Name: Metodología para la neuromodulación química Biomimetic de Retinas de ratas con el neurotransmisor glutamato In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: Aprende la neuromodulación química biomimética de retinas de ratas usando glutamato in vitro. Este método ofrece mayor agudeza visual y visión más natural que la estimulación eléctrica para tratar ceguera neurodegenerativa.

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El trabajo presentado en el documento fue apoyado por la National Science Foundation, nuevas fronteras en la investigación y el programa de innovación (NSF-EFRI) número 0938072 de la concesión. El contenido de este documento es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la NSF. Los autores también desean agradecer al Dr. Samsoon Inayat su trabajo diseñando y probando la configuración experimental inicial para la estimulación química y Sr. Ashwin Raghunathan por su trabajo de diseño, fabricación y evaluación del dispositivo de microfluidos multipuerto utilizado en Este estudio.

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Los autores no tienen nada que revelar.

El método presentado aquí muestra un paradigma único de estimulación neural, en donde las neuronas retinianas son estimuladas químicamente inyectando productos químicos neurotransmisor natural en la superficie de la retina in vitro. Esta técnica de estimulación química ofrece varias ventajas sobre la técnica de estimulación eléctrica convencional, incluyendo la selectividad y especificidad focal de neuronas de destino. El Protocolo sobre detalles como pequeñas inyecciones neumática volumen de neurotransmisor glu...

Fotorreceptor enfermedades degenerativas, tales como retinitis pigmentosa y degeneración macular relacionada con la edad, son principales a causas hereditarias de pérdida de la visión y son actualmente incurables1,2. Aunque estas enfermedades surgen de una variedad de mutaciones genéticas específicas, enfermedades degenerativas del fotorreceptor se caracterizan como un grupo por la pérdida progresiva de las células fotorreceptoras en la retina, que finalmente causa la ceguera. La pérdida de disparadores de fotorreceptores extensa remodelación a lo largo de la retina, pero sobrevivir a las neuronas retinianas, incluyendo las células bipolares y RGCs, permanece intacto y relativamente funcional incluso en etapas avanzadas de la degeneración de fotorreceptores3 ,4,5,6,7.
Los mecanismos y patologías de estas enfermedades han sido bien caracterizado3,4,5,6,7 pero un tratamiento eficaz sigue siendo elusivo. En las últimas tres décadas, los investigadores en todo el mundo han estudiado una variedad de tratamientos terapéuticos para restaurar la visión a las personas afectadas con enfermedades degenerativas del fotorreceptor incluyendo gene terapia8, células madre tratamiento9, trasplante de retina10y estimulación artificial11,12 de las neuronas retinianas sobrevivientes. De éstos, el más clínicamente disponible es prótesis retinianas, que son dispositivos de neuroestimulación artificiales que tradicionalmente han utilizado una gran variedad de electrodos para estimular eléctricamente las células bipolares o RGCs en patrones específicos con el objetivo de la creación de percepciones visuales artificiales en pacientes11. Prótesis eléctrica de generación actual, como el Argus II13 y alfa-IMS14 dispositivos, han logrado la aprobación clínica y estudios preliminares han indicado que puede mejorar la calidad de vida para los pacientes mediante la restauración de un medida de la visión usando epiretinal (frente de la retina) y subretinal (parte posterior de la retina) implantados dispositivos15,16. Grupos de investigación alrededor del mundo están trabajando en el avance de las prótesis retinianas más allá de los éxitos de estos dispositivos de primera generación17,18,19,20 pero se han enfrentado a dificultades de diseñar una prótesis eléctrica capaz de restaurar la visión de alta acuidad por debajo del nivel de ceguera legal a los pacientes. Estudios recientes han demostrado que lograr mayor resolución espacial que el permitido por la actual generación eléctrica basado en prótesis es difícil debido al límite de inyección de carga, que hace necesario el uso de grandes electrodos para estimular de forma segura neuronas retinianas a costa de resolución espacial, es decir, la agudeza visual de11,21. Por otra parte, la estimulación eléctrica es más limitado ya que normalmente estimula todas las células cercanas y por lo tanto provoca percepciones confusas y antinaturales en pacientes, en gran parte debido a que es un paradigma de estimulación intrínsecamente antinatural21. Sin embargo, los primeros éxitos de la estimulación eléctrica han demostrado que eso neuroestimulación artificial puede ser un tratamiento eficaz para enfermedades degenerativas fotorreceptor. Esto nos lleva a la hipótesis de que un tratamiento aún más eficaz podría ser realizable mediante la estimulación de la retina con los químicos neurotransmisores, los agentes naturales de la comunicación en las sinapsis químicas. El propósito del método presentado en este trabajo es explorar la viabilidad terapéutica de la estimulación química, que trata de imitar el sistema natural de la comunicación sináptica entre neuronas retinianas, como un estímulo alternativo a eléctrica biomiméticos para una prótesis de retina.
Traducción del concepto de estimulación química terapéutica a una prótesis de retina química se basa en activar químicamente las neuronas retinianas blanco con pequeñas cantidades de neurotransmisores nativas, como el glutamato, a través de un microfluídicos dispositivo que comprende una gran variedad de funciones en respuesta a la estimulación visual. De esta manera, una prótesis de retina química sería esencialmente una capa de fotorreceptores artificiales biomiméticos que traduce fotones llegar naturalmente a la retina a señales químicas. Ya que estas señales químicas utilizan los mismos neurotransmisores utilizados en la señalización normal de la retina y estimulan las neuronas retinianas sobrevivientes de una retina degenerado a través de las vías sinápticas mismo utilizado por vías de la visión normal, el resultado visual percepción mediante una prótesis retiniana química podría ser más natural y comprensible en comparación con uno evocado a través de una prótesis eléctrica. Por otra parte, puesto que las funciones a través del cual se liberan neurotransmisores pueden hacerse extremadamente pequeño y vestida en alta densidad, a diferencia de los electrodos un potencial químico prótesis podría ser capaz de lograr más estímulo focal y mayor espacial resolución que una prótesis eléctrica. Así, partiendo de estas ventajas potenciales, una prótesis de retina química ofrece una alternativa altamente prometedora para prótesis eléctricas.
Estimulación química de la retina, sin embargo, ha sido relativamente poco explorada hasta hace poco. Mientras que la estimulación eléctrica de la retina ha sido bien caracterizada en décadas de trabajo a través de vitro en22,23, en vivo23,24estudios clínicos13 ,14, estudios sobre estimulación química se han limitado exclusivamente a unos pocos en vitro obras25,26,27,28. Iezzi y Finlayson26 y Inayat et al. 27 demostró epiretinal estimulación química de la retina en vitro usando un solo electrodo y una matriz micropozo-microcanal (MEA), respectivamente, para registrar las respuestas de glutamato evocado de las neuronas retinianas. Más recientemente, Rountree et al. 28 demostró la estimulación diferencial de los caminos y retinales usando glutamato desde el lado del subretinal y un MEA para registrar las respuestas neuronales desde múltiples sitios en la retina.Aunque estos trabajos han establecido preliminarmente la viabilidad de la estimulación química, más estudios son esenciales para investigar muchos aspectos de este enfoque más allá de las dirigidas hasta ahora25,26,27 , 28y ajustar los parámetros de estimulación terapéutica en modelos animales tanto in vitro e in vivo antes de traducir este concepto a una prótesis de retina química según lo discutido arriba. Sin embargo, actualmente no hay ninguna metodología establecida para lograr la estimulación química de la retina en la literatura y los métodos utilizados en los trabajos anteriores no se han descrito tan detalladamente como sería esencial para estudios replicativos. Por lo tanto, la justificación de este trabajo de métodos es proporcionar un marco bien definido para llevar a cabo en vitro la estimulación química de la retina para aquellos investigadores interesados en la replicación de los estudios anteriores27, 28 o avanzar aún más este concepto naciente de neuroestimulación química.
Aquí se demuestra un método para llevar a cabo en vitro la estimulación química de neuronas retinianas en wholemount retinas de ratas de tipo salvaje y un modelo de ratas degeneradas de fotorreceptor que imita muy de cerca la progresión del fotorreceptor degenerativa enfermedades en los seres humanos. Es el fundamento de desarrollo de este método de estimulación en vitro modelos para evaluar los rangos terapéuticos de varios parámetros de estimulación y estudiar las características de la respuesta neural que serían imposibles o difíciles de observar en en vivo modelos, especialmente durante los estudios iniciales se centraron en evaluar la factibilidad de este enfoque. En este procedimiento, se muestran solo sitio y simultáneamente múltiples sitios estímulos químicos de retinas entregando cantidades pequeñas de 1 mM de glutamato cerca neuronas retinianas blanco mediante Micropipetas de vidrio un puerto disponible en el mercado y una costumbre dispositivo de microfluidos puertos múltiples micro, respectivamente. Mientras solo sitio y de sitios múltiples estímulos logran el objetivo fundamental de investigar la viabilidad terapéutica de la neuromodulación química, cada una sirve a un propósito distinto con una ventaja única. La estimulación del solo sitio, que puede ser lograda con Micropipetas de vidrio tirado previamente disponibles en el mercado, se puede utilizar para inyectar productos químicos directamente en la superficie de la retina en un solo lugar y sirve para investigar si grave observable spike tasa respuestas que son similares a las respuestas ligeras visualmente evocadas pueden sacadas focal en el sitio de inyección. Por otro lado, estimulación multisitio, que requiere un dispositivo de microfluidos multipuerto fabricado especialmente, puede ser utilizada para inyectar productos químicos espacial en varios sitios sobre la superficie de la retina y sirve para investigar cómo bien evocados por el glutamato RCG patrones de respuesta corresponden a los patrones de inyección de glutamato en los estudios de estimulación de patrón.

<table><tbody><tr><td>Matricial de microelectrodos, disposición perforada</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>60pMEA200/30iR-Ti-pr</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti</td></tr><tr><td>Amplificador MEA</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MEA1060-Inv</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv</td></tr><tr><td>Placa de tierra de perfusión inferior para pMEA</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MEA1060-Inv-(BC)-PGP</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp</td></tr><tr><td>Micromanipulador Motorizado de 3</td><td>Ejes Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MP-285 Sistema de control de</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulador</td> https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html <td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MPC-200</td><td>https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html</td></tr><tr><td>Estilo pórtico soporte para micromanipulador con corredera lineal</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MT-75/LS</td><td>https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html</td></tr><tr><td>Inyector de presión multicanal programable de 8 canales</td><td>OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Proveedor: Harvard Apparatus UK</td><td>PM-8000 o PM-8</td><td>OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Proveedor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail</td></tr><tr><td>Axopatch 200A Integrador de abrazadera de parche Molecular</td><td>Devices, Sunnyvale, CA</td><td>Axopatch 200A</td><td>Axopatch 200A ha sido reemplazado por un modelo más nuevo Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier</td></tr><tr><td>Abrazadera de parche headstage</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>CV 201A</td><td>http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage</td></tr><tr><td>Kit de residuos de vacío</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>VMK</td><td>http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/</td></tr> <tr><td>Soporte para pipetas</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>QSW-A10P</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915</td></tr><tr><td>Pre-tirado 10 &mu; Micropipetas de vidrio con diámetro de punta m</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>TIP10TW1</td><td></td></tr> <tr><td>microscopio estereoscópico https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ Zoom</td><td>Nikon, Tokio, Japón</td><td>SMZ-745T</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745</td></tr><tr><td>Soporte de brazo de microscopio con bola lineal doble brazo de rodamiento</td><td>Old School Industries, Inc., Dacono, CO</td><td>OS1010H-16BB</td><td>http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico con zoom C-LEDS Soporte LED híbrido</td><td>Nikon, Tokio, Japón</td><td>SMZ-445</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445</td></tr><tr><td>Sistema de microscopio invertido</td><td>Nikon, Tokio, Japón</td><td>Eclipse Medio Ti-E</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E</td></tr><tr><td>Ames</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1420</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420</td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico (glutamato)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G5667</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S8761</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761</td></tr><tr><td>placa de Petri de 60 mm (10 mm de altura)</td><td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>FB0875713A</td><td>placa de Petri transparente de 60 mm; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a</td></tr><tr><td>Jewelers #5 Instrumentos de precisión mundiales de fórceps</td><td>, Sarasota, FL</td><td>555227F</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/</td></tr> <tr><td>Bisturí estándar Blad #24</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>500247</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/</td></tr> <tr><td>Mango de bisturí #4</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>500237</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/</td></tr> <tr><td>Vannas Tubingen Tijeras de disección</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>503378</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/</td></tr> <tr><td>Kit de malla de nailon</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>NYL/MESH</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173</td></tr><tr><td>Rejilla de corte de arpa</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>HSG-5AD</td><td>http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/</td></tr> <tr><td>Ag/AgCl pellet de electrodo de referencia</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>P1060 http://www.multichannelsystems.com/products/p1060</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusión por gravedad controlado con válvula de 4 canales</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>VC3-4xG</td><td>http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/</td></tr> <tr><td>Cámara microscópica Zyla 5.5 sCMOS</td><td>Andor Technology, Belfast, Reino Unido</td><td>Zyla 5.5 sCMOS</td><td>http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos</td></tr><tr><td>Alambre de plata (50 &mu; m de diámetro)</td><td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>AA44461G5</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5</td></tr><tr><td>Tubo de microperforación Tygon (1,6 mm de diámetro)</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>EW-06419-01</td><td>https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901</td></tr><tr><td>Portaherramientas basculante con cánula</td> <td>de aceroALA Instrumentos Científicos, Farmingdale, NY</td><td>TILTPORT</td><td>Se utilizaron uno de cada uno de estos para la máxima perfusión y succión; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/</td></tr> <tr><td>Roscolux #26 Hoja de filtro rojo claro</td><td>Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT</td><td>R2611</td><td>Fabricante: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Proveedor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html</td></tr><tr><td>Smith & Wesson Galaxy Linterna Roja</td><td>Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA</td><td>4588</td><td>Fabricante: https://www.smith-wesson.com/ Proveedor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588</td></tr><tr><td>MC_Rack Software</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MC_Rack</td><td>http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack</td></tr><tr><td>Labview Software</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>LabVIEW</td><td>http://www.ni.com/labview/</td></tr> <tr><td>NIS-Elements: Software de investigación básica</td><td>Nikon, Tokio, Japón</td><td>NIS-Elements BR</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research</td></tr></tbody></table>

metodología para la neuromodulación química biomimetic de retinas de ratas con el neurotransmisor glutamato in vitro

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Enfermedades degenerativas fotorreceptor causan ceguera irreparable por la pérdida progresiva de células fotorreceptoras en la retina. Prótesis retinianas son un tratamiento emergente para enfermedades degenerativas fotorreceptor que buscan restaurar la visión estimulando artificialmente las neuronas retinianas sobrevivientes con la esperanza de suscitar comprensible percepción visual en los pacientes. Prótesis retinianas actuales han demostrado éxito en la restauración de la visión limitada a los pacientes mediante una matriz de electrodos para estimular la retina eléctricamente pero enfrentan importantes barreras físicas en la restauración de alta agudeza, visión natural a los pacientes. Neuroestimulación química utilizando neurotransmisores nativos es una estimulación alternativa eléctrica biomiméticos y podría eludir las limitaciones fundamentales asociadas con prótesis retinianas mediante neuroestimulación eléctrica. Específicamente, neuroestimulación química tiene el potencial para restaurar la visión más natural con agudezas visuales comparables o mejores a los pacientes mediante la inyección de cantidades muy pequeñas de los neurotransmisores, los mismos agentes naturales de comunicación utilizado por la retina sinapsis química, en una resolución mucho más fina que prótesis eléctricas actuales. Sin embargo, como un paradigma de estimulación relativamente inexplorada, hay ningún protocolo establecido para lograr la estimulación química de la retina en vitro. El propósito de este trabajo es proporcionar un marco detallado para lograr estimulación química de la retina para investigadores que deseen estudiar el potencial de la neuromodulación química de la retina o similar los tejidos neuronales in vitro. En este trabajo, describimos el montaje experimental y metodología para la obtención de ganglionares de la retina células (RGC) spike respuestas similares a visual luz respuestas de tipo salvaje y degenerado fotorreceptor wholemount retinas de rata mediante la inyección controlada volúmenes de el neurotransmisor glutamato en el espacio subretinal utilizando Micropipetas de vidrio y un dispositivo de microfluidos multipuerto personalizado. Esta metodología y protocolo son lo bastante generales como para ser adaptado para neuromodulación mediante otros neurotransmisores o incluso otros tejidos neuronales.

Este protocolo se puede utilizar para estimular químicamente la retina normal, tipo salvaje así como fotorreceptor degenerado retinas, a pesar de la importante remodelación celular causada por la pérdida de los fotorreceptores. Antes de comenzar los experimentos con cualquiera de los dos fotorreceptores degenerados o retinas de tipo salvaje, la necesidad de equipos (figura 1 y figura 2) de grabación y estimulación para ser prepar...

Este protocolo describe un método novedoso para la investigación de una forma de neuroestimulación química de wholemount rat retinas en vitro con el neurotransmisor glutamato. Química neuroestimulación es una alternativa prometedora a la neuroestimulación eléctrica convencional de retinales neuronas para tratar ceguera irreversible causada por enfermedades degenerativas fotorreceptor.

Metodología para la neuromodulación química Biomimetic de Retinas de ratas con el neurotransmisor glutamato In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

El objetivo general de esta metodología es permitir una nueva neuromodulación química de las neuronas de la retina utilizando neurotransmisores, que podría reemplazar la funcionalidad de las células de la retina defectuosas en pacientes con ceguera neurodegenerativa para restaurar la visión. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la visión artificial. Por ejemplo, ¿se puede usar el glutamato, un neurotransmisor primario de la retina, para estimular terapéuticamente una retina degenerada por fotorreceptores?La principal ventaja de nuestra técnica es que es biomimética, estimulando la retina de esta manera ofrece el potencial de una mayor agudeza visual y una visión más naturalista de lo que es posible con la estimulación eléctrica. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la ceguera, debida a enfermedades degenerativas de fotorreceptores, ya que la intervención terapéutica temprana de una retina degenerada podría restaurar la sensibilidad al glutamato en las neuronas de la retina. Para comenzar este procedimiento, coloque ambos ojos enucleados en una placa de Petri de 60 milímetros de diámetro con una solución fresca oxigena

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Protocolos de inmunohistoquímica se utilizan para estudiar la localización de una proteína específica en la retina. Se emplean técnicas de imagen de calcio para estudiar la dinámica del calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones.

Inmunohistoquímicos y métodos de imagen de calcio en Wholemount Rata Retina

Con este estudio, presentamos un modelo de estrés estandarizado para la retina bovina superfundido aislada para futuras pruebas terapéutica preclínica. Se evaluó el efecto de cualquiera de hipoxia (N 2 puro) o estrés glutamato (250 glutamato mM) sobre la función retiniana representado por a- y amplitudes de la onda b.

El glutamato y la hipoxia como un Modelo de estrés para el perfundido aislado Vertebrados Retina

El método de inmunogold postincrustado es una de las formas más efectivas de proporcionar análisis de alta resolución de la localización subcelular de moléculas específicas. En este trabajo describimos un protocolo para analizar cuantitativamente los receptores de glutamato en las sinapsis de la cinta retiniana.

Resolución de alta Análisis Cuantitativo Inmunoelectrónica de Receptores de Membrana en la retina cinta sinapsis

Este artículo ilustra cómo se puede cuantificar la expresión de receptores de neurotransmisores y analizar el patrón en sinapsis con elementos pre y postsinápticos identificados utilizando una combinación de transducción viral de herramientas optogenéticas y la técnica de inmunomarcaje de réplica de congelación-fractura.

Combinados Optogenética y congelación-fractura Réplica Immunolabeling para Analizar Arreglo-entrada específica de glutamato receptores en el ratón amígdala

A continuación, describimos la configuración, software de navegación, y el análisis de datos de un método espacial y temporalmente precisa de medir tónico y cambios extracelulares de glutamato fásicas in vivo usando matrices de microelectrodos ligados a enzimas (MEA).

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Aquí presentamos un protocolo para medir los flujos in vitro ca2+ en las neuronas de cerebro medio y sus efectos aguas abajo en la caspasa-3 utilizando cultivos primarios de cerebro medio ratón. Este modelo se puede emplear para estudiar los cambios fisiopatológicos relacionados con la actividad anormal de Ca2+ en las neuronas de cerebro medio, y para detectar nuevas terapias en busca de propiedades anti-apoptóticas.

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Presentamos un modelo in vitro para evaluar la capacidad neurorregenerativa olfativa ensheathing glia (OEG), después de una lesión neuronal. Se basa en un cocultivo de neuronas ganglionas de retina adultas axotomizadas (RGN) en monocapas OEG y posterior estudio de regeneración axonal, mediante el análisis de marcadores axoales y somatodendriáticos RGN.

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La imagen in vivo es una herramienta poderosa para el estudio de la biología en la salud y la enfermedad. Este protocolo describe imágenes transpupilares de la retina del ratón con un microscopio estándar de dos fotones. También demuestra diferentes métodos de imagen in vivo para etiquetar fluorescentemente múltiples cohortes celulares de la retina.

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La modificación de la matriz de electrodos múltiples existente o del equipo de abrazadera de parche hace que el electrorretinograma ex vivo sea más accesible. Los métodos mejorados para registrar y mantener las respuestas de luz ex vivo facilitan el estudio de la función de los fotorreceptores y las células bipolares ON en la retina sana, modelos animales de enfermedades oculares y retinas de donantes humanos.

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El protocolo demuestra que mediante la realización de microtrasplante de membranas sinápticas en ovocitos de Xenopus laevis , es posible registrar respuestas consistentes y confiables de α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico y los receptores de ácido γ-aminobutírico.

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Las prótesis de retina tienen la capacidad de generar percepciones visuales. Para avanzar en el desarrollo de nuevas prótesis, se necesitan métodos ex vivo para probar los dispositivos antes de su implantación. Este artículo proporciona un protocolo completo para estudiar la actividad del calcio en la capa de células ganglionares de la retina cuando se somete a estimulación eléctrica.

Imágenes de calcio en retinas planas estimuladas eléctricamente

Aprende la neuromodulación química biomimética de retinas de ratas usando glutamato in vitro. Este método ofrece mayor agudeza visual y visión más natural que la estimulación eléctrica para tratar ceguera neurodegenerativa.

Metodología para la neuromodulación química Biomimetic de Retinas de ratas con el neurotransmisor glutamato In Vitro

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