Name: Establecer un modelo de ratón de una neuropatía de fibra pequeña pura con el Ultrapotent agonista de Receptor transitorio potencial vaniloides tipo 1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a establecer un modelo de ratón de neuropatía de fibra pequeña usando resiniferatoxina (RTX) a 50 µg/kg. Este método permite estudiar mecanismos de dolor neuropático y degeneración de fibras nerviosas intraepidérmicas en investigación biomédica.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de ciencia y tecnología (106-2320-B-037-024), Universidad médica de Kaohsiung (KMU-M106028, S105034 KMU) y objetivo para la concesión de las universidades Top (TP105PR15), Universidad médica de Kaohsiung, Taiwán.

Todos los procedimientos descritos están conforme a normas éticas para los animales de laboratorio30, y el protocolo ha sido aprobado por la Animal Comité de Kaohsiung Universidad médica, Kaohsiung, Taiwan.
1. establecimiento de la neuropatía RTX
PRECAUCIÓN: RTX es neurotóxica y peligrosos. En contacto, que actúa como un irritante a los ojos, membranas mucosas y tracto respiratorio superior. Evitar la inhalación y gafas de laboratorio y capas durante la preparación de RTX. Enjuague con abundante agua en caso de contacto con la piel o después de manipular.
<ol><li>Añadir 1 mg de RTX polvo a 200 μL de mezcla de igual volumen de Tween 80 y etanol absoluto (100 μL para cada solvente).</li>
	<li>Alícuota de la solución RTX (12 μl/frasco) y almacenar a-20 ° C, por hasta 3 meses. Esto constituye la acción RTX; desechar la solución restante de RTX en la expiración.</li>
	<li>Diluir el caldo RTX con suero fisiológico hasta un volumen final de 600 μl. La concentración final de la solución RTX debe ser 0.01%, que equivale a 1 μg RTX en solución de vehículo de 10 μl.</li>
	<li>Como animales de experimentación ratones ICR machos adultos 8 semanas de edad (35-40 g) y administrar una sola dosis de solución RTX (dosis: 200, 50 y 10 μg/kg, respectivamente) por vía intraperitoneal (i.p.) con una jeringa de microinyección para los ratones. Ratones fue anestesiado por inhalador con isoflurano de 5% para la anestesia profunda. Si los ratones mostraron acción de retiro de las extremidades durante la inyección del RTX, ratones deben tomar mayor inhalación de la anestesia. Ejemplo: Si el ratón pesa 40 g, lo que recibirá 20 μl de la solución RTX, representando a la dosis de 50 μg/kg.</li>
	<li>Dar a un grupo de ratones un volumen igual de vehículo (10% Tween 80 y 10% etanol absoluto en solución salina), como un control.</li>
	<li>Después de la inyección de RTX, devolver los ratones en una jaula de plástico en un 12 h luz/12 h oscuro ciclarán y proporcionan alimento y agua ad libitum.</li>
</ol>2. evaluación del comportamiento neuropático
Nota: Mantener los animales en un entorno cómodo (criterio 1.6) para permitir la recuperación después de la inyección. En el día 7 post RTX de la inyección (D7), cada animal realiza las pruebas de filamento de pelo placa y von Frey en el mismo día para reducir el sesgo de tiempo y promover la eficiencia de las pruebas de comportamiento. Llevar los animales a una habitación tranquila que es mantenida a una humedad estable (40%) y temperatura (27 º C) para optimización de aclimatación del animal y reducir los efectos ambientales durante la prueba de comportamiento. No molestes a los animales durante los períodos de prueba; las pruebas de comportamiento se programan semanalmente.
<ol><li>Medición de latencias termal con el test de placa caliente<ol>
<li>Coloque al animal suavemente sobre una placa de metal caliente (27 cm x 29 cm) con una jaula de plexiglás transparente (largo × ancho × alto: 22 cm x 22 cm x 25 cm; Figura 1A). Ajuste la temperatura de la placa de metal caliente a 52 ° C.</li>
		<li>Comenzar a medir la duración de la latencia térmica del animal en la placa con el temporizador en el paso, integrado de la placa una vez fursuit de animal toque la placa y observa las respuestas de fursuit del animal. Si el animal muestra agitación, lamiendo de fursuit, o saltar mientras que en la placa caliente, retírela y registrar el tiempo que el animal permaneció en la placa. Esta duración de tiempo define la latencia termal de un animal individual. Grabar la latencia termal para el más cercano 0.1 s.</li>
		<li>Para cada sesión de la prueba, realizar tres ensayos con intervalos de 30 min para la normalización de la respuesta después de la última prueba de la placa caliente. Si el animal no muestra ninguna respuesta sobre la placa caliente, deje la sesión después de 25 s para evitar el potencial daño a los tejidos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prueba de medición del umbral mecánico con los filamentos de von Frey cabello<ol>
<li>Poner el animal sobre la malla metálica personalizada (tamaño de acoplamiento: 5 x 5 mm) con una jaula de plexiglás semitransparente cilindro (diámetro: 13 cm, altura: 12 cm) (figura 1B) para aclimatación durante al menos 2 h.</li>
		<li>Aplicar los diferentes calibres de los filamentos de von Frey cabello a la región plantar de la hindpaw con el método de arriba hacia abajo31. Iniciar la aplicación inicial de la fuerza media de un conjunto de filamentos de von Frey cabello para una duración de la aplicación del filamento de s 5-8.</li>
		<li>Utilizar un intervalo de 2 minutos entre aplicaciones de filamento para optimizar la normalización animal. Cambiar la fuerza aplicada filamento basada en la última respuesta del animal. Nota: Un conjunto de filamentos de von Frey cabello consiste en 0,064 0.085, 0.145, 0.32, 0.39, 1.1 y uso de la fuerza de 1,7 g. Por ejemplo, si hindpaw retiro ocurrió con una fuerza inicial de 0,32 g, luego aplicar 0,145 g. En la ausencia de retiro de la pata, se aplica una fuerza de 0,39 g. A continuación cuatro filamentos adicionales de fuerzas diferentes se aplican en base a las respuestas anteriores y el umbral mecánico se calcula según una fórmula publicado31.</li>
		<li>Para cada sesión de prueba incluyen el fursuit bilateral. Realizar tres ensayos para cada hindpaw. Expresa el promedio de estos seis umbrales mecánicos como el umbral mecánico promedio (mg) de cada animal.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56651/56651fig1.jpg"> Figura 1. Malla de jaula de plexiglás y el metal a medida para la evaluación del dolor neuropático en el modelo murino de resiniferatoxina (RTX)-inducida por neuropatía de fibra pequeña. (A, B) Estos gráficos muestran los equipos utilizados para medir (A) los Estados latentes térmicos por una placa de metal caliente (27 cm x 29 cm) con una jaula de plexiglás transparente (largo × ancho × alto: 22 cm x 22 cm × 25 cm) y evaluar (B) el umbral mecánico por una meta modificada para requisitos particulares malla l (tamaño de acoplamiento: 5 x 5 mm) con una jaula de plexiglás semitransparente cilindro (diámetro: 13 cm, altura: 12 cm) en los ratones con neuropatía de fibra pequeña RTX-inducida. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56651/56651fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. biopsia de la preparación y evaluación de la inervación IENFs de la piel
<ol><li>Después de pruebas de comportamiento, anestesiar los animales con 5% isoflurano y sacrificar a los animales por perfusión intracardíaca con tampón de fosfato de 0,1 M (PB) (pH 7.4) seguidos de paraformaldehído al 4% (4P) en 0,1 M de PB.</li>
	<li>Corte a las primera bandoleros de dos fursuit después de la perfusión y fijar después en 4P de h. 6 otra transferencia del tejido de la almohadilla a 0,1 M de PB a 4 ° C para almacenamiento a largo plazo.</li>
	<li>Cryoprotect bandoleros con sacarosa al 30% en PB durante la noche y de corte en vertical a modo superficie plantar en rebanadas gruesas de 30 μm. El bandolero de la etiqueta secciones secuencialmente y luego almacenar en anticongelante-20 ° c. Nota: La composición de anticongelante es el siguiente: agua destilada, glicerina de etileno, glicerol y 2 PB x en una proporción de 3:3:3:1.</li>
	<li>Para asegurar el adecuado muestreo, seleccionar cada sección tercera de la almohadilla.<ol>
<li>Ponga las secciones solicitadas bandolero en portaobjetos de vidrio y les deje secar al aire.</li>
		<li>Cubrir una cubierta de plástico sobre la diapositiva y proceso con procedimientos estándar immunostaining.<ol>
<li>Saciar las secciones de bandolero con 1% H2O2 en metanol por 30 min y bloque con leche descremada en polvo 0,5% y 0,1% Tritón X-100 en 0.5 M Tris buffer (Tris) durante 1 hora.</li>
			<li>Incubar las secciones bandolero con antisueros contra pan marcador axonal, PGP 9.5 (conejo criado en; 1:1, 000), durante una noche a 4 ° C.</li>
			<li>Incubar las secciones bandolero con una biotinilado cabra anti-conejo IgG anticuerpo secundario a temperatura ambiente (RT) por 1 h y luego incubar con el complejo avidina-biotina en RT por 45 min.</li>
			<li>Visualizar el producto de la reacción con 0.05% solución 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) para 45 s. Luego Lávese las secciones de la almohadilla con agua destilada y secar para el montaje. Nota: El antisuero primario y secundario se diluye con leche descremada en polvo 0.5% en 0,5 M Tris.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. DRG sección Preparación y evaluación de lesionados neuronas de pequeño diámetro
<ol><li>Diseccionar el 4to y 5to lumbar DRG y la solución para otro 2 h.</li>
	<li>Tejidos Cryoprotect DRG con 30% de sacarosa en PB durante la noche y cortan a un grosor de 8 μm secuencialmente, colocar en portaobjetos de microscopio y la etiqueta. Almacenar las secciones DRG en un congelador de-80 ° C.</li>
	<li>Secciones del Immunostain DRG en 80 μm-intervalos para muestreo adecuado.<ol>
<li>Realizar procedimientos de immunostaining DRG como los de las secciones de bandolero, salvo los procedimientos de inmunofluorescencia doble etiquetado. Como alternativa, incluyen ATF3 (conejo criado en; 1: 100), un marcador de lesión y peripherin (levantado adentro ratón; 1: 800), un marcador neuronal de pequeño diámetro en el antisuero primario.</li>
		<li>Incubar las secciones DRG con la mezcla de antisueros primarios durante la noche a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar las secciones DRG con ya sea tejas rojo o fluoresceína isotiocianato (FITC)-conjugados secundarios antisueros (1: 200), corresponden a los antisueros primarias apropiadas en RT para 1 h y luego montar para la cuantificación.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Eficaz tratamiento de la neuropatía de fibra pequeña en la clínica es necesaria para promover la recuperación funcional y calidad de vida de los pacientes. En la actualidad, hay falta de una guía terapéutica a trastornos sensoriales asociados con neuropatía de fibra pequeña debido a la falta de comprensión global de los mecanismos moleculares subyacentes a lesiones neuronales de pequeño diámetro. Los modelos anteriores de la neuropatía generalmente afectaron ambos nervios sensoriales de diámetro grande y pequeño; por eje...

Neuropatía de fibra pequeña que implicaba el dolor neuropático, que es evidente por la degeneración de IENFs, es común en varios tipos de condiciones, como la DM y como resultado de los efectos neurotóxicos de los agentes quimioterapéuticos1,2, 3,4,5. IENFs son los terminales periféricos de diámetro pequeño de neuronas localizadas en los ganglios de raíz dorsal (GRD) y son afectados en paralelo en los casos de IENF degeneración6. Por ejemplo, la transcripción genética upstream alterada de Somas neuronales ha demostrado por el upregulation de activar la transcripción factor-3 (ATF3)6,7. Por otra parte, la evaluación de la inervación IENFs con biopsia de la piel es útil para el diagnóstico de neuropatía de fibra pequeña5,8,9. Tradicionalmente, los perfiles de las IENFs en la biopsia de la piel han dependido de demostración immunohistochemical del producto del gene de la proteína 9.5 (PGP 9.5)1,10,11. Tomados en conjunto, los perfiles patológicos de DRG y IENFs reflejan la neuropatía de fibra pequeña subyacente condición funcional y pueden ser un indicador de las consecuencias funcionales de este tipo de neuropatía en las neuronas de pequeño diámetro.
Previamente, varios modelos experimentales han abordado el tema de la degeneración IENF en casos de neuropatía inducida por quimioterapia12,13 y nervio lesión causada por compresión o sección transversal14,15 , 16. estos modelos experimentales también afectaron los nervios de gran diámetro; por consiguiente, no es posible excluir la contribución de los nervios afectados de gran diámetro en la neuropatía de fibra pequeña observada; por ejemplo, el examen de thermosensation trastorno por retiro nocivo depende de las fibras del nervio de motor funcional17,18,19. Por lo tanto, establecer un modelo de neuropatía de fibra pequeña pura e investigar sistemáticamente el estado patológico de Somas neuronales y sus fibras nerviosas cutáneas periféricas en las neuronas de pequeño diámetro son necesario e imperioso.
RTX es un análogo de la capsaicina, un potente agonista del receptor transitorio potencial vaniloides receptor 1 (TRPV1), que media el proceso nociceptivo20,21,22. Recientemente, periférica tratamiento RTX relevó dolor neurogénico23,24,25 y una inyección intraganglionic de RTX indujo la pérdida irreversible de neuronas DRG22. El efecto de la administración de RTX periférica es dosis dependiente20,26,27, que dio lugar a la desensibilización transitoria o degeneración de IENFs. Curiosamente, tratamiento sistemático de RTX de la alto-dosis llevó a dolor neuropático28, un síntoma de neuropatía de fibra pequeña. Estos resultados sugieren que el modo de tratamiento y la dosis de RTX producen distintos efectos patológicos y respuestas neuronales; a saber, administración periférica impidió la transmisión del dolor por los efectos locales29 y afectado los Somas neuronales que desarrollado comportamiento neuropático6. Colectivamente, estos resultados indican que el RTX tiene un efecto de multipotencia y planteó la cuestión de si existe una dosis determinada de RTX que sistemáticamente puede afectar los nervios periféricos, como la IENFs periféricas y central Somas neuronales. Si es así, el RTX puede ser un agente potencial que específicamente afectan a las neuronas de pequeño diámetro y mímico neuropatía de fibra pequeña en la clínica. Por ejemplo, DM en la clínica es un tema complicado como desorden metabólico y neuropatología de nervios periféricos, que son las principales características de la neuropatía de fibra pequeña. Los mecanismos de la neuropatía de fibra pequeña asociada a DM no podrían excluir la contribución de desorden metabólico que puede no ser el principal agente que afectan a los nervios periféricos. Por lo tanto, neuropatía de fibra pequeña asociada a la DM requiere de un modelo animal puro que podría excluir los efectos del desorden metabólico sistemático. Este protocolo describe la dosis de trabajo de RTX para desarrollar un modelo de neuropatía de fibra pequeña típica, como IENF degeneración y lesión de la neurona de pequeño diámetro, según lo demostrado por análisis de immunostaining modificado.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivo químico</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resiniferatoxina</td><td>Sigma</td><td>R8756</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-diaminobenzidina</td><td>Sigma</td><td>D8001</td><td></td></tr><tr><td>Vector de complejo avidina-biotina</td><td></td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Primary Antisera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peripherin</td><td>Chemicon</td><td>MAB-1527</td><td></td></tr><tr><td>ATF3</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-188</td><td></td></tr><tr><td>PGP9.5</td><td>UltraClone</td><td>RA95101</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Secondary Antisera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated goatat anti-rabbit IgG</td><td>Vector</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas Cabra conjugada roja anti-ratón</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-075-146</td><td></td></tr><tr><td>Burro conjugado con isotiocianato (FITC) anti-conejo</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa caliente</td><td>IITC</td><td>Modelo 39</td><td></td></tr><tr><td>von Frey filamento</td><td>Somedic Sales AB</td><td>10-600-0001</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shandon</td><td>coverplate Thermo scientific</td><td>72110017</td><td></td></tr><tr><td>Slide rack</td><td>Thermo scientific</td><td>73310017</td><td></td></tr></tbody></table>

establecer un modelo de ratón de una neuropatía de fibra pequeña pura con el ultrapotent agonista de receptor transitorio potencial vaniloides tipo 1

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Pacientes con diabetes mellitus (DM) o experimentar los efectos neurotóxicos de los agentes quimioterapéuticos pueden desarrollar trastornos de la sensibilidad debido a la degeneración y lesión de las neuronas sensoriales de pequeño diámetro, conocido como neuropatía de fibra pequeña. Modelos animales actuales de neuropatía de fibra pequeña afectan tanto las fibras sensoriales de diámetro grande y pequeño y así crean una neuropatología demasiado complejos para evaluar correctamente los efectos de heridas fibras sensoriales de pequeño diámetro. Por lo tanto, es necesario desarrollar un modelo experimental de neuropatía de fibra pequeña pura para examinar adecuadamente estas cuestiones. Este protocolo describe un modelo experimental de neuropatía de fibra pequeña que específicamente afectan nervios sensoriales de pequeño diámetro con resiniferatoxina (RTX), un agonista ultrapotent del receptor transitorio potencial vaniloides tipo 1 (TRPV1), a través de una sola dosis de inyección intraperitoneal, se denomina neuropatía RTX. Esta neuropatía RTX mostró manifestaciones patológicas y anormalidades del comportamiento que imitan las características clínicas de los pacientes con neuropatía de fibra pequeña, incluyendo la degeneración de la fibra del nervio (IENF) de intraepidermal, específicamente lesiones en las neuronas de pequeño diámetro y la inducción de hipoalgesia térmica y alodinia mecánica. Este protocolo probado tres dosis de RTX (200, 50 y 10 μg/kg, respectivamente) y concluyeron que una dosis crítica de RTX (50 μg/kg) es necesaria para el desarrollo de manifestaciones de neuropatía de fibra pequeña típica y preparado un procedimiento modificado de la inmunotinción para investigar IENF degeneración y lesión del soma neuronal. El procedimiento modificado es rápida, sistemática y económica. Evaluación conductual del dolor neuropático es fundamental para revelar la función de los nervios sensoriales de pequeño diámetro. La evaluación de los umbrales mecánicos en roedores experimentales es particularmente desafiante y este protocolo describe una malla metálica modificada para requisitos particulares que es conveniente para este tipo de evaluación en los roedores. En Resumen, la neuropatía RTX es un modelo experimental nuevo y fácilmente establecido para evaluar la significación molecular e intervención subyacente dolor neuropático para el desarrollo de agentes terapéuticos.

Este protocolo describe un modelo de ratón novela de neuropatía RTX, que afecta específicamente a las neuronas de pequeño diámetro, incluyendo la degeneración IENF, asociada con los trastornos sensoriales (figura 2). Siguiendo el protocolo descrito en este documento, los animales exhiben hipoalgesia térmica y alodinia mecánica en D7 después RTX de la inyección. Para establecer este modelo de neuropatía de fibra pequeña, tres dosis de RTX: 200, 50 y 10 μg/kg s...

Este estudio establece un modelo experimental de neuropatía de fibra pequeña pura con la resiniferatoxina (RTX). Una dosis única de RTX (50 μg/kg) es óptimo para el desarrollo de un modelo de neuropatía de fibra pequeña que imita las características de los pacientes y podría ayudar a investigar el significado molecular nociceptivo subyacente dolor neuropático.

Establecer un modelo de ratón de una neuropatía de fibra pequeña pura con el Ultrapotent agonista de Receptor transitorio potencial vaniloides tipo 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

El objetivo general de este procedimiento de administración de neurotoxinas sensoriales específicas para ratones es establecer un modelo de neuropatía sensorial de animales pequeños. Esta técnica ayuda a exponer las leyes de las lesiones pequeñas, fibras sensoriales en la neuropatía sensorial. Su principal ventaja es que es rápido y sencillo.Estos ratones pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo neuropático sensorial, como qué vía es la contribución crucial para las fibras sensoriales grandes. Para empezar, póngase el equipo de protección personal y tome las precauciones adecuadas mientras prepara la solución madre de resiniferatoxina, o RTX. Diluya una alícuota de 600 microlitros en solución salina para el experimento y divida el resto en alícuotas de 12 microlitros para su almacenamiento.En el caso de los ratones de prueba, utilice ratones ICR machos adultos de ocho semanas de edad, que pesen entre 35 y 40 gramos. Administrar una dosis única de solución RTX por vía intraperitoneal con una jeringa de microinyección. A continuación, inyecte un segundo grupo de ratones con un volumen igual de vehículo para que sirva de control.Después de hacer todas las inyecciones, aloje a los ratones en sus jaulas caseras y asegúrese de que tengan acceso improvisado a comida y agua. Después de siete días, comience a realizar pruebas de comportamiento una vez por semana. Realice ambas pruebas el mismo día en una sala de pruebas tranquila, con un entorno estable.Comience midiendo las latencias térmicas de los animales con la prueba de la placa caliente. Coloque una placa calefactora de metal a 52 grados centígrados. Luego, coloque suavemente un animal en una jaula transparente de plexiglás sobre la placa caliente.Inicie un temporizador tan pronto como las patas traseras del animal toquen la jaula caliente. Si el animal comienza a temblar, lamer sus patas traseras o saltar, retírelo y registre cuánto tiempo resistió la placa caliente con una precisión de décimas de segundo. Si el animal no muestra respuesta en la placa calefactora, detenga la sesión después de 25 segundos para evitar posibles daños en los tejidos.Realizar tres ensayos por animal, con un tiempo de descanso de 30 minutos entre ensayos. Posteriormente, utilice el tiempo medio de las tres pruebas como puntuación final del animal. A continuación, mida el umbral de sensación mecánica del animal.Coloque al animal en una jaula redonda transparente, con una malla metálica como piso. Después de la aclimatación, aplique los diferentes calibres de filamentos de pelo de von Frey en la región plantar de la pata trasera, utilizando el método de arriba y abajo. Para la primera estimulación, aplique un filamento de fuerza media durante 5 a 8 segundos.Después de cada estimulación, espere dos minutos, luego aplique la siguiente fuerza en función de la respuesta previa del animal. Si la pata trasera se retiró, use el siguiente filamento de calibre más bajo. Y si la pata trasera no se retiró, use el siguiente filamento más grande.Continúe este proceso hasta que el mouse haya sido empujado seis veces. A continuación, calcule el umbral mecánico utilizando una fórmula establecida. En cada día de prueba, realice tres pruebas en cada pata trasera.Expresa el promedio de estos seis umbrales mecánicos como el umbral mecánico medio de cada animal. Para la eutanasia, use isoflurano al 5 por ciento, seguido de una perfusión intracardíaca. Luego, retire las primeras almohadillas de las dos patas traseras y fíjelas en PFA al 4 por ciento durante seis horas.Después de la fijación, transfiéralos a un tampón de fosfato 0,1 molar a 4 grados centígrados. Esto sirve como una solución de almacenamiento a largo plazo. Antes de la criosección, remoje las almohadillas para los pies en sacarosa al 30% en PBS durante la noche.Al día siguiente, use un criostato para hacer cortes de tejido de 30 micras cortando verticalmente la superficie plantar. Etiquete las secciones de la almohadilla para los pies secuencialmente y luego guárdelas en una solución anti-feeze a 20 grados centígrados negativos. Al muestrear las secciones, seleccione cada tercera sección y transfiérala a un portaobjetos de vidrio recubierto para que se seque al aire.A continuación, cubra cada lado con una placa de cubierta y procéselos con un procedimiento de inmunotinción estándar. Primero, enfríe las secciones de la almohadilla del pie con peróxido de hidrógeno al 1% en metanol durante 30 minutos. A continuación, lavar los pañuelos tres veces con tampón Tris 0,5 molar a temperatura ambiente.A continuación, incube los tejidos en solución en bloque durante una hora. A continuación, incubar las secciones con un antisuero contra el marcador panaxonal durante la noche a 4 grados centígrados. Al día siguiente, lavar las secciones con tampón Tris tres veces y luego incubar las secciones en IgG anti-conejo biotinilado a temperatura ambiente durante una hora.Posteriormente, utilice tres lavados con tampón Tris para eliminar los anticuerpos no unidos. A continuación, incubar los tejidos con el complejo de avidina biotina a temperatura ambiente durante 45 minutos. Para manchar el producto de reacción, aplique brevemente la solución de DAB durante 45 segundos, luego lave las secciones de la almohadilla del pie con agua destilada y séquelas al aire antes de montarlas.Después de retirar las almohadillas de las patas del animal sacrificado, diseccione el cuarto y quinto DRG lumbar. A continuación, fije los tejidos DRG disecados durante dos horas en un cuatro por ciento de PFA a temperatura ambiente. A continuación, crioproteja los tejidos DRG con un 30% de sacarosa en PBS durante la noche.Al día siguiente, córtelos en secciones de ocho micras. Colócalos en portaobjetos y etiquétalos. Guarde estas secciones a menos 80 grados centígrados.Use el mismo método que se usa para las secciones de las almohadillas para los pies, excepto cuando se etiquete, incluya ATF-3, un marcador de lesión, y periferina, un marcador neuronal de pequeño diámetro en los antisueros primarios, y ejecute esa reacción durante la noche. Después de lavar las secciones, incubarlas con los antisueros secundarios adecuados. Luego, después de otra serie de lavados, monte las secciones para la cuantificación.Este protocolo describe un nuevo modelo de ratón de neuropatía por resiniferatoxina, que afecta específicamente a las neuronas de pequeño diámetro, incluida la degeneración IENF asociada con trastornos sensoriales. La dosis de 50 microgramos por kilogramo se consideró crítica y una dosis más alta fue frecuentemente letal. Siete días después de la inyección de RTX, los animales mostraron hipoalgesia térmica y alodinia mecánica.A la dosis crítica, hubo degeneración de IENF e inducción marcada de ATF-3. Las neuronas lesionadas eran neuronas periferinas positivas, de diámetro pequeño. Por el contrario, la dosis baja de RTX no estableció neuropatía de fibras pequeñas y no mostró cambios en la inervación.La dosis baja tampoco mostró ninguna inducción de ATF-3, un marcador de lesión neuronal. Por lo tanto, se sugiere la dosis crítica de 50 microgramos de RTX por kilogramo para la aplicación del método descrito. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer un modelo de neuropatía sensorial pura.Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para la investigación en el campo de la neuropatía sensorial pequeña, hasta su contribución como producto de la lesión de los nervios sensitivos, en el desarrollo del dolor neuropático. No olvide que RTX es neurotóxico y peligroso y puede actuar como irritante para los ojos, las membranas mucosas y el tracto respiratorio superior. Evite la inhalación y use anteojos y abrigo de laboratorio mientras manipula RTX.Enjuagar con abundante agua en caso de contacto con la piel y después de la manipulación.

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Este video muestra cómo probar la función de los nervios sensoriales en un modelo de ratón denervando quirúrgicamente un lado y dejando el otro como control. La respuesta a la estimulación mecánica confirma el papel de los nervios sensoriales.

Prueba de la función nerviosa sensorial en un modelo de ratón denervado quirúrgicamente

Este video muestra un método para establecer un modelo de neuropatía de fibras pequeñas en ratones utilizando el agonista TRPV1 resiniferatoxina (RTX). Describe los pasos involucrados en la administración de RTX a ratones y explica cómo RTX induce la muerte neuronal en neuronas sensoriales de diámetro pequeño, estableciendo así el modelo de neuropatía.

Establecimiento de un modelo de ratón de neuropatía de fibras pequeñas utilizando resiniferatoxina

El dolor neuropático es una consecuencia de una lesión o enfermedad que afecta al sistema somatosensorial. El "modelo de puño" del dolor neuropático en ratones consiste en la implantación de un manguito de polietileno alrededor de la rama principal del nervio ciático. La alodinia mecánica se prueba utilizando filamentos de von Frey.

El nervio ciático esposar modelo de dolor neuropático en ratones

Este informe describe un enfoque simple para inducir con éxito neuritis autoinmune experimental (EAN) utilizando la mielina proteína cero (P0)180-199 péptido en combinación con adyuvante completo de Freund y toxina del pertussis. Presentamos un paradigma sofisticado capaz de evaluar con precisión la magnitud de los déficits funcionales y neuropatología que ocurren en este EAN.

Un enfoque Simple para inducir Neuritis Autoinmune Experimental en ratones C57BL/6 para las evaluaciones funcionales y Neuropathological

La medición de la conducción nerviosa es una herramienta útil para evaluar modelos de neurodegeneración ratón pero es con frecuencia sólo se aplica para estimular el nervio ciático en miembros posteriores. Aquí, describimos una técnica para medir compuestos musculares potencial de acción (CMAP) en vivo en el ratón miembro anterior músculos inervados por el plexo braquial.

En Vivo Medición electrofisiológica de potencial de acción compuesto del músculo de las extremidades anteriores en modelos de ratón de la degeneración de la motoneurona

El objetivo de esta técnica es preparar una cultura altamente enriquecida de primarias motoneuronas (MNs) de murine de la médula espinal. Para evaluar las consecuencias de las mutaciones que causan enfermedades de MN, Describimos aquí el aislamiento de estos aislados MNs y su transfección por magnetofection.

Modelado enfermedad del Charcot-Marie-diente In Vitro por transferencia primaria Motoneurons de ratón

El modelo de inoculación de la almohadilla es una herramienta valiosa para caracterizar las respuestas neuroinflamatorias inducidas por virus in vivo. En particular, proporciona una evaluación clara de la cinética viral y los procesos inmunopatológicos asociados iniciados en el sistema nervioso periférico.

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La cirugía modificada es un método simplificado para el modelo de lesión nerviosa sin nervios en ratones o ratas que requiere solo una ligadura y un corte para lesionar los nervios peroneo y sural comunes.

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La ligadura parcial del nervio ciático induce dolor neuropático crónico de larga duración, caracterizado por respuestas exageradas a estímulos térmicos y mecánicos. Este modelo de ratón de dolor neuropático se usa comúnmente para estudiar terapias innovadoras para el manejo del dolor. Este artículo describe en detalle el procedimiento quirúrgico para mejorar la estandarización y la reproducibilidad.

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La lesión crónica por constricción del nervio infraorbitario distal en ratones induce cambios en el comportamiento espontáneo (aumento de la actividad de acicalamiento facial) y el comportamiento nocifensivo en respuesta a la estimulación táctil (hiperreactividad a la estimulación del cabello de von Frey) que son signos de dolor continuo y alodinia, y sirven como modelo para el dolor neuropático del trigémino.

Lesión crónica por constricción del nervio infraorbitario distal (DIoN-CCI) en ratones para estudiar el dolor neuropático del trigémino

Este protocolo presenta un modelo de rata reproducible que utiliza nervios sensoriales para imitar el dolor del neuroma humano y evaluar los tratamientos quirúrgicos, ofreciendo una herramienta valiosa para la investigación traslacional del neuroma.

Nuevo modelo quirúrgico de roedores para estudiar las opciones de tratamiento del dolor del neuroma mediante la reinervación muscular dirigida a través del nervio safeno

Aprende a establecer un modelo de ratón de neuropatía de fibra pequeña usando resiniferatoxina (RTX) a 50 µg/kg. Este método permite estudiar mecanismos de dolor neuropático y degeneración de fibras nerviosas intraepidérmicas en investigación biomédica.

Establecer un modelo de ratón de una neuropatía de fibra pequeña pura con el Ultrapotent agonista de Receptor transitorio potencial vaniloides tipo 1 (Video) | JoVE Journal

Establecer un modelo de ratón de una neuropatía de fibra pequeña pura con el Ultrapotent agonista de Receptor transitorio potencial vaniloides tipo 1

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