicato para un diámetro exterior de 1,2 mm (véase Tabla de materiales) con la pipeta extractor2 .</li>
	<li>Polaco la pipeta usando la microforge. El diámetro de la punta de la pipeta debe ser 2-3 μm.</li>
	<li>Colocar las pipetas en un soporte de vaso para pipetas con la punta hacia arriba (véase Tabla de materiales). PRECAUCIÓN: Realice los pasos 1.4-1.6 en una campana de humos químicos bien ventilada.</li>
	<li>Mezclar la mezcla de siliconization que se compone de 1 gota (~ 150 μL) del bis (dimetilamino) dimetil silano y 10 gotas de tetracloruro de carbono (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Vierta la mezcla de siliconization en el frasco y cierre firmemente la tapa.</li>
	<li>Incube el frasco con la mezcla siliconization durante 24-48 h en una campana de humos químicos a temperatura ambiente hasta que la mezcla se evapora totalmente.</li>
	<li>Rellene la pipeta con la resina de ion-selectivo apropiada para crear una columna de aproximadamente 2-4 mm. Nota: Ionóforo de hidrógeno I B coctel puede ser usedfor grabación NHE actividad (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Toque la punta de la pipeta para distribuir la resina selectiva de iones a la punta y coloque la pipeta verticalmente en el soporte de vaso con punta de la pipeta hacia abajo.</li>
	<li>Checkunder el microscopio de disección que el cóctel de resina ha llegado al final de la punta. Si es necesario, aplique presión positiva para empujar la resina al final.</li>
	<li>Rellenar la mitad-pipeta con la solución adecuada (~ 100 μL). Aquí, 100 mM KCl 10 mM HEPES pH 7.0 si usa use e ionóforo cóctel B.</li>
	<li>Conecte el ISE al Electrómetro y coloque la punta de la SIE en la solución de baño utilizada para la grabación. Cero el electrómetro.</li>
	<li>Prueba de la H+-selectiva respuesta ISE cambiando el pH de la solución del baño. El medio H+-selectiva respuesta ISE es ~ 58 mV por unidad de pH.</li>
	<li>Evaluar periódicamente la respuesta ISE a la calibración.</li>
</ol>2. preparación de Patch Clamp Pipetas para grabación
Nota: Se recomienda el método descrito por Donald Hilgemann en su artículo en la grabación de un canal21 .
<ol><li>Tire de las pipetas para parche gigante de Capillares de vidrio de borosilicato (mmOD 2.0 / 1.5 mm ID) en la pipeta tirador2,22,23.</li>
	<li>Uso un microforge montado en el escenario de un microscopio invertido para hacer una pipeta ancho punta (10-22 μm)23. Fundir una gota (~ 0, 5 mL) de vidrio suave sobre el grueso del alambre de platino de la microforge. Nota: Se requiere que un alambre de platino relativamente grueso (~0.5 mm) para la fabricación de pipetas parche gigante.</li>
	<li>Coloque la pipeta parche cerca del grano de cristal suave y aplicar calor completo hasta la punta comienza a ceder. El alambre de platino se moverá ligeramente hacia la centerduring de la calefacción.</li>
	<li>Apagar el fuego y empuje la punta de la pipeta en el grano de vidrio ablandada. El cable de enfriamiento se retraiga y romper la punta de la pipeta.</li>
	<li>Vuelva a aplicar el calor para alisar la punta de la pipeta y crear una punta de pipeta del diámetro deseado. El diámetro de la punta depende del tamaño de la célula a ser parcheado (8-10 μm en este estudio).</li>
</ol>3. preparación de las células
<ol><li>Calentamiento de la solución salina buffer fosfato (PBS) sin Ca2 + y Mg2 +, solución de tripsina-EDTA y el medio de cultivo a 37 ° c.</li>
	<li>Lavar las células dos veces con PBS. Use 1 mL de la solución para la placa de cultivo de 35 mm diámetro de la célula.</li>
	<li>Añadir 0,5 mL de tripsina a las células de la placa de cultivo de 35 mm diámetro de la célula. Nota: Cuando las células comienzan a round-up, agitar la placa para sujetar de las células.</li>
	<li>Detener la acción de la tripsina mediante la adición de 5 mL (cantidad de placa de cultivo de células de diámetro de 35 mm) de medio de cultivo completo suplementado con suero bovino fetal 10%. Nota: El tiempo de reacción en tripsina es tipo de la célula dependiente.</li>
	<li>Colocar las células en un agitador con mecedora para evitar formación de grumos.</li>
	<li>Utilizan células de hasta 2 h después de la tripsinización. Nota: El tiempo puede variar dependiendo de la línea celular.</li>
</ol>4. elaboración de un sistema de perfusión Intra-pipeta
<ol><li>Cortar un tamaño apropiado de tubo de cuarzo (150 μm OD / 75 μm ID) para preparar la línea de perfusión intra-pipeta.</li>
	<li>Inserte un lado del tubo de cuarzo de una punta de pipeta de 200 μl. Pegue el tubo de cuarzo en la punta y corte el extremo de la punta con una cuchilla de afeitar.</li>
	<li>Conecte la línea de perfusión (tubo de cuarzo pegado a la punta) a un pequeño trozo de tubo de silicona que serviría como depósito para la solución de perfusión intra-pipeta.</li>
	<li>Conecte el tubo de silicona a una jeringa para crear presión positiva.</li>
	<li>Inserte el extremo libre del tubo de cuarzo a través del tubo de polietileno de la titular de la pipeta de la perfusión de puerto (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Evaluar la línea de perfusión con la solución de la pipeta.</li>
</ol>5. preparación de soluciones
<ol><li>Preparar una solución de pipeta fuertemente tamponada para grabar NHE (aspartato de potasio 115 mM (KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM de MgCl2, 10 m m Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, tubos de 12,5 mM, fregonas de 12,5 mM y 12,5 mM MES, pH 6.0 ajustado con ácido aspártico). Nota: Preparar la solución stock de la pipeta y el filtro. Añadir Mg-ATP antes de grabar.</li>
	<li>Preparar una solución de baño fresco cada vez (140 mM NaCl, CaCl 2 mM2, 2 mM de MgCl2y 0,1 mM Tris-HCl pH 8.2).</li>
</ol>6. registro de la actividad del transportador
<ol><li>Mantener la sala de grabación y todas las soluciones a 37 ° C, porque la actividad de transportista es dependiente de la temperatura.</li>
	<li>Coloque las células en la cámara de grabación. Espera hasta que baje a la parte inferior de la cámara pero no dejan que se conecte a la cámara.</li>
	<li>Elija una celda adecuada. Mida el diámetro de la célula con el micrómetro ocular. Elegir las células con un diámetro similar. Nota: Generalmente, un grande de la célula tendrá superficie más celular y posiblemente más transportadores expresados en su membrana plasmática, así también tener más actividad de transportista. Sin embargo, esto no es necesariamente correcto, como actividad del transportador depende del transportador específico y el tipo de célula en estudio.</li>
	<li>Montar la pipeta de microelectrodos selectivos para las amalgamas dentales, relleno la pipeta de sujeción parche con la solución intracelular, asegúrese de que la solución alcanza la punta de la pipeta2. Nota: Pueden requerir varios golpecitos suaves para eliminar burbujas en la punta de la pipeta.</li>
	<li>Monte la pipeta de sujeción de parche a la etapa principal de la electrofisiología creado2,22,23. Nota: Es importante mantener el escenario principal sobre un ángulo de 45 grados en el eje horizontal, como este asegura un ángulo de entrada de la pipeta que es conveniente para la formación de un sello de alta resistencia.</li>
	<li>Aplicar una presión positiva pequeña (~ 5 cm H2O) a la pipeta de parche para reducir la posibilidad de bloqueo de la punta y lo coloca en la solución del baño.</li>
	<li>Se detiene la pipeta de sujeción parche una vez que la punta está cerca de la célula.</li>
	<li>Aliviar la presión positiva mientras que la pipeta toque la celda y aplique una ligera presión negativa (~ 5 cm H2O) para obtener una &gt; 1000 sello MΩ (un Giga ohmios) en la membrana de la célula con el parche pipeta23.</li>
	<li>Coloque la pipeta patch con el celular en el mismo plano focal como el ISE, y pasar la pipeta de parche con el celular cerca de la SIE (~ 5-10 μm)2,5 pero evitar que la célula en contacto con la SIE (figura 1A).</li>
	<li>Asegurar que la explotación potencial es de 0 mV.</li>
	<li>Romper el sello con serie de succiones cortas para obtener la configuración de célula entera.</li>
	<li>Mover el ISE (o pipeta de patch clamp) lentamente de izquierda a derecha o arriba-abajo para registrar la actividad del transportador (figura 1B).</li>
	<li>Registrar picos de al menos 5-8 (1 de figura, de A B).</li>
	<li>Las perturbaciones de la onda cuadrada se aplican durante la grabación para monitorear la calidad del sello y la capacitancia de la membrana de la célula (figura 1).</li>
	<li>Estimar el flujo de H+ (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">) de la diferencia de concentración de H+ libre entre la superficie de la célula y la solución a granel (ΔH+) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg"> Nota: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg"> y <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg"> son H+ y coeficientes de difusión del almacenador intermediario respectivamente, BT es la concentración total del tampón, KD es la constante de disociación del búfer, r es la célula radio, y <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg"> determina el cambio de estado estacionario en la concentración de H enlazado+ para un pequeño cambio en H gratis+. H+ indica un protón libre en solución. Para ser consistente con estudios previos, flujos de H+ se convierten en unidades de flujo electrofisiológica mediante el cálculo de los equivalentes actuales de los flujos (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">/faraday) en pA3,5].</li>
	<li>Normalizar el flujo de protones a la superficie de la célula que puede calcularse a partir del tamaño de la célula o a la capacitancia de la membrana.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

A pesar de las funciones cruciales de los transportadores, los métodos disponibles para el estudio de su actividad son ineficaces e inadecuados. Una limitación es que los métodos disponibles medir el movimiento de iones, mediada por la actividad de transportista sin tener en cuenta las fluctuaciones en la composición de iones intracelulares durante el experimento4. El método presentado garantiza un control preciso de las composiciones de ion extracelular e intracelular y ofrece una poderosa herram...

Transporte de iones y solutos a través de la membrana plasmática es esencial para la supervivencia de las células y, por ende, de los organismos1. Transporte selectivo de iones y solutos se logra mediante una serie de canales especializados y proteínas transportadoras. Las mutaciones en estas proteínas a menudo resultan en una variedad de condiciones clínicas, haciendo canales y transportador de proteínas potenciales dianas para el tratamiento farmacológico1. Desgraciadamente, entender los mecanismos subyacentes a canal y transportador de la función y la regulación está limitada a menudo por los métodos disponibles para estudiar su actividad2,3,4.
Específicamente, transportadores pueden aproximadamente sub-dividirse en dos grandes grupos dependiendo de si altera el potencial de transmembrana de la célula durante el transporte de solutos: los transportadores de iones electrógenos alterar [p. ej., sodio fosfato transportador de co 2a (NaPi2a), intercambiador de sodio-calcio (NCX), etcetera.] o los transportadores de iones no alterar electroneutral [p. ej., intercambiador de sodio-proton (NHE), cloruro de sodio Co transportador, NaPi2c, etcetera.]. Las actividades de ambas clases de transportadores han sido estudiadas extensivamente mediante captación de isótopos radiactivos y membrana-permeant fluorescente tintes2. Ambos enfoques estiman la actividad de los transportadores por la medición de cambios en la concentración mayor de iones citoplasmáticas específicas, y ambos métodos tienen limitaciones, como la sensibilidad moderada y resolución de tiempo y control inadecuado de la intracelular medio. De hecho, la actividad de muchos transportadores es dependiente en la concentración citoplasmática de iones llevados (por ejemplo, NHE3, NCX) y cambios en las concentraciones de estos iones se esperan jugar un papel importante en la regulación de la actividad de transporter2 , 3 , 5. medición precisa de estos mecanismos de regulación se limita mediante métodos clásicos.
Para superar estas limitaciones, métodos de abrazadera del remiendo se utilizan para estudiar la actividad de transportador2,6. En concreto, el auto hace referencia a electrodos ion-selectivos (ISEs)7,8 combinado con el parche de sistema de sujeción ha permitido recientemente la medición de electroneutral transportador actividad3,4 , 5. ISEs están basado en el hecho de que actividad transportista crea un gradiente de iones en proximidad cercana a la membrana celular. Un ISE mover para arriba y lejos de la membrana de la célula en un repetitivo, manera oscilatoria registra una diferencia de voltaje (MV). Diferencias de voltaje se pueden convertir en valores del flujo de iones utilizando un método de calibración que se aplica la primera ley de Fick de la difusión2,9. Mientras que ISEs se utilizan detectar el flujo de iones hacia fuera de las células, el método de la abrazadera de parche en ambos celulares o configuraciones de adentro hacia afuera se utiliza para controlar la composición de iones intracelulares y potencial de membrana. Por otra parte, la aplicación de la técnica de abrazadera del remiendo gigante permite la modificación de la composición intracelular de iones, sino también los lípidos y las proteínas3,5.
En Resumen, la versatilidad del método de la abrazadera de parche en comparación con que otros métodos para el estudio de actividad transportador ha hecho parche de sujeción adecuado para superar las limitaciones comunes de estos métodos. La combinación de auto referencia ISEs y técnicas de patch clamp ofrece la posibilidad única para medir la actividad de transportadores electroneutral en un entorno experimental bien controlado y a descubrir la novela biofísico y molecular propiedades de la membrana celular de transporte3,4,5. Este enfoque se ha utilizado con éxito para estudiar la actividad de la NHE. La familia de proteínas de mamíferos NHE cataliza el intercambio neto de electroneutral de sodio extracelular (Na+) para protón intracelular (H+)10,11 utilizando un gradiente de Na+ hacia adentro. En los mamíferos, la familia de proteínas NHE incluye 11 relacionados con proteínas (NHE1-9 NHA1-2) y un espermatozoide específico NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a familia) se encuentran ubicuo en los organismos vivos más de simples procariotas a eucariotas superiores y están implicados en una variedad de células vitales funciones10,11, incluyendo control de la defensa de la salinidad de la célula en procariotas, mantener volumen de célula y homeostasis acido-base y regulación de la absorción de sal y agua en diversos epitelios especializados10,12,14,15. Las funciones biológicas clave de NHEs y la importancia de sus funciones han sido determinadas a través de varios estudios; sin embargo, pocos estudios han investigado las propiedades biofísicas y moleculares de mamíferos NHEs debido a limitaciones metodológicas4. Recientemente, la aplicación de la auto referencia ISEs en parche de célula entera sujeción ha revelado nuevos mecanismos moleculares de las isoformas NHE regulada por cambios en las concentraciones intracelulares de iones, proteínas y fosfolípidos3, 4.
Específicamente, el protocolo en este manuscrito describe los métodos y enfoques para el estudio de la actividad y la regulación de las isoformas NHE 3 (NHE3), un jugador importante en la absorción de Na+, Cl–, HCO3– y líquido en el membrana de frontera de cepillo del epitelio intestinal y renal14,16. Nueva visión sobre las diferencias en la sensibilidad de la actividad de NHE3 a fosfoinosítidos intracelular (phosphatidylinositide 4, 5-bifosfato [PI (4,5) P2] y phosphatidylinositide 3,4,5-trifosfato [PI(3,4,5]P3]) se divulga. Proteínas de transporte de la célula, tales como canales y transportadores, están reguladas por phosphoinositides17y NHE3 enlaza directamente PI (4,5) P2 y PI (3,4,5) P318. Basado en la literatura actual, ya sea Fosfoinositol podría ser relevante para la regulación fisiológica o fisiopatológica del NHE35,18,19. Nuestros resultados apoyan funciones separadas para PI (4,5) P2 y P3 de PI (3,4,5) en la regulación de la actividad de NHE3. Esta distinción fue posible debido a la aplicación de técnicas ISE en combinación con la grabación de abrazadera de parche de células completas. Esta técnica también permite el control del contenido celular de Fosfoinositol mediante la perfusión intracelular de fosfoinosítidos diferentes durante la medición de la actividad de NHE3.

<table><tbody><tr><td>Amplificador de abrazadera de parche</td><td>Electrómetro</td> diferencial de doble canal de Molecular Devices <td></td><td></td></tr><tr><td>(HiZ-223)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1650</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador diferencial (DP-301)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0044</td><td></td></tr><tr><td>Software de abrazadera de parche basado en MatLab</td><td>MatLab con caja</td><td></td> de herramientas de adquisición <td>Se recomienda el software del medidor de cápsulas</td></tr><tr><td>Sistema de control de temperatura ThermoClamp-1</td><td>&nbsp; Controlador</td> de temperatura de un solo canal (TC-324C) <td>Calentador en línea</td>AutoMate Scientific <td>03-11-LL</td></tr> (<tr><td>TC-324C)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vidrio de borosilicato estándar de un solo barril</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-3&nbsp; &nbsp;</td><td>Se utiliza para electrodos selectivos de iones</td></tr><tr><td>Tarro de almacenamiento de micropipetas</td><td>World Precision Instruments</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>Bis(dimetilamino)dimetilsilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14755-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tetracloruro de carbono</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319961-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ionóforo de hidrógeno I - cóctel B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95293</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de borosilicato de pared delgada</td><td>&nbsp; Instrumento Sutter</td><td>B200-156-15</td><td>Utilizado para pipeta de abrazadera de parche&nbsp;</td></tr><tr><td>Vidrio blando (Corning 8161 Patch Glass)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0815</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar de sílice (150um OD/75um ID)</td><td>Molex (Polymicro Technologies)</td><td>106815-0018</td><td>Utilizado para el sistema de perfusión intrapipeta</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Aspartato de potasio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>TUBERÍAS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MOPS Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Apirasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatidilinositol(4,5) bisfosfato diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-4508</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatidilinositol 3,4,5-trisfosfato diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-3908</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicación de medición de electrofisiología para estudiar la actividad de transportadores de electro-neutro

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

El transporte de iones a través de las membranas celulares asegura el control fino del contenido de iones dentro y fuera de la célula que es indispensable para la supervivencia de la célula. Estos mecanismos de transporte están mediados por la actividad de proteínas transportadoras especializadas. Específicamente, pH dinámica es finalmente controlado por sistemas de extrusión de protones (H+) membrana plasmática, como el Na+/+ h familia de proteínas de intercambiador (NHE). A pesar de grandes esfuerzos para estudiar los mecanismos que subyacen la regulación NHE, nuestra comprensión actual de las propiedades biofísicas y moleculares de la familia NHE es insuficiente debido a la limitada disponibilidad de métodos para medir con eficacia la actividad NHE . En este manuscrito, utilizamos H+-electrodos selectivos durante celulares parche sujeción grabación para medir flujo inducido NHE H+ . Nos propone este enfoque para superar algunas limitaciones de típicamente utiliza métodos para medir la actividad NHE, tales como la absorción radiactiva y fluorescente membrana permeants. Medición de la actividad NHE usando el método descrito permite la alta sensibilidad y resolución de tiempo y un control más eficiente de la concentración intracelular de H+ . H+-electrodos selectivos están basado en el hecho de que actividad transportista crea un gradiente de iones en proximidad cercana a la membrana celular. Un H+-Electrodo selectivo moviendo hasta y lejos de la membrana celular de manera repetitiva, oscilatoria registra una diferencia de voltaje que depende del flujo de H+ . Mientras que H+-electrodos selectivos se utilizan para detectar flujo H+ móvil fuera de la célula, el método de patch clamp en la configuración de célula entera se utiliza para controlar la composición de iones intracelulares. Por otra parte, aplicación de la técnica de abrazadera del remiendo gigante permite la modificación de la composición intracelular de iones, pero también lípidos. La actividad de transportador de las isoformas NHE 3 (NHE3) se midió usando este enfoque técnico para estudiar la base molecular de la regulación NHE3 de fosfoinosítidos.

Un auto hace referencia a ISE durante la grabación de abrazadera de celulares parche se aplicó para estudiar la regulación de la actividad de NHE3 por fosfoinosítidos. PS120 fibroblasto-como las células24, que carecen de la expresión de la membrana plasmática endógena NHEs, fueron utilizados. NHE3 de tipo salvaje (NHE3-wt) o NHE3 mutantes que no phosphoinositides del lazo [tirosina 501, 503 de arginina y lisina 505 fueron sustituidos con alanina, Y501A/R503A/K505A ...

Este manuscrito describe las aplicaciones de electrodos selectivos de protón y parche sujeción métodos para medir la actividad de los sistemas de transporte de protones. Estos métodos superaran algunas limitaciones de las técnicas comúnmente utilizadas para estudiar la actividad de transporte de protones, como sensibilidad moderada, resolución de tiempo y control insuficiente medio intracelular.

Aplicación de medición de electrofisiología para estudiar la actividad de transportadores de Electro-neutro

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

El método de parches gigantes combinados con microelectrodos selectivos de iones es un método versátil que se utiliza para detectar y cuantificar los flujos de iones. En concreto, se utiliza para medir los flujos de protones generados por la actividad del transportador de iones electroneutro, el intercambiador de sodio-hidrógeno o NHE, que se expresa en la membrana celular. El intercambiador de sodio-hidrógeno genera un gradiente de protones muy cerca de la membrana plasmática, indicado aquí como un anillo naranja.Este gradiente de protones a través de la membrana celular se mide mediante el registro de pinza de parche de célula completa combinado con una técnica que utiliza un microelectrodo selectivo de protones. El microelectrodo selectivo de protones se mueve cerca de la superficie de la célula, donde registra el flujo de protones que se alejan de las células, que se muestra aquí en la posición A. Y lejos de la superficie de la célula, donde registra la concentración de protones libres presentes en la solución indicada por la posición B. Y luego, de vuelta a la posición A, cerca de la membrana celular, en un movimiento repetitivo y oscilatorio. La diferencia de voltaje de A a B

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Investigación

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Biología

Hay obstáculos técnicos para la medición de flujo de corriente a través de los canales iónicos de forma simultánea, y luego discernir qué parte de la corriente transmembrana se debe a que cada tipo de canal. Para satisfacer esta necesidad, este método presenta una forma de generar la curva IV de los tipos de canal individual utilizando componentes de frecuencias específicas.

Recapitulación de una curva de canal iónico IV Uso de componentes de frecuencia

Describimos un método para cuantificar la actividad de las ATPasas de tipo P que contratransportan K+ mediante la expresión heteróloga de las enzimas en los ovocitos de Xenopus y midiendo la absorción de Rb+ o Li+ en células individuales mediante espectrofotometría de absorción atómica. El método es una alternativa sensible y segura a los experimentos de flujo de radioisótopos, ya que facilita estudios cinéticos complejos.

Medición de transporte de cationes por Na, K y H, K-ATPasa en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los ovocitos mediante espectrofotometría de absorción atómica: una alternativa a ensayos de radioisótopos

Aquí presentamos un método electrofisiológico basado en membranas de soporte sólido con el foco en sus aplicaciones para la caracterización de transportadores de membrana electrógenos.

Introducción a Solid membrana compatibles Basada Electrofisiología

Los protocolos de bucle cerrado están cada vez más extendidos en la electrofisiología moderna. Presentamos una forma sencilla, versátil y económica de realizar protocolos electrofisiológicos complejos en neuronas piramidales corticales in vitro, utilizando un ordenador de sobremesa y una placa de adquisición digital.

En tiempo real Electrofisiología: Usando protocolos de bucle cerrado para sondear neuronales Dinámica y allá

La primera parte de este artículo muestra cómo seleccionar líneas celulares mutantes que expresan intercambiadores vesiculares de Na+/H+ en su membrana plasmática. La segunda parte proporciona protocolos basados en mediciones de pH intracelular y absorción rápida de iones, que se utilizan para determinar la selectividad de iones y los parámetros cinéticos de estos intercambiadores.

Caracterización funcional de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Intercambiadores de compartimentos intracelular usando selección Protón-matanza para expresarlos a la membrana plasmática

Los transportadores en las membranas celulares permiten la segregación diferencial de iones a través de las membranas celulares o capas celulares y desempeñan un papel crucial durante la fisiología, reparación y patología de los tejidos. Describimos el microelectrodo autorreferencial selectivo de iones que permite la medición de flujos de iones específicos en células individuales y tejidos in vivo.

Medición de la extracelular Ion fundentes Uso del referencias Ion selectivo microelectrodos Técnica

Demostramos la fabricación, calibración y propiedades de dos tipos de microelectrodos selectivos de iones (de doble cañón y concéntricos) para la medición de concentraciones de iones en el tejido cerebral. A continuación, se utilizan en la preparación del corte del hipocampo del ratón para demostrar que la actividad excitatoria cambia las concentraciones extracelulares de potasio y sodio.

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En las mediciones electrofisiológicas, la presencia de un potencial de difusión perturba la medida exacta del potencial inversa alterando el potencial de electrodo. Usando un puente de sal micro-agar, se minimiza el impacto de la difusión potencial, que permite una medición más precisa de los números de facturación de sustrato de proteínas de membrana recombinantes reconstituido.

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Los nanocuerpos son herramientas importantes en biología estructural y suponen un gran potencial para el desarrollo de terapias. Sin embargo, la selección de nanocuerpos con propiedades inhibitorias puede ser un desafío. Aquí demostramos el uso de electrofisiología basada en membranas sólidas soportadas (SSM) para la clasificación de nanocuerpos inhibitorios y no inhibitorios dirigidos a transportadores de membrana electrogénicos.

Selección de nanocuerpos inhibitorios dirigidos al transportador mediante electrofisiología basada en membrana sólida soportada (SSM)

El presente protocolo destaca la aplicación de la técnica Western blotting para estudiar las funciones y actividades del cotransportador neuronal K-Cl KCC2. El protocolo describe la investigación de la fosforilación de KCC2 en los sitios reguladores de quinasa Thr906/1007 a través de Western blotting. Además, los métodos adicionales para confirmar la actividad de KCC2 se destacan brevemente en este texto.

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Para el estudio de las respuestas de las células excitables in vitro, el protocolo describe el seguimiento óptico de los cambios en la generación de potencial de acción debidos a la electroporación en un modelo simple de célula excitable simple de células HEK con spiging tet-on modificadas genéticamente, así como los cambios en el voltaje transmembrana con extracción automatizada de parámetros relevantes.

Monitoreo de cambios inducidos por electroporación en la generación de potencial de acción en celdas HEK de Tet-On Spiking diseñadas genéticamente

Aprende a medir flujos de protones generados por el intercambiador sodio-hidrógeno (NHE) mediante parches gigantes combinados con microelectrodos selectivos de protones y técnicas de patch clamp. Este método electrofisiológico permite estudiar la regulación molecular del transporte iónico en membranas celulares con alta sensibilidad y control del entorno intracelular.

Aplicación de medición de electrofisiología para estudiar la actividad de transportadores de Electro-neutro

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