Name: Aislamiento y cultivo de progenitores neuronales seguido por inmunoprecipitación de cromatina de histona 3 lisina 79 dimetilación marca (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprende a aislar y cultivar progenitores neuronales cerebelosos para analizar modificaciones epigenéticas mediante ChIP de H3K79me2. Este protocolo permite estudiar la regulación de la metilación de histonas durante el desarrollo cerebral.

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Agradecemos a Henriette Bertemes para ayudar a establecer el protocolo de cultivo de CGN dentro del laboratorio. Este papel de método fue apoyada por la DFG financió CRC992 médico epigenética por financiación a TV. Los autores reconocen el apoyo del equipo galaxia Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning y Prof. Rolf Backofen, bioinformática, Universidad de Freiburg, Alemania financiado por colaboración investigación 992 centro médico epigenética (grant DFG SFB 992/1 de 2012) Ministerio Federal alemán de educación e investigación (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten

Hay dos maneras principales de inmunoprecipitación de cromatina para detectar la ocupación genómica de modificaciones de las histonas, factores de transcripción, lectores de código de las histonas, escritores o gomas de borrar. Uno es el método de ChIP nativo con nucleasa digerida, la cromatina nativa para la inmunoprecipitación, y el otro es el método presentado con cromatina PFA-fijo, esquilada, en el que los nucleosomas y otras proteínas ADN Unido están covalentemente al ADN 39. ChIP nativo con...

Las funciones sensoriales, motores y cognitivas del cerebro son altamente complejas y susceptibles a los cambios físicos y ambientales. El cerebro consta de tres partes generales el hind-, mediados de y prosencéfalo, que están profundamente conectados. En el prosencéfalo, el telencéfalo puede dividirse en un telencéfalo dorsal (DT) y un telencéfalo ventral (VT). El DT de los ratones consiste en seis capas corticales que se forman entre E11.5 y E18.5 en una manera de "inside-out"1. El VT incluye las eminencias ganglionares en desarrollo, que posteriormente forman los ganglios basales2,3. Varios tipos celulares se pueden clasificar en mamífero sistema nervioso central tales como neuronas, astrocitos y oligodendrocitos4, que se convierten en una forma temporo-espacial5. En primer lugar, las células progenitoras neurales (PNJ) dan lugar a diferentes tipos de neuronas, interneuronas en las VT y las neuronas de proyección en el despegue y más tarde en las células gliales (p. ej., astrocitos6). Durante el desarrollo cortical, la capa más superficial (capa I), que contiene las células de Cajal-Retzius, está formado en primer lugar. Luego, entre E12.5 y E14.5, NPCs generan capas más profundas neuronales (VI, V) mientras que entre 14,5 y 16,5, progenitores dan lugar a las neuronas de la capa superior (IV-II)7,8. Identidad neuronal está especificado por diferentes programas transcripcionales temporo-espacial inducida por morfógeno y además por programas epigenéticos2.
El cerebelo, que está implicado en la coordinación motora, se encuentra en el cerebelo y se desarrolla entre E10 y P20 en ratones9. Contiene la corteza cerebelosa y los núcleos cerebelosos10. La corteza cerebelosa adultos consta de tres capas, la capa molecular externa, la capa de células de Purkinje y la capa granular más interna que contiene las neuronas granulares10. Las células del gránulo cerebeloso son las neuronas más pequeñas y representan alrededor del 80% de todas las neuronas en el cerebro vertebrados11. Se desarrollan a partir de precursores en la zona germinal externa y migran a través de la capa de células de Purkinje a su destino12. Como en el telencéfalo, el desarrollo del cerebelo está regulado por varios importantes morfógenos, que tienen funciones específicas de tiempo y espacio dependiente e iniciar define programas transcripcionales10.
El desarrollo de capas corticales y cerebelosas es controlado por la expresión transcripcional de morfógenos específicos y, por tanto, el estado de la cromatina de la DNA. En una visión simplificada, Estados de la cromatina pueden dividirse en eucromatina como transcripcionalmente activo y heterocromatina regiones transcripcionalmente silencioso. Como la unidad básica de la cromatina nucleosoma contiene dos copias de cada histona núcleo H2A, H2B, H3 y H4, rodeado de 147 pares de bases de ADN13. Las histonas son modificadas altamente postraduccional por metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, la sumoilación, ADP-ribosylation, desaminación y prolina isomerización14,15. La metilación de lisina de las histonas se considera que la modificación de las histonas más estable que controla la transcripción, replicación, recombinación16, daño de la DNA respuesta17e impresión genómica18. Lisinas pueden ser mono-, di- o tri-metilados19 y aparecer en las colas de las histonas accesible, sino también en el dominio globular de las histonas20. Metilaciones específicas en H3K4 y H3K36 se asocian principalmente a eucromatina, metilaciones específicas en H3K9 H3K27 y H4K20 se encuentran principalmente en regiones heterochromatic, aunque todos los residuos se encuentran a la cola de las histonas14, 19,21. Metilación de H3K79 se encuentra en el dominio globular de las histonas y se ha asociado con la actividad transcripcional, sino también con las regiones genomic transcripcionalmente inerte22. La modificación evolutionarily se conserva ya que se ha observado en levaduras, timo de ternero, pollo y humana23. H3K79 mono, di y trimetilación (H3K79me1, me2 y me3) son catalizadas por la histona metiltransferasas DOT1L24,25 y la Nuclear conjunto dominio-que contienen la proteína 2 (Nsd2)26. DOT1L está implicado en la proliferación y reparación del ADN celular reprogramación27. Pérdida de Dot1l en ratones conduce a una muerte prenatal alrededor de la etapa de desarrollo E10.528,29. Durante el desarrollo del corazón y en la diferenciación de myocardiocyte, DOT1L es esencial para gene expresión Reglamento30. En el sistema nervioso central, función DOT1L podría estar implicada en el tubo neural desarrollo31, está implicado en la supresión de Tbr1-expresión durante el desarrollo de cerebro anterior32y puede funcionar en la regulación de la tensión ER de genes de respuesta33. Contexto-dependiente de la activación o represión acción de H3K79me, especialmente con en vivo situaciones como el desarrollo del sistema nervioso central, es hasta la fecha sólo parcialmente entendida32. Puesto que la metilación del H3K79 se encuentra en el dominio globular de la histona 3, es sterically menos accesible en comparación con modificaciones de la histona flexible cola23. Para entender la función de la metilación de H3K79, se necesitan métodos de análisis fiables y reproducibles para determinar su ubicación y entorno genómico. En este trabajo métodos, presentamos métodos de aislamiento de diferentes progenitores neuronales (CPCs de la corteza) y CGNPs para el cerebelo, eficaz tratamiento del inhibidor de DOT1L y un método de ChIP para analizar H3K79 metilación mediante qPCR o secuenciación en tiempo diferente puntos durante el desarrollo cortical y cerebeloso. Para tener una visión general del protocolo y sus posibilidades, vea la figura 1.

<table><tbody><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>Categoría:</fuerte> Anticuerpo <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> Dilución de inmunoblot 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>Categoría:</fuerte> Anticuerpo Abreviatura/Comentario:</fuerte> Dilución de inmunoblot 1:3000</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Diagenode</td><td>pAb-051-050</td><td>Categoría:</fuerte> Anticuerpo <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> Anticuerpo ChIP</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Abcam</td><td>ab-051-050</td><td>Categoría:</fuerte> Anticuerpo <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> Dilución de inmunotransferencia 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-conejo-IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15410206</td><td><fuerte>Categoría:</fuerte> Anticuerpo <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> ChIP Ctrl anticuerpo</td></tr><tr><td>anti-Tubulina alfa</td><td>Abcam</td><td>ab108629</td><td><fuerte>Categoría:</fuerte> Anticuerpo <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> Dilución de inmunotransferencia 1:3000</td></tr><tr><td>Apo-Transferrina (1 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td><fuerte>Categoría:</fuerte> Cultivo celular <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> Para el suplemento CCM</td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td><fuerte>Categoría:</fuerte> Cultivo celular <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> Para CCM</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent technologies G2940CA</td><td></td><td><fuerte>Categoría:</fuerte> ChIP <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> Para el análisis de la cromatina cortada</td></tr><tr><td>Bioruptor NextGen</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>Categoría:</fuerte> ChIP <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte></td></tr><tr><td>Ultrasonido Ácido bórico pH 8.4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Categoría: Cultivo celular Abreviatura/Comentario: Para el cultivo de CPC</td></tr><tr><td>CFX Connect RT Sistema de detección de PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td>Categoría: ChIP Analysis Abreviatura/Comentario: Sistema de detección para qPCR</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Categoría: Cultivo celular Abreviatura/Comentario: For CGM</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>10001D</td><td>Categoría: ChIP Abreviatura/Comentario: Perlas magnéticas, para ChIP</td></tr><tr><td>EPZ-5676</td><td>Selleckchem</td><td>S7062</td><td><fuerte>Categoría:</fuerte> Inhibición de DOT1L <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> Para la inhibición de DOT1L en cultivo celular</td></tr><tr><td>Etilendiamina ácido tetraacético</td><td>SERVA</td><td>39760.01</td><td>Categoría:</fuerte> ChIP Abreviatura/Comentario:</fuerte> EDTA</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino 10% (v/v)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Categoría: Cultivo celular Abreviatura/Comentario: Para el aislamiento de CPC y CGM</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>Categoría: Cultivo celular Abreviatura/Comentario: Para el aislamiento de CGNP</td></tr><tr><td>Glutatión (1,25 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td><fuerte>Categoría:</fuerte> Cultivo celular <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> Para CCM</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3187</td><td>Categoría:</fuerte> ChIP Abreviatura/Comentario:</fuerte> Para la fijación celular</td></tr><tr><td>GoTaq mastermix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td><fuerte>Categoría:</fuerte> Análisis ChIP <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> Mezcla maestra de ADN polimerasa para qPCR</td></tr><tr><td>Hank' s Solución salina equilibrada</td><td>Life Technologies</td><td>14025-100</td><td>Categoría:</fuerte> Cultivo celular Abreviatura/Comentario:</fuerte> HBSS</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td><fuerte>Categoría:</fuerte> Cultivo celular Abreviatura/Comentario:</fuerte> para CCM</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Categoría: Cultivo celular Abreviatura/Comentario: Para el cultivo de CPC</td></tr><tr><td>Cloruro de litio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td>Categoría: ChIP Abreviatura/Comentario: Suplemento de LiCl</td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies 17502048</td><td></td><td>Categoría: Cultivo celular Abreviatura/Comentario: Para CGM</td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher</td><td>3300</td><td>Categoría: ChIP Abreviatura/Comentario: Fluoroespectrómetro para la cuantificación de ADN</td></tr><tr><td>NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit para Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645S</td><td>Categoría: ChIP Analysis Abreviatura/Comentario: Kit para la preparación</td></tr><tr><td>de bibliotecas NEBNext Multiplex Oligos para Illumina</td><td>NEB</td><td>E7335</td><td>Categoría: ChIP Analysis Abreviatura/Comentario: Oligos para la preparación de bibliotecas</td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Categoría: Cultivo celular Abreviatura/Comentario: Para CCM</td></tr><tr><td>NP-40 Alternative</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td>Categoría: ChIP Abreviatura/Comentario: Para tampón ChIP</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Carl Roth</td><td>335</td><td><fuerte>Categoría:</fuerte> ChIP <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> PFA, para la fijación celular</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Neomicina 1% (v/v)</td><td>Life Technologies</td><td>15640055</td><td><fuerte>Categoría:</fuerte> Cultivo celular <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> PSN, para CCM y CGM</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td><fuerte>Categoría:</fuerte> Cultivo celular <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> PBS, para aislamiento de CPC</td></tr><tr><td>PicoGreen Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11496</td><td>Categoría: ChIP Analysis Abreviatura/Comentario: Visualización de colorante para la cuantificación de ADN</td></tr><tr><td>Poly-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Categoría: Cultivo celular Abreviatura/Comentario: Para el aislamiento de CGNP</td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-L-ornitina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td>Categoría: Cultivo celular Abreviatura/Comentario: Para el cultivo de CPC</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9640G</td><td>Categoría: Cultivo celular Abreviatura/Comentario: KCl, para</td></tr><tr><td>el inhibidor de la proteasa</td> CGM <td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Categoría: ChIP Abreviatura/Comentario: para ChIP</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115879001</td><td><fuerte>Categoría:</fuerte> ChIP <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> para ChIP</td></tr><tr><td>Qiagen MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Categoría: ChIP Abreviatura/Comentario: Kit para la purificación de ADN</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Categoría: ChIP Abreviatura/Comentario:</fuerte> Para ChIP</td></tr><tr><td>SGC0946</td><td>Selleckchem</td><td>S7079</td><td>Categoría:</fuerte> Inhibición de DOT1L <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> Para la inhibición de DOT1L en cultivo celular</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Carl Roth</td><td>8551.1</td><td>Categoría:</fuerte> ChIP <fuerte>Abreviatura/Comentario: </fuerte> para tampón de elución</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>Categoría:</fuerte> ChIP <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> NaCl, para tampón ChIP</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td><fuerte>Categoría:</fuerte> ChIP <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> para ChIP</td></tr><tr><td>Sodio dodecililsulfato</td><td>Carl Roth</td><td>183</td><td>Categoría: ChIP Abreviatura/Comentario: SDS, para ChIP</td></tr><tr><td>Sonic hedgehock (SHH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP6004</td><td>Categoría: Cultivo celular Abreviatura/Comentario: Para el aislamiento</td></tr><tr><td>de CGNP Superóxido dismutasa (1mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7571</td><td>Categoría: Cultivo celular Abreviatura/Comentario: Para CCM</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td>Carl Roth</td><td>9090</td><td>Categoría: ChIP Abreviatura/Comentario: TRIS, para tampón ChIP</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>X100</td><td>Categoría: ChIP Abreviatura/Comentario: Para tampón ChIP</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05% (w/v)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59417C</td><td>Categoría: Cultivo celular Abreviatura/Comentario: Para el aislamiento de CPC</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Carl Roth</td><td>28320</td><td><fuerte>Categoría:</fuerte> ChIP <fuerte>Abreviatura/Comentario:</fuerte> Para la preparación de cuentas</td></tr><tr><td>Otros dispositivos de laboratorio: Cámara de recuento Neubauer, Incubadora, Rotador, Agitador, Juego de disección, Baño</td><td></td><td></td><td></td>de agua</tr><tr><td>CCM: Medio de célula</td><td></td><td></td><td></td>cortical</tr><tr><td>CGM: Medio</td><td></td><td></td><td></td> de cultivo celular CGNP</tr></tbody></table>

aislamiento y cultivo de progenitores neuronales seguido por inmunoprecipitación de cromatina de histona 3 lisina 79 dimetilación marca

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Desarrollo del cerebro es un proceso complejo, que es controlado en forma temporo-espacial por gradientes de morfógenos y diferentes programas transcripcionales. Además, modificaciones epigenéticas de la cromatina, como la metilación de las histonas, tienen un papel importante para establecer y mantener destinos celulares específicas dentro de este proceso. La gran mayoría de la metilación de las histonas se produce en la cola de la histona flexible, que es accesible a los modificadores de las histonas, los borradores y proteínas de histona lector. En cambio, metilación de H3K79 se encuentra en el dominio globular de la histona 3 y está implicada en diversas funciones del desarrollo. H3K79 metilación evolutionarily se conserva y puede encontrarse en una amplia gama de especies de Homo sapiens a Saccharomyces cerevisiae. La modificación se produce en diferentes poblaciones celulares dentro de los organismos, incluyendo progenitores neuronales. La ubicación de la metilación de H3K79 en el dominio globular de la histona 3 hace difícil evaluar. Aquí se presentan métodos para aislar y progenitor cortical cultura (CPCs) con células de tejido embrionario cerebro cortical (E11.5-E14.5) o progenitores de neuronas granulares cerebelosas (CGNPs) del tejido postnatal (P5-P7) y eficientemente immunoprecipitate H3K79me2 para PCR cuantitativa (qPCR) y secuenciación del genoma.

Régimen general de progenitoras neurales aislamiento, cultivo, métodos de análisis de H3K79me2 ChIP y ChIP: La figura 1 muestra un diagrama de flujo para realizar H3K79me2 ChIP de células progenitoras cortical en diferentes momentos durante el desarrollo embrionario del cerebro o de progenitores de neuronas granulares cerebelosas en etapas postnatales. Como primer paso, el cerebro tiene que ser aislado y el telencéfalo (entre E11.5 y E14.5) o...

Presentamos un método eficaz y reproducible para aislar las células progenitoras neurales de tejido cerebral embrionario y postnatal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la histona 3 lisina 79 dimetilación (H3K79me2) - una marca de histona situada dentro de la cultura el dominio globular de la histona 3.

Aislamiento y cultivo de progenitores neuronales seguido por inmunoprecipitación de cromatina de histona 3 lisina 79 dimetilación marca

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

El objetivo general de este procedimiento es analizar las modificaciones epigenéticas durante el desarrollo del cerebro, especialmente en la corteza cerebral y el cerebelo. Este método se puede utilizar para responder a preguntas clave en el campo de la neurobiología, como por ejemplo cómo las modificaciones de histonas como la metilación de H3K79 pueden afectar el desarrollo de capas corticales y cerebelosas. La principal ventaja de esta técnica es que podemos estudiar in vivo las modificaciones de las histonas, específicas del locus o del genoma, en distintas regiones del cerebro en puntos temporales de desarrollo específicos.Comience con cerebros de P5 a P7 y ratones de resonancia magnética. Extirpar todas las meninges y vasos sanguíneos. Luego, transfiera de tres a cinco cerebelos por chip a tubos de 15 mililitros.Lavar el cerebelo con glucosa HBSS antes de la centrifugación. Centrifuga los tubos para recoger el tejido. Después del lavado final, homogeneice el cerebelo pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces con una pipeta de un mililitro hasta que los fragmentos tengan un tamaño de 0,5 a un milímetro cúbico.Retire suavemente todo el líquido hasta que queden 2,5 mililitros. A continuación, añada el 0,05% de tripsina en el tubo con glucosa HBSS que contiene el cerebelo. E incubar el tejido en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 15 minutos.Invierta el tejido cada uno a tres minutos. Después de la incubación, detenga la digestión agregando cinco mililitros de medio de cultivo celular CGNP, o CGM, y recoja el tejido por centrifugación como antes. Después de centrifugar, retire el sobrenadante y agregue un mililitro de MCG.Triturar el tejido con una punta de pipeta de un mililitro, evitando la formación de burbujas de aire. A continuación, añade cinco mililitros de MCG e incuba la mezcla durante dos minutos en hielo para asentar los restos de tejido. Una vez que el tejido se haya asentado, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mililitros.A continuación, añada dos mililitros de MCG al tejido residual y repita el procedimiento de trituración antes de cosechar el sobrenadante y desechar los restos de tejido. Agrupe los sobrenadantes de cada tubo de tejido de 15 mililitros y centrifugue para recolectar las células cerebelosas. Vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de MCG.Dado que los astrocitos se adhieren más rápido y más fuerte a la poli-D-lisina que los CGNP, agregue hasta cuatro mililitros de suspensión celular a los pocillos de placas de 6 pocillos recubiertas de poli-D-lisina e incube durante 20 minutos a 37 grados Celsius para eliminar los astrocitos. Agite la placa, recoja el sobrenadante en un tubo de 15 mililitros y luego centrifugue el sobrenadante como antes. Vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de MCG y cuente las células con una cámara de recuento de Neubauer.Después de cuatro a seis horas, los CGNP adheridos aparecen redondos y proliferativos. Siembre las células en CGM en placas recubiertas de poli-L-ornitina e incube a 37 grados Celsius, 5% de CO2 y 100% de humedad relativa. Después de un día in vitro, o DIV1, la mayoría de los CGNP son redondos y proliferan.Algunos CGNP comenzarán a diferenciarse y comenzarán a desarrollar protuberancias neuronales. Para fijar las células cultivadas, agregue hasta un mililitro de PFA al 1% directamente a los pocillos que contienen CGNP. Después de una incubación de cinco minutos a 22 grados centígrados, agregue 53 microlitros de glicina y lave dos veces con tres mililitros de PBS helado.Use un raspador de células para recolectar las células en un mililitro de PBS. Transfiera las células a tubos de 1,5 mililitros y centrifugue durante cinco minutos a 1.000 g y cuatro grados centígrados. Después de eliminar el sobrenadante, agregue 700 microlitros de tampón de lisis que contenga inhibidor de la proteasa e incube las muestras durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.Agite las muestras cada cinco minutos durante este tiempo. Después de la incubación, divida los tubos de muestra para asegurarse de que el volumen no supere los 400 microlitros por tubo. A continuación, sonicar durante 10 minutos a máxima potencia para cizallar la cromatina de las células de lisis.Después de 10 minutos, agite las muestras y luego repita la sonicación y el vórtice dos veces más. Compruebe el lisado en busca de núcleos restantes con un microscopio de contraste de fase o un microscopio fluorescente con DAPI. Granular los restos celulares centrifugando durante 10 minutos a 13.000 g y cuatro grados centígrados.Cuando termine, use el sobrenadante para el paso de limpieza previa. Para preaclarar las muestras, primero lave 20 microlitros de perlas magnéticas no conjugadas por muestra en PBS Tween helado. Retire los lavados con la ayuda de un soporte magnético.A continuación, añada 600 microlitros de tampón de dilución y 20 microlitros de perlas magnéticas lavadas a cada muestra para la limpieza previa e incube durante dos horas a cuatro grados centígrados en un rotador. Después de la incubación, retire las perlas con un soporte magnético. A continuación, tome el 5% de cada lisado como muestras de entrada y congélelas a menos 20 grados centígrados.El acoplamiento de anticuerpos se puede realizar mientras las muestras se autorizan previamente. Lave 45 microlitros de perlas magnéticas de proteína A por chip con PBS Tween helado, como antes. Después del lavado final, agregue un mililitro de PBS helado a las cuentas.A continuación, añada tres microgramos de anticuerpo por alícuota de 45 microlitros de perlas. Incubar durante dos horas a cuatro grados centígrados en un rotador para unir los anticuerpos a las perlas. Cuando haya transcurrido el tiempo de incubación, vuelva a suspender las perlas acopladas a anticuerpos lavadas en un volumen de perlas de PBS helado.Divida cada extracto previamente aclarado en dos tubos de aproximadamente 643,5 microlitros. Agregue el mismo volumen de tampón de dilución y perlas unidas a anticuerpos e incube las muestras a cuatro grados centígrados durante la noche en un rotador. Al día siguiente, lave las perlas con tampones de chips helados del uno al tres durante 10 minutos cada uno en un rotador a cuatro grados centígrados, siga con tres lavados de cinco minutos con tampón TE.Agregue el tampón de elución y diluya durante una hora a 1, 400 RPM en un agitador a temperatura ambiente. Una vez transcurrida la hora, añadir 10 microgramos de Rnase a cada muestra de chip y cinco microgramos a las muestras de entrada. Incubar las muestras en el agitador durante 30 minutos a 37 grados centígrados.Finalmente, agregue 100 microgramos de proteinasa K por muestra de chip y 50 microgramos por entrada. Incubar durante la noche a 65 grados centígrados a 1, 400 RPM. Los niveles de dimetilación de H3K79 disminuyen después de tres días de cultivo con CPC e inhibición de DOT1L por SGC 0946.La QCPR después del análisis de chips reveló que los genes con altos niveles de metilación de histona-3-lisina-79 al inicio del estudio respondieron mejor al tratamiento con inhibidores. Los genes con una menor cobertura de dimetilación de H3K79 no mostraron cambios significativos en los niveles de metilación. Este mapa de calor muestra que los niveles de metilación de la histona-3-lisina-79 alcanzan su punto máximo alrededor del sitio de inicio de la transcripción y disminuyen hacia el sitio final de la transcripción.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una semana, si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la inmunoprecipitación de cromatina en las modificaciones de histonas en células cerebrales aisladas.

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La heterogeneidad celular del tejido cerebral supone una limitación importante para el estudio de las marcas epigenéticas en la cromatina, porque la mayoría de los ensayos de la falta de resolución única célula. Las neuronas normalmente se entremezclan con la glía y otras células no neuronales. Ofrecemos un protocolo para extraer y recoger los núcleos neuronales del cerebro humano.

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Con frecuencia se alteran mecanismos epigenéticos en glioma. Inmunoprecipitación de cromatina podría utilizarse para estudiar las consecuencias de las alteraciones genéticas en gliomas que resultan de cambios en las modificaciones de las histonas que regulan la transcripción de la cromatina estructura y gene. Este protocolo describe inmunoprecipitación de cromatina nativa de neuroesferas de tumor de cerebro murino.

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Aislamiento y cultivo de progenitores neuronales seguido por inmunoprecipitación de cromatina de histona 3 lisina 79 dimetilación marca

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