Aplicación de medición de electrofisiología para estudiar la actividad de transportadores de Electro-neutro

El método de parches gigantes combinados con microelectrodos selectivos de iones es un método versátil que se utiliza para detectar y cuantificar los flujos de iones. En concreto, se utiliza para medir los flujos de protones generados por la actividad del transportador de iones electroneutro, el intercambiador de sodio-hidrógeno o NHE, que se expresa en la membrana celular. El intercambiador de sodio-hidrógeno genera un gradiente de protones muy cerca de la membrana plasmática, indicado aquí como un anillo naranja.

Este gradiente de protones a través de la membrana celular se mide mediante el registro de pinza de parche de célula completa combinado con una técnica que utiliza un microelectrodo selectivo de protones. El microelectrodo selectivo de protones se mueve cerca de la superficie de la célula, donde registra el flujo de protones que se alejan de las células, que se muestra aquí en la posición A. Y lejos de la superficie de la célula, donde registra la concentración de protones libres presentes en la solución indicada por la posición B. Y luego, de vuelta a la posición A, cerca de la membrana celular, en un movimiento repetitivo y oscilatorio. La diferencia de voltaje de A a B se registra y depende del representante de la actividad NHE.

Los iones transportadores, como los protones, a través de la membrana celular afectan el proceso esencial para la vida. Por lo tanto, los cambios en el pH están estrictamente regulados por una serie de moléculas, incluido el intercambiador de sodio-protones, un sistema de exclusión de protones de la membrana plasmática. El microelectrodo de pH oscilante combinado con la fijación de parches de celda completa es un enfoque novedoso para estudiar el flujo de protones mediado por la actividad del intercambiador de sodio-protón.

La aplicación de estos métodos supera algunas de las principales limitaciones de las técnicas típicamente utilizadas para medir la actividad del intercambiador de sodio-protón, como la sensibilidad moderada y la resolución del tiempo y otro buen control del entorno intracelular. Daré una demostración de los métodos junto con mi colaborador, el Dr. Victor Babich. El Dr. Matthew Henry será el narrador.

Vamos a demostrar una aplicación de este método midiendo la actividad de la isoforma tres del intercambiador de sodio-protón, que es un importante regulador de la absorción de sal en el agua a través del intestino y el epitilio renal. Los microelectrodos selectivos de protones para la medición de la concentración de protones se fabrican a partir de tubos de vidrio borosilicato estándar. Los electrodos de vidrio de borosilicato con un diámetro exterior de 1,2 milímetros y sin filamento se tiran con un extractor vertical, utilizando un protocolo convencional de doble tracción.

Se obtiene una punta de pipeta de dos a tres micrómetros de diámetro. Las pipetas se colocan en un soporte para tarros con la punta de la pipeta hacia arriba. A continuación, se prepara una mezcla para siliconar las pipetas.

Se vierte en un frasco y la tapa se cierra herméticamente. Las pipetas se incuban con la mezcla de siliconización durante 24 a 48 horas. Tenga cuidado, asegúrese de preparar la mezcla y siliconar las pipetas a temperatura ambiente en una campana de gases químicos bien ventilada.

Vuelva a llenar la pipeta con la resina selectiva de iones adecuada y colóquela con cuidado verticalmente en un soporte de frasco con la punta de la pipeta hacia abajo. Para prepararse para la sujeción de parches, comience tirando de pipetas de sujeción de parches de vidrio de borosilicato de paredes delgadas con un diámetro externo de dos milímetros y un diámetro interno de 1,4 milímetros en un extractor vertical utilizando el protocolo convencional de doble tracción. Utilice una microforja montada en una platina de un microscopio invertido para hacer una punta de pipeta ancha.

Coloque la pipeta cerca del grueso alambre de platino de la microforja. Encienda la calefacción con un interruptor de pie que controla el encendido y apagado de la corriente. Caliente el vidrio de bajo punto de fusión que cubre el centro del grueso alambre de platino de la microforja y, a continuación, acerque la punta de la pipeta al vidrio blando fundido.

El calentamiento mueve el alambre de platino ligeramente hacia el centro. El alambre de platino vuelve a la posición inicial y la punta de la pipeta se rompe. Repita el procedimiento hasta obtener el diámetro de punta deseado y, finalmente, aplique calor para alisar la punta.

Las puntas de pipeta tienen 10 micrómetros de diámetro después de pulirlas con la microforja. El uso del alambre de platino grueso es un beneficio, ya que hay poca expansión después de encender la electricidad y menos posibilidad de sobrecalentar el cable y la pipeta con una corriente excesiva. Después de que las células se disocian con tripsina y se bloquea la tripsinización, las células se mantienen en un agitador con balanceo para evitar la formación de grumos.

Esto se hace hasta dos horas después de la tripsinización. La configuración de electrofisiología consiste en un controlador de temperatura para regular la temperatura de la solución en el sistema de perfusión. Todos los experimentos se realizan a unos 37 grados centígrados.

Y un conmutador de filtro óptico para controlar la rueda de filtros para imágenes de fluorescencia. Un controlador de válvulas del sistema de perfusión para regular la apertura y el cierre de las válvulas del sistema de perfusión. Y el controlador de temperatura para regular la temperatura de la cámara de registro.

Un osciloscopio para observar formas de onda y un amplificador de pinza de parche. Un ordenador que ejecuta este software Capmeter. Y un electrómetro para registrar la señal de microelectrodo selectivo de iones.

Y un amplificador diferencial para amplificar la señal del electrómetro. La instalación de electrofisiología también está equipada con un microscopio invertido con controlador de etapa, dos micromanipuladores con controladores colocados en los sitios izquierdo y derecho del microscopio, el sistema de perfusión con calentador de solución en línea. Después de montar la pipeta de microelectrodo selectivo de iones en el micromanipulador, rellene la pipeta de sujeción del parche con la solución intracelular.

Asegúrese de que la solución llegue a la punta de la pipeta. Es posible que sea necesario dar varios golpecitos suaves para eliminar las burbujas en la punta de la pipeta. A continuación, monte la pipeta de sujeción del parche en la etapa principal de la configuración de electrofisiología.

Transfiera suavemente las células sanas que parecen a la cámara de registro llena de un volumen definido de solución de baño. Es importante mantener la etapa de la cabeza en un ángulo de 45 grados con respecto al eje horizontal. Esto garantiza un ángulo de entrada para la pipeta que es adecuado para la formación de un sello altamente resistente.

Mientras la pipeta de pinza de parche se baja en la solución de baño, aplique una pequeña cantidad de presión positiva a la pipeta para reducir la posibilidad de que la punta se bloquee. Seleccione una celda y acérquese a ella con una pequeña cantidad de presión positiva. Deje de mover la pipeta de pinza de parche una vez que la punta esté cerca de la célula.

Baje el microelectrodo selectivo de iones en la solución de baño hasta que esté en el mismo plano focal que la punta de la pipeta de pinza de parche. Cuando la pipeta esté colocada en el centro sobre la célula, inicie el sellado aplicando una pequeña cantidad de presión negativa. Se obtiene un sello de mega-ohmios en unos pocos segundos.

Asegúrese de que el amplificador mantenga el potencial de retención a cero milivoltios. Finalmente, rompe la membrana celular con una serie de pulsos cortos de succión e inicia el registro. Utilizando el método de registro de parches gigantes, es posible perfundir soluciones rápidamente en la pipeta de vidrio a través de un sistema de perfusión intrapipeta para modificar el contenido intracelular de iones, lípidos y proteínas.

Coloque la pipeta de microelectrodo selectivo de iones cerca de la celda sujeta por la pipeta de pinza de parche e inicie la oscilación de la pipeta de microelectrodo selectivo de iones moviéndola hacia y desde la celda. La aplicación de esta técnica permite estudiar la regulación molecular del intercambiador sodio-hidrógeno. Aprovechando el método de parches gigantes, se modificó la composición intracelular de ATP y lípidos mediante un sistema de perfusión intrapipeta.

La perfusión intracelular de la apirasa, que hidroliza el ATP intracelular y disminuye el contenido de fosfoinositida, provocó una disminución del 50% en la actividad de la isoforma tres de NHE. El efecto de la apirasa sobre la actividad de NHE3 no se revirtió mediante la perfusión intracelular del fosfoinositida, PIP2. Sin embargo, se revirtió mediante la perfusión intracelular del fofoinositida, PIP3.

La medición de la actividad de NHE aprovecha la combinación de los métodos de microelectrodo selectivo de protones y fijación de parches. Esto permite el estudio de las bases moleculares detrás de la regulación diferencial de NHE por fosfoinositidos y cascadas de señales aguas abajo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo medir la actividad del intercambiador de sodio-protones utilizando un microelectrodo de pH oscilante combinado con la sujeción de todos los parches celulares.

Y un ejemplo de posible aplicación de los métodos.