Name: Metodología para la neuromodulación química Biomimetic de Retinas de ratas con el neurotransmisor glutamato In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: Aprende la neuromodulación química biomimética de retinas de ratas usando glutamato in vitro. Este método ofrece mayor agudeza visual y visión más natural que la estimulación eléctrica para tratar ceguera neurodegenerativa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El trabajo presentado en el documento fue apoyado por la National Science Foundation, nuevas fronteras en la investigación y el programa de innovación (NSF-EFRI) número 0938072 de la concesión. El contenido de este documento es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la NSF. Los autores también desean agradecer al Dr. Samsoon Inayat su trabajo diseñando y probando la configuración experimental inicial para la estimulación química y Sr. Ashwin Raghunathan por su trabajo de diseño, fabricación y evaluación del dispositivo de microfluidos multipuerto utilizado en Este estudio.

<ol><li>Pascolini, D., Mariotti, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+visual+impairment%3A+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Global estimates of visual impairment: 2010.</a> Br J Ophthalmol. , (2011).</li>
<li>Fritsche, L. G., Fariss, R. N., Stambolian, D., Abecasis, G. R., Curcio, C. A., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Macular+Degeneration%3A+Genetics+and+Biology+Coming+Together%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Age-Related Macular Degeneration: Genetics and Biology Coming Together.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 15, 151-171 (2014).</li>
<li>Marc, R. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17591910">Neural reprogramming in retinal degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 3364-3371 (2007).</li>
<li>Jones, B. W., Kondo, M., Terasaki, H., Lin, Y., McCall, M., Marc, R. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22644448">Retinal remodeling.</a> Jpn J Ophthalmol. 56, 289-306 (2012).</li>
<li>Soto, F., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+remodeling+of+neuronal+circuits+in+early+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic remodeling of neuronal circuits in early retinal degeneration.</a> Front Cell Neurosci. 9, (2015).</li>
<li>Trenholm, S., Awatramani, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+spontaneous+activity+in+the+degenerating+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origins of spontaneous activity in the degenerating retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, (2015).</li>
<li>Euler, T., Schubert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Independent+Oscillatory+Networks+in+the+Degenerating+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple Independent Oscillatory Networks in the Degenerating Retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, (2015).</li>
<li>Boye, S. E., Boye, S. L., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Review+of+Retinal+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Review of Retinal Gene Therapy.</a> Mol Ther. 21, 509-519 (2013).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+Stargardt%27s+macular+dystrophy%3A+follow-up+of+two+open-label+phase+1%2F2+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies.</a> The Lancet. 385, 509-516 (2015).</li>
<li>Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+Transplantation+in+Late+Stage+Retinal+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor Transplantation in Late Stage Retinal Degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (2016).</li>
<li>Zrenner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fighting+blindness+with+microelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Fighting blindness with microelectronics.</a> Sci Transl Med. 5, (2013).</li>
<li>Humayun, M. S., de Juan, E. Jr, Dagnelie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bionic+Eye%3A+A+Quarter+Century+of+Retinal+Prosthesis+Research+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The Bionic Eye: A Quarter Century of Retinal Prosthesis Research and Development.</a> Ophthalmol. 123, S89-S97 (2016).</li>
<li>Cruz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Argus+II+epiretinal+prosthesis+system+allows+letter+and+word+reading+and+long-term+function+in+patients+with+profound+vision+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The Argus II epiretinal prosthesis system allows letter and word reading and long-term function in patients with profound vision loss.</a> Br J Ophthalmol. 97, 632-636 (2013).</li>
<li>Zrenner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+electronic+chips+allow+blind+patients+to+read+letters+and+combine+them+to+words%5BTitle%5D)+AND+%22P+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words.</a> P R Soc B. 278, 1489-1497 (2011).</li>
<li>Stronks, H. C., Dagnelie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+performance+of+the+Argus+II+retinal+prosthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Med+Devices%22%5BJournal%5D)">The functional performance of the Argus II retinal prosthesis.</a> Expert Rev Med Devices. 11, 23-30 (2014).</li>
<li>Stingl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+vision+with+wirelessly+powered+subretinal+electronic+implant+alpha-IMS%5BTitle%5D)+AND+%22P+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">Artificial vision with wirelessly powered subretinal electronic implant alpha-IMS.</a> P R Soc B. 280, (2013).</li>
<li>Rizzo, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+retinal+prosthetic+research%3A+the+Boston+Retinal+Implant+Project%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroophthalmol%22%5BJournal%5D)">Update on retinal prosthetic research: the Boston Retinal Implant Project.</a> J Neuroophthalmol. 31, 160-168 (2011).</li>
<li>Ayton, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-in-Human+Trial+of+a+Novel+Suprachoroidal+Retinal+Prosthesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">First-in-Human Trial of a Novel Suprachoroidal Retinal Prosthesis.</a> PLoS ONE. 9, e115239(2014).</li>
<li>Chuang, A. T., Margo, C. E., Greenberg, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+implants%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retinal implants: a systematic review.</a> Br J Ophthalmol. 98, 852-856 (2014).</li>
<li>Cai, C., Twyford, P., Fried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+retinal+neurons+to+high-frequency+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">The response of retinal neurons to high-frequency stimulation.</a> J Neural Eng. 10, 036009(2013).</li>
<li>Eiber, C. D., Lovell, N. H., Suaning, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attaining+higher+resolution+visual+prosthetics%3A+a+review+of+the+factors+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Attaining higher resolution visual prosthetics: a review of the factors and limitations.</a> J Neural Eng. 10, 011002(2013).</li>
<li>Humayun, M., Propst, R., de Juan, E., McCormick, K., Hickingbotham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bipolar+surface+electrical+stimulation+of+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Bipolar surface electrical stimulation of the vertebrate retina.</a> Arch Ophthalmol. 112, 110-116 (1994).</li>
<li>Zrenner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+subretinal+microphotodiodes+successfully+replace+degenerated+photoreceptors%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Can subretinal microphotodiodes successfully replace degenerated photoreceptors?</a> Vision Res. 39, 2555-2567 (1999).</li>
<li>Majji, A. B., Humayun, M. S., Weiland, J. D., Suzuki, S., D'Anna, S. A., de Juan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Histological+and+Electrophysiological+Results+of+an+Inactive+Epiretinal+Electrode+Array+Implantation+in+Dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-Term Histological and Electrophysiological Results of an Inactive Epiretinal Electrode Array Implantation in Dogs.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).</li>
<li>Peterman, M. C., Noolandi, J., Blumenkranz, M. S., Fishman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+chemical+release+from+an+artificial+synapse+chip%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Localized chemical release from an artificial synapse chip.</a> PNAS. 101, 9951-9954 (2004).</li>
<li>Finlayson, P. G., Iezzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+stimulation+of+retinal+ganglion+cells+in+normal+and+s334ter-4+rat+retinas%3A+a+candidate+for+a+neurotransmitter-based+retinal+prosthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Glutamate stimulation of retinal ganglion cells in normal and s334ter-4 rat retinas: a candidate for a neurotransmitter-based retinal prosthesis.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 3619-3628 (2010).</li>
<li>Inayat, S., Rountree, C. M., Troy, J. B., Saggere, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+stimulation+of+rat+retinal+neurons%3A+feasibility+of+an+epiretinal+neurotransmitter-based+prosthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Chemical stimulation of rat retinal neurons: feasibility of an epiretinal neurotransmitter-based prosthesis.</a> J Neural Eng. 12, 016010(2015).</li>
<li>Rountree, C. M., Inayat, S., Troy, J. B., Saggere, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+stimulation+of+the+retina+with+subretinally+injected+exogenous+neurotransmitter%3A+A+biomimetic+alternative+to+electrical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Differential stimulation of the retina with subretinally injected exogenous neurotransmitter: A biomimetic alternative to electrical stimulation.</a> Sci Rep. 6, 38505(2016).</li>
<li>Ray, A., Sun, G. J., Chan, L., Grzywacz, N. M., Weiland, J., Lee, E. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+alterations+in+retinal+neurons+in+the+S334ter-line3+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Morphological alterations in retinal neurons in the S334ter-line3 transgenic rat.</a> Cell Tissue Res. 339, 481-491 (2010).</li>
<li>Martinez-Navarrete, G., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Fernandez-Sanchez, L., Pinilla, I., Cuenca, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+in+two+lines+of+transgenic+S334ter+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration in two lines of transgenic S334ter rats.</a> Exp Eye Res. 92, 227-237 (2011).</li>
<li>Sigma Aldrich. Sigma Aldrich Ames Medium Product Information Sheet. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/a1420pis.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/a1420pis.pdf</a> (2017).</li>
<li>Reinhard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step-By-Step+instructions+for+retina+recordings+with+perforated+multi+electrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Step-By-Step instructions for retina recordings with perforated multi electrode arrays.</a> PLoS ONE. 9, e106148(2014).</li>
<li>Izumi, Y., Kirby, C. O., Benz, A. M., Olney, J. W., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cell+swelling%2C+glutamate+uptake%2C+and+excitotoxic+neurodegeneration+in+the+isolated+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Müller cell swelling, glutamate uptake, and excitotoxic neurodegeneration in the isolated rat retina.</a> Glia. 25, 379-389 (1999).</li>
<li>Tunnicliff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake+by+chick+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake by chick retina.</a> Biochem J. 150, 297-299 (1975).</li>
<li>Schwartz, E. A., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+of+glutamate+and+sodium+co-transport+in+a+glial+cell+of+the+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology of glutamate and sodium co-transport in a glial cell of the salamander retina.</a> J Physiol (Lond). 426, 43-80 (1990).</li>
<li>Muller, A., Maurin, L., Bonne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+glutamate+uptake+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Pharmacol-+Vasc+S%22%5BJournal%5D)">Free radicals and glutamate uptake in the retina.</a> Gen Pharmacol- Vasc S. 30, 315-318 (1998).</li>
<li>Dhingra, N. K., Kao, Y. -H., Sterling, P., Smith, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast+threshold+of+a+brisk-transient+ganglion+cell+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Contrast threshold of a brisk-transient ganglion cell in vitro.</a> J of Neurophysiol. 89, 2360-2369 (2003).</li>
<li>Ahlers, M. T., Ammermüller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+precise+temperature+control+of+isolated+nervous+tissue+under+optical+access%3A+Application+to+multi-electrode+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A system for precise temperature control of isolated nervous tissue under optical access: Application to multi-electrode recordings.</a> J of Neurosci Methods. 219, 83-91 (2013).</li>
<li>Feke, G. T., Tagawa, H., Deupree, D. M., Goger, D. G., Sebag, J., Weiter, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+in+the+normal+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Blood flow in the normal human retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 30, 58-65 (1989).</li>
<li>The Retina. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Neuroscience%22">Neuroscience</a>. Purves, D., et al. , 2nd edition, Sinauer Associates. (2001).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método presentado aquí muestra un paradigma único de estimulación neural, en donde las neuronas retinianas son estimuladas químicamente inyectando productos químicos neurotransmisor natural en la superficie de la retina in vitro. Esta técnica de estimulación química ofrece varias ventajas sobre la técnica de estimulación eléctrica convencional, incluyendo la selectividad y especificidad focal de neuronas de destino. El Protocolo sobre detalles como pequeñas inyecciones neumática volumen de neurotransmisor glu...

Fotorreceptor enfermedades degenerativas, tales como retinitis pigmentosa y degeneración macular relacionada con la edad, son principales a causas hereditarias de pérdida de la visión y son actualmente incurables1,2. Aunque estas enfermedades surgen de una variedad de mutaciones genéticas específicas, enfermedades degenerativas del fotorreceptor se caracterizan como un grupo por la pérdida progresiva de las células fotorreceptoras en la retina, que finalmente causa la ceguera. La pérdida de disparadores de fotorreceptores extensa remodelación a lo largo de la retina, pero sobrevivir a las neuronas retinianas, incluyendo las células bipolares y RGCs, permanece intacto y relativamente funcional incluso en etapas avanzadas de la degeneración de fotorreceptores3 ,4,5,6,7.
Los mecanismos y patologías de estas enfermedades han sido bien caracterizado3,4,5,6,7 pero un tratamiento eficaz sigue siendo elusivo. En las últimas tres décadas, los investigadores en todo el mundo han estudiado una variedad de tratamientos terapéuticos para restaurar la visión a las personas afectadas con enfermedades degenerativas del fotorreceptor incluyendo gene terapia8, células madre tratamiento9, trasplante de retina10y estimulación artificial11,12 de las neuronas retinianas sobrevivientes. De éstos, el más clínicamente disponible es prótesis retinianas, que son dispositivos de neuroestimulación artificiales que tradicionalmente han utilizado una gran variedad de electrodos para estimular eléctricamente las células bipolares o RGCs en patrones específicos con el objetivo de la creación de percepciones visuales artificiales en pacientes11. Prótesis eléctrica de generación actual, como el Argus II13 y alfa-IMS14 dispositivos, han logrado la aprobación clínica y estudios preliminares han indicado que puede mejorar la calidad de vida para los pacientes mediante la restauración de un medida de la visión usando epiretinal (frente de la retina) y subretinal (parte posterior de la retina) implantados dispositivos15,16. Grupos de investigación alrededor del mundo están trabajando en el avance de las prótesis retinianas más allá de los éxitos de estos dispositivos de primera generación17,18,19,20 pero se han enfrentado a dificultades de diseñar una prótesis eléctrica capaz de restaurar la visión de alta acuidad por debajo del nivel de ceguera legal a los pacientes. Estudios recientes han demostrado que lograr mayor resolución espacial que el permitido por la actual generación eléctrica basado en prótesis es difícil debido al límite de inyección de carga, que hace necesario el uso de grandes electrodos para estimular de forma segura neuronas retinianas a costa de resolución espacial, es decir, la agudeza visual de11,21. Por otra parte, la estimulación eléctrica es más limitado ya que normalmente estimula todas las células cercanas y por lo tanto provoca percepciones confusas y antinaturales en pacientes, en gran parte debido a que es un paradigma de estimulación intrínsecamente antinatural21. Sin embargo, los primeros éxitos de la estimulación eléctrica han demostrado que eso neuroestimulación artificial puede ser un tratamiento eficaz para enfermedades degenerativas fotorreceptor. Esto nos lleva a la hipótesis de que un tratamiento aún más eficaz podría ser realizable mediante la estimulación de la retina con los químicos neurotransmisores, los agentes naturales de la comunicación en las sinapsis químicas. El propósito del método presentado en este trabajo es explorar la viabilidad terapéutica de la estimulación química, que trata de imitar el sistema natural de la comunicación sináptica entre neuronas retinianas, como un estímulo alternativo a eléctrica biomiméticos para una prótesis de retina.
Traducción del concepto de estimulación química terapéutica a una prótesis de retina química se basa en activar químicamente las neuronas retinianas blanco con pequeñas cantidades de neurotransmisores nativas, como el glutamato, a través de un microfluídicos dispositivo que comprende una gran variedad de funciones en respuesta a la estimulación visual. De esta manera, una prótesis de retina química sería esencialmente una capa de fotorreceptores artificiales biomiméticos que traduce fotones llegar naturalmente a la retina a señales químicas. Ya que estas señales químicas utilizan los mismos neurotransmisores utilizados en la señalización normal de la retina y estimulan las neuronas retinianas sobrevivientes de una retina degenerado a través de las vías sinápticas mismo utilizado por vías de la visión normal, el resultado visual percepción mediante una prótesis retiniana química podría ser más natural y comprensible en comparación con uno evocado a través de una prótesis eléctrica. Por otra parte, puesto que las funciones a través del cual se liberan neurotransmisores pueden hacerse extremadamente pequeño y vestida en alta densidad, a diferencia de los electrodos un potencial químico prótesis podría ser capaz de lograr más estímulo focal y mayor espacial resolución que una prótesis eléctrica. Así, partiendo de estas ventajas potenciales, una prótesis de retina química ofrece una alternativa altamente prometedora para prótesis eléctricas.
Estimulación química de la retina, sin embargo, ha sido relativamente poco explorada hasta hace poco. Mientras que la estimulación eléctrica de la retina ha sido bien caracterizada en décadas de trabajo a través de vitro en22,23, en vivo23,24estudios clínicos13 ,14, estudios sobre estimulación química se han limitado exclusivamente a unos pocos en vitro obras25,26,27,28. Iezzi y Finlayson26 y Inayat et al. 27 demostró epiretinal estimulación química de la retina en vitro usando un solo electrodo y una matriz micropozo-microcanal (MEA), respectivamente, para registrar las respuestas de glutamato evocado de las neuronas retinianas. Más recientemente, Rountree et al. 28 demostró la estimulación diferencial de los caminos y retinales usando glutamato desde el lado del subretinal y un MEA para registrar las respuestas neuronales desde múltiples sitios en la retina.Aunque estos trabajos han establecido preliminarmente la viabilidad de la estimulación química, más estudios son esenciales para investigar muchos aspectos de este enfoque más allá de las dirigidas hasta ahora25,26,27 , 28y ajustar los parámetros de estimulación terapéutica en modelos animales tanto in vitro e in vivo antes de traducir este concepto a una prótesis de retina química según lo discutido arriba. Sin embargo, actualmente no hay ninguna metodología establecida para lograr la estimulación química de la retina en la literatura y los métodos utilizados en los trabajos anteriores no se han descrito tan detalladamente como sería esencial para estudios replicativos. Por lo tanto, la justificación de este trabajo de métodos es proporcionar un marco bien definido para llevar a cabo en vitro la estimulación química de la retina para aquellos investigadores interesados en la replicación de los estudios anteriores27, 28 o avanzar aún más este concepto naciente de neuroestimulación química.
Aquí se demuestra un método para llevar a cabo en vitro la estimulación química de neuronas retinianas en wholemount retinas de ratas de tipo salvaje y un modelo de ratas degeneradas de fotorreceptor que imita muy de cerca la progresión del fotorreceptor degenerativa enfermedades en los seres humanos. Es el fundamento de desarrollo de este método de estimulación en vitro modelos para evaluar los rangos terapéuticos de varios parámetros de estimulación y estudiar las características de la respuesta neural que serían imposibles o difíciles de observar en en vivo modelos, especialmente durante los estudios iniciales se centraron en evaluar la factibilidad de este enfoque. En este procedimiento, se muestran solo sitio y simultáneamente múltiples sitios estímulos químicos de retinas entregando cantidades pequeñas de 1 mM de glutamato cerca neuronas retinianas blanco mediante Micropipetas de vidrio un puerto disponible en el mercado y una costumbre dispositivo de microfluidos puertos múltiples micro, respectivamente. Mientras solo sitio y de sitios múltiples estímulos logran el objetivo fundamental de investigar la viabilidad terapéutica de la neuromodulación química, cada una sirve a un propósito distinto con una ventaja única. La estimulación del solo sitio, que puede ser lograda con Micropipetas de vidrio tirado previamente disponibles en el mercado, se puede utilizar para inyectar productos químicos directamente en la superficie de la retina en un solo lugar y sirve para investigar si grave observable spike tasa respuestas que son similares a las respuestas ligeras visualmente evocadas pueden sacadas focal en el sitio de inyección. Por otro lado, estimulación multisitio, que requiere un dispositivo de microfluidos multipuerto fabricado especialmente, puede ser utilizada para inyectar productos químicos espacial en varios sitios sobre la superficie de la retina y sirve para investigar cómo bien evocados por el glutamato RCG patrones de respuesta corresponden a los patrones de inyección de glutamato en los estudios de estimulación de patrón.

<table><tbody><tr><td>Matricial de microelectrodos, disposición perforada</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>60pMEA200/30iR-Ti-pr</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti</td></tr><tr><td>Amplificador MEA</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MEA1060-Inv</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv</td></tr><tr><td>Placa de tierra de perfusión inferior para pMEA</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MEA1060-Inv-(BC)-PGP</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp</td></tr><tr><td>Micromanipulador Motorizado de 3</td><td>Ejes Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MP-285 Sistema de control de</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulador</td> https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html <td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MPC-200</td><td>https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html</td></tr><tr><td>Estilo pórtico soporte para micromanipulador con corredera lineal</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MT-75/LS</td><td>https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html</td></tr><tr><td>Inyector de presión multicanal programable de 8 canales</td><td>OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Proveedor: Harvard Apparatus UK</td><td>PM-8000 o PM-8</td><td>OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Proveedor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail</td></tr><tr><td>Axopatch 200A Integrador de abrazadera de parche Molecular</td><td>Devices, Sunnyvale, CA</td><td>Axopatch 200A</td><td>Axopatch 200A ha sido reemplazado por un modelo más nuevo Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier</td></tr><tr><td>Abrazadera de parche headstage</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>CV 201A</td><td>http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage</td></tr><tr><td>Kit de residuos de vacío</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>VMK</td><td>http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/</td></tr> <tr><td>Soporte para pipetas</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>QSW-A10P</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915</td></tr><tr><td>Pre-tirado 10 &mu; Micropipetas de vidrio con diámetro de punta m</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>TIP10TW1</td><td></td></tr> <tr><td>microscopio estereoscópico https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ Zoom</td><td>Nikon, Tokio, Japón</td><td>SMZ-745T</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745</td></tr><tr><td>Soporte de brazo de microscopio con bola lineal doble brazo de rodamiento</td><td>Old School Industries, Inc., Dacono, CO</td><td>OS1010H-16BB</td><td>http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico con zoom C-LEDS Soporte LED híbrido</td><td>Nikon, Tokio, Japón</td><td>SMZ-445</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445</td></tr><tr><td>Sistema de microscopio invertido</td><td>Nikon, Tokio, Japón</td><td>Eclipse Medio Ti-E</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E</td></tr><tr><td>Ames</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1420</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420</td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico (glutamato)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G5667</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S8761</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761</td></tr><tr><td>placa de Petri de 60 mm (10 mm de altura)</td><td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>FB0875713A</td><td>placa de Petri transparente de 60 mm; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a</td></tr><tr><td>Jewelers #5 Instrumentos de precisión mundiales de fórceps</td><td>, Sarasota, FL</td><td>555227F</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/</td></tr> <tr><td>Bisturí estándar Blad #24</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>500247</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/</td></tr> <tr><td>Mango de bisturí #4</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>500237</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/</td></tr> <tr><td>Vannas Tubingen Tijeras de disección</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>503378</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/</td></tr> <tr><td>Kit de malla de nailon</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>NYL/MESH</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173</td></tr><tr><td>Rejilla de corte de arpa</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>HSG-5AD</td><td>http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/</td></tr> <tr><td>Ag/AgCl pellet de electrodo de referencia</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>P1060 http://www.multichannelsystems.com/products/p1060</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusión por gravedad controlado con válvula de 4 canales</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>VC3-4xG</td><td>http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/</td></tr> <tr><td>Cámara microscópica Zyla 5.5 sCMOS</td><td>Andor Technology, Belfast, Reino Unido</td><td>Zyla 5.5 sCMOS</td><td>http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos</td></tr><tr><td>Alambre de plata (50 &mu; m de diámetro)</td><td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>AA44461G5</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5</td></tr><tr><td>Tubo de microperforación Tygon (1,6 mm de diámetro)</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>EW-06419-01</td><td>https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901</td></tr><tr><td>Portaherramientas basculante con cánula</td> <td>de aceroALA Instrumentos Científicos, Farmingdale, NY</td><td>TILTPORT</td><td>Se utilizaron uno de cada uno de estos para la máxima perfusión y succión; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/</td></tr> <tr><td>Roscolux #26 Hoja de filtro rojo claro</td><td>Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT</td><td>R2611</td><td>Fabricante: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Proveedor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html</td></tr><tr><td>Smith & Wesson Galaxy Linterna Roja</td><td>Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA</td><td>4588</td><td>Fabricante: https://www.smith-wesson.com/ Proveedor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588</td></tr><tr><td>MC_Rack Software</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MC_Rack</td><td>http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack</td></tr><tr><td>Labview Software</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>LabVIEW</td><td>http://www.ni.com/labview/</td></tr> <tr><td>NIS-Elements: Software de investigación básica</td><td>Nikon, Tokio, Japón</td><td>NIS-Elements BR</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research</td></tr></tbody></table>

metodología para la neuromodulación química biomimetic de retinas de ratas con el neurotransmisor glutamato in vitro

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Enfermedades degenerativas fotorreceptor causan ceguera irreparable por la pérdida progresiva de células fotorreceptoras en la retina. Prótesis retinianas son un tratamiento emergente para enfermedades degenerativas fotorreceptor que buscan restaurar la visión estimulando artificialmente las neuronas retinianas sobrevivientes con la esperanza de suscitar comprensible percepción visual en los pacientes. Prótesis retinianas actuales han demostrado éxito en la restauración de la visión limitada a los pacientes mediante una matriz de electrodos para estimular la retina eléctricamente pero enfrentan importantes barreras físicas en la restauración de alta agudeza, visión natural a los pacientes. Neuroestimulación química utilizando neurotransmisores nativos es una estimulación alternativa eléctrica biomiméticos y podría eludir las limitaciones fundamentales asociadas con prótesis retinianas mediante neuroestimulación eléctrica. Específicamente, neuroestimulación química tiene el potencial para restaurar la visión más natural con agudezas visuales comparables o mejores a los pacientes mediante la inyección de cantidades muy pequeñas de los neurotransmisores, los mismos agentes naturales de comunicación utilizado por la retina sinapsis química, en una resolución mucho más fina que prótesis eléctricas actuales. Sin embargo, como un paradigma de estimulación relativamente inexplorada, hay ningún protocolo establecido para lograr la estimulación química de la retina en vitro. El propósito de este trabajo es proporcionar un marco detallado para lograr estimulación química de la retina para investigadores que deseen estudiar el potencial de la neuromodulación química de la retina o similar los tejidos neuronales in vitro. En este trabajo, describimos el montaje experimental y metodología para la obtención de ganglionares de la retina células (RGC) spike respuestas similares a visual luz respuestas de tipo salvaje y degenerado fotorreceptor wholemount retinas de rata mediante la inyección controlada volúmenes de el neurotransmisor glutamato en el espacio subretinal utilizando Micropipetas de vidrio y un dispositivo de microfluidos multipuerto personalizado. Esta metodología y protocolo son lo bastante generales como para ser adaptado para neuromodulación mediante otros neurotransmisores o incluso otros tejidos neuronales.

Este protocolo se puede utilizar para estimular químicamente la retina normal, tipo salvaje así como fotorreceptor degenerado retinas, a pesar de la importante remodelación celular causada por la pérdida de los fotorreceptores. Antes de comenzar los experimentos con cualquiera de los dos fotorreceptores degenerados o retinas de tipo salvaje, la necesidad de equipos (figura 1 y figura 2) de grabación y estimulación para ser prepar...

Este protocolo describe un método novedoso para la investigación de una forma de neuroestimulación química de wholemount rat retinas en vitro con el neurotransmisor glutamato. Química neuroestimulación es una alternativa prometedora a la neuroestimulación eléctrica convencional de retinales neuronas para tratar ceguera irreversible causada por enfermedades degenerativas fotorreceptor.

Metodología para la neuromodulación química Biomimetic de Retinas de ratas con el neurotransmisor glutamato In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

El objetivo general de esta metodología es permitir una nueva neuromodulación química de las neuronas de la retina utilizando neurotransmisores, que podría reemplazar la funcionalidad de las células de la retina defectuosas en pacientes con ceguera neurodegenerativa para restaurar la visión. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la visión artificial. Por ejemplo, ¿se puede usar el glutamato, un neurotransmisor primario de la retina, para estimular terapéuticamente una retina degenerada por fotorreceptores?La principal ventaja de nuestra técnica es que es biomimética, estimulando la retina de esta manera ofrece el potencial de una mayor agudeza visual y una visión más naturalista de lo que es posible con la estimulación eléctrica. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la ceguera, debida a enfermedades degenerativas de fotorreceptores, ya que la intervención terapéutica temprana de una retina degenerada podría restaurar la sensibilidad al glutamato en las neuronas de la retina. Para comenzar este procedimiento, coloque ambos ojos enucleados en una placa de Petri de 60 milímetros de diámetro con una solución fresca oxigenada de Ames'medium.Con un microscopio estereoscópico de disección, haga una pequeña incisión en la cara de la córnea con un bisturí o unas tijeras afiladas. A continuación, haz un corte desde esta pequeña incisión hasta el borde de la córnea. Y extiéndalo en una sección circunferencial alrededor de todo el borde de la córnea.A continuación, retira la córnea desprendida junto con el cristalino, los humores acuosos translúcidos y vítreos. Mientras sostiene suavemente la copa del ojo con un par de pinzas, haga con cuidado dos pequeñas incisiones en los lados opuestos de la copa del ojo. A continuación, utilice dos pares de pinzas para separar suavemente la copa del ojo en cada una de las incisiones.Y separar la retina de la esclerótica. Levante lentamente toda la retina de la esclerótica y la copa del ojo y corte el nervio óptico si aún está unido. Después de eso, haz cortes longitudinales en la retina para obtener medias o cuartos de sección.Y luego extienda suavemente una sección de la retina sobre una malla de nailon con las células ganglionares en dirección opuesta a la malla. Coloque la malla y la retina en una guía de electrodos múltiples perforada con las células ganglionares en contacto con una superficie de PMEA. Y luego coloque un peso encima de la malla para mantener la retina en su lugar.En este procedimiento, bajo una iluminación roja tenue, coloque PMEA en el amplificador MEA y cierre los pestillos del amplificador. Coloque la salida de perfusión superior dentro de la cámara PMEA y abra la válvula de perfusión superior para lograr una tasa de perfusión de aproximadamente tres mililitros por minuto. A continuación, coloque la entrada de succión superior en el nivel de ocho perfusiones deseado.Asegúrese de que esté funcionando. Luego, abra el software de adquisición de datos y haga clic en el botón de reproducción para comenzar a recibir datos. Asegúrese de que todos los canales PMEA estén libres de ruido y registren señales neuronales.De lo contrario, vuelva a colocar el PMEA dentro del amplificador para obtener un mejor contacto entre los pines del amplificador y los contactos PMEA. Luego, asegúrese de que la línea de perfusión inferior esté libre de burbujas de aire. Abra la válvula de perfusión inferior para asegurarse de que la retina reciba oxígeno y nutrientes.Posteriormente, encienda la cámara de alta velocidad conectada al microscopio óptico invertido y abra el software de imágenes. Una vez que se confirme que la perfusión inferior está fluyendo, aumente lentamente la succión inferior girando manualmente la perilla de presión de vacío en el kit de desechos de vacío mientras observa la retina a través del microscopio invertido. Una vez que se observa que una fuerza de succión actúa sobre la retina, deje de aumentar la succión.Después de asegurarse de que la retina se ha mantenido en su lugar mediante la succión inferior, quite el peso de la retina con pinzas y retire suavemente la malla de nailon despegando una esquina con cuidado de la retina. Mantenga la perfusión en funcionamiento durante aproximadamente 30 minutos para permitir que la retina se estabilice después del trauma quirúrgico. En este paso, inserte con cuidado una micropipeta de 10 micrómetros de diámetro preextraída en un soporte de pipeta estándar que contenga un electrodo de alambre de cloruro de plata-plata de 50 micrómetros de diámetro.Si utiliza un dispositivo microfluídico multipuerto, inserte la varilla de acero inoxidable conectada al dispositivo en un soporte de pipeta estándar sin un electrodo de alambre. Si utiliza una micropipeta de vidrio, conecte el soporte de pipeta con una etapa de cabeza de abrazadera de parche y conecte la conexión inferior del puerto de presión del soporte de pipeta al canal uno del sistema de inyección de presión. O, si utiliza el dispositivo multipuerto, conecte las conexiones luer del puerto de presión de cada uno de los ocho puertos de inyección, con los canales del uno al ocho del sistema de inyección de presión.A continuación, encienda manualmente el sistema de inyección de presión y encienda el canal uno. Asegúrese de que el sistema esté ventilado a la atmósfera y ajuste la presión de inyección a 0.1 libras por pulgada cuadrada. Luego, encienda el micromanipulador y galícelo presionando el botón de calibración en el controlador del manipulador.Coloque el micromanipulador de modo que la punta de la micropipeta quede aproximadamente 30 milímetros por encima del amplificador MEA. Luego, llene una pequeña placa de Petri con solución de glutamato y colóquela debajo del micromanipulador. Baje la punta de la micropipeta en la solución y llene la micropipeta de vidrio o el tubo del dispositivo multipuerto con aproximadamente 20 milímetros de solución.A continuación, levante la punta de la micropipeta, o el dispositivo, para sacarlo de la solución. Retire la placa de Petri y coloque el micromanipulador sobre la cámara PMEA. Con un microscopio estereoscópico montado en un soporte de brazo, alinee la punta de la micropipeta, o las esquinas del dispositivo, con una marca de referencia grabada en el anillo de la cámara de PMEA.A continuación, almacene las posiciones del manipulador en la superficie de control utilizando los botones de referencia de almacenamiento A y referencia de almacenamiento B para mapear el sistema de coordenadas del manipulador de los electrodos PMEA. A continuación, utilice el software de control del manipulador. Seleccione un electrodo PMEA objetivo con una actividad espontánea robusta y haga clic en el botón Mover al canal para alinear la micropipeta de vidrio con el electrodo objetivo.Si utiliza el dispositivo multipuerto, alinee los micropuertos del dispositivo con los electrodos PMEA objetivo con actividad espontánea robusta utilizando el mismo proceso. Si la medición de impedancia está disponible, encienda el amplificador de abrazadera de parche e inicie el software de visualización de impedancia haciendo clic en el botón de inicio para visualizar la impedancia del electrodo de cloruro de plata-plata dentro del soporte de pipeta. Mientras observa las señales de impedancia en tiempo real, baje lentamente la micropipeta, o dispositivo, hasta que entre en contacto con la superficie de la retina como lo indica un aumento rápido en la señal de impedancia.Para la estimulación subsuperficial, baje la pipeta 40 micrómetros más para las retinas S334 tera tres, o 70 micrómetros para las retinas de tipo salvaje. Realice algunas inyecciones de corta duración utilizando el sistema de inyección a presión. Para determinar si las células cercanas a la punta de la micropipeta, o los micropuertos del dispositivo, son receptivas a la estimulación con glutamato mediante la observación de las neuroseñales.Ahora, oriente el LED verde hacia la superficie superior de la retina. Comience a grabar utilizando el software de adquisición de datos escribiendo el nombre del archivo y haciendo clic en el botón de grabación. Una vez iniciada la grabación, abra el programa de control de estímulos y cargue el archivo de estímulo predeterminado haciendo clic en el botón leer archivo de estímulo.A continuación, haga clic en el botón ejecutar archivo de estímulo para iniciar el archivo de estímulo predeterminado. Una vez que se haya completado el archivo de estímulo, detenga la grabación para guardar el archivo para futuras clasificaciones de picos y análisis de datos. Aquí están las grabaciones representativas de nueve electrodos PMEA, que muestran los datos del electrodo filtrado de paso alto durante la estimulación visual con luz con un LED verde, donde cada rectángulo muestra los datos neuronales de un electrodo único.Cada registro de electrodo ilustra los datos recopilados en el primer segundo después de encender el LED verde. Los picos se identificaron utilizando un voltaje umbral de menos 18 microvoltios. La estimulación visual provocó una explosión de picos en todos los electrodos, excepto en el superior central, que poseía una respuesta inhibitoria a la luz.Un gráfico similar para los mismos electrodos, que muestra actividad neuronal espontánea sin estimulación visual o por inyección. Aunque hubo ráfagas más pequeñas, los patrones de picos fueron muy diferentes de los registrados en respuesta a la estimulación visual. Aquí están las grabaciones representativas del mismo subconjunto de electrodos registrados inmediatamente después de una inyección de glutamato en el electrodo central.El glutamato inyectado provocó una ráfaga de picos en el electrodo central que era muy similar a los estallidos de picos evocados visualmente. Todos los demás electrodos no se vieron afectados por la inyección de glutamato, lo que demuestra la fina resolución espacial de la técnica de estimulación química. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro a seis horas si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar controlar la perfusión para asegurarse de que la retina reciba oxígeno y nutrientes de forma continua durante todo el experimento. Esta técnica podría allanar el camino para que los investigadores en el campo de la visión artificial y el desarrollo de prótesis visuales exploren la neuromodulación basada en químicos para el tratamiento de la ceguera por enfermedades degenerativas de los fotorreceptores. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo lograr la neuromodulación de las neuronas de la retina usando neurotransmisores.

methodology-for-biomimetic-chemical-neuromodulation-rat-retinas-with

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Protocolos de inmunohistoquímica se utilizan para estudiar la localización de una proteína específica en la retina. Se emplean técnicas de imagen de calcio para estudiar la dinámica del calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones.

Inmunohistoquímicos y métodos de imagen de calcio en Wholemount Rata Retina

Con este estudio, presentamos un modelo de estrés estandarizado para la retina bovina superfundido aislada para futuras pruebas terapéutica preclínica. Se evaluó el efecto de cualquiera de hipoxia (N 2 puro) o estrés glutamato (250 glutamato mM) sobre la función retiniana representado por a- y amplitudes de la onda b.

El glutamato y la hipoxia como un Modelo de estrés para el perfundido aislado Vertebrados Retina

El método de inmunogold postincrustado es una de las formas más efectivas de proporcionar análisis de alta resolución de la localización subcelular de moléculas específicas. En este trabajo describimos un protocolo para analizar cuantitativamente los receptores de glutamato en las sinapsis de la cinta retiniana.

Resolución de alta Análisis Cuantitativo Inmunoelectrónica de Receptores de Membrana en la retina cinta sinapsis

Este artículo ilustra cómo se puede cuantificar la expresión de receptores de neurotransmisores y analizar el patrón en sinapsis con elementos pre y postsinápticos identificados utilizando una combinación de transducción viral de herramientas optogenéticas y la técnica de inmunomarcaje de réplica de congelación-fractura.

Combinados Optogenética y congelación-fractura Réplica Immunolabeling para Analizar Arreglo-entrada específica de glutamato receptores en el ratón amígdala

A continuación, describimos la configuración, software de navegación, y el análisis de datos de un método espacial y temporalmente precisa de medir tónico y cambios extracelulares de glutamato fásicas in vivo usando matrices de microelectrodos ligados a enzimas (MEA).

El uso de biosensores basados ​​en enzimas para medir tónica y fásica glutamato en modelos de ratones con Alzheimer

Aquí presentamos un protocolo para medir los flujos in vitro ca2+ en las neuronas de cerebro medio y sus efectos aguas abajo en la caspasa-3 utilizando cultivos primarios de cerebro medio ratón. Este modelo se puede emplear para estudiar los cambios fisiopatológicos relacionados con la actividad anormal de Ca2+ en las neuronas de cerebro medio, y para detectar nuevas terapias en busca de propiedades anti-apoptóticas.

Cuantificación de los flujos espontáneos de Ca2+ y sus efectos aguas abajo en las neuronas primarias de cerebro medio de ratón

Presentamos un modelo in vitro para evaluar la capacidad neurorregenerativa olfativa ensheathing glia (OEG), después de una lesión neuronal. Se basa en un cocultivo de neuronas ganglionas de retina adultas axotomizadas (RGN) en monocapas OEG y posterior estudio de regeneración axonal, mediante el análisis de marcadores axoales y somatodendriáticos RGN.

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

La imagen in vivo es una herramienta poderosa para el estudio de la biología en la salud y la enfermedad. Este protocolo describe imágenes transpupilares de la retina del ratón con un microscopio estándar de dos fotones. También demuestra diferentes métodos de imagen in vivo para etiquetar fluorescentemente múltiples cohortes celulares de la retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

La modificación de la matriz de electrodos múltiples existente o del equipo de abrazadera de parche hace que el electrorretinograma ex vivo sea más accesible. Los métodos mejorados para registrar y mantener las respuestas de luz ex vivo facilitan el estudio de la función de los fotorreceptores y las células bipolares ON en la retina sana, modelos animales de enfermedades oculares y retinas de donantes humanos.

Optimización de la configuración y las condiciones del electrorretinograma ex vivo para estudiar la función de la retina en ojos pequeños y grandes

El protocolo demuestra que mediante la realización de microtrasplante de membranas sinápticas en ovocitos de Xenopus laevis , es posible registrar respuestas consistentes y confiables de α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico y los receptores de ácido γ-aminobutírico.

Microtrasplante de membranas sinápticas para reactivar los receptores sinápticos humanos para estudios funcionales

Las prótesis de retina tienen la capacidad de generar percepciones visuales. Para avanzar en el desarrollo de nuevas prótesis, se necesitan métodos ex vivo para probar los dispositivos antes de su implantación. Este artículo proporciona un protocolo completo para estudiar la actividad del calcio en la capa de células ganglionares de la retina cuando se somete a estimulación eléctrica.

Imágenes de calcio en retinas planas estimuladas eléctricamente

Aprende la neuromodulación química biomimética de retinas de ratas usando glutamato in vitro. Este método ofrece mayor agudeza visual y visión más natural que la estimulación eléctrica para tratar ceguera neurodegenerativa.

Metodología para la neuromodulación química Biomimetic de Retinas de ratas con el neurotransmisor glutamato In Vitro

Explorar más videos