Name: Síntesis y análisis de espectrometría de masas de peptoides Oligo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprenda a sintetizar oligo-peptoides manualmente y analizar su secuencia de monómeros mediante espectrometría de masas. Este protocolo guía a principiantes en química analítica y bioquímica para caracterizar estos polímeros sintéticos.

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Los autores desean agradecer al Sr. Michael Connolly y Dr. Ronald Zuckermann (la fundición Molecular, laboratorio nacional Lawrence Berkeley) ayuda de la técnica en la síntesis de peptoid. Reconocemos el apoyo de la National Science Foundation (-1301505). Todos los experimentos de espectrometría de masas se llevaron a cabo en las instalaciones de espectrometría de masa química en la Universidad del Pacífico.

1. síntesis de Peptoid
Nota: La síntesis comienza con la activación de la resina por la hinchazón de la resina y eliminar el grupo de protección. Esto es seguido por crecimiento de la cadena de peptoid en la resina a través de la repetición de ciclos de la adición de monómero. El primer monómero juntado a la resina es el residuo c-terminal. El peptoid es alargado de la terminal C a la N-terminal. Una vez lograda la secuencia deseada de la peptoid, la resina es troceada apagado y se purifica el producto peptoid.
<ol><li>Preparación de los reactivos Nota: Los reactivos líquidos se miden utilizando una micropipeta y los reactivos sólidos se miden utilizando una balanza analítica.<ol>
<li>6,2 ml de N, N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) y 43,8 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) para preparar un 0,8 M de solución DIC/DMF.</li>
		<li>Disolver 5,56 g de BMA en 50,0 mL de DMF para preparar una solución de M BMA/DMF 0,8.</li>
		<li>Mezclar 2 mL de piperidina (Pip) y 8 mL de DMF para lograr la solución al 20% Pip/DMF.</li>
		<li>Disolver 1.9 mL de Npe a 13,1 mL de DMF para alcanzar 1.0 M Npe/DMF.</li>
		<li>Disolver 1,3 mL de Nme en 13,7 mL DMF para alcanzar 1.0 M Nme/DMF.</li>
		<li>Disolver 0,32 mL de Nae en 2 mL de DMF para alcanzar 1.0 M Nae/DMF. PRECAUCIÓN: La mayoría de los productos químicos utilizados en la síntesis es peligrosa. Ácido trifluoroacético (TFA), DIC, Pip y BMA son peligrosos para la piel, ojos y vías respiratorias. DMF y diclorometano (DCM) son sospechosos cancerígenos. Todas las reacciones deben realizarse en una campana de humos y debe usarse equipo de protección personal. Por favor revise la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) de todos los productos químicos utilizados en la síntesis.</li>
	</ol></li>
	<li>Activación de resina
	<ol>
<li>Mida 84 mg de resina amida de pista (resina, 0.047 mmol, carga de 0,56 mmol/g) y añadir a un recipiente de la reacción de fase sólida polipropileno de 10 mL. Inserte el émbolo en el recipiente.</li>
		<li>Añadir 2 mL de DMF en el recipiente de la reacción y tapa el recipiente con una tapa de presión. Coloque el vaso en un agitador y agitar el recipiente a temperatura ambiente en un ángulo de movimiento de aproximadamente 12 grados y 385 oscilaciones/min durante 30 min drenaje la solución a un recipiente retirar la tapa y empujando el émbolo del recipiente de reacción.</li>
		<li>Añadir 2 mL de solución al 20% Pip/DMF al recipiente y la tapa el recipiente. Agitar en el agitador por 2 min y drenar la solución para el depósito de residuos.</li>
		<li>Añadir 2 mL de solución al 20% Pip/DMF al recipiente, el recipiente, la tapa y agitar a temperatura ambiente durante 12 min., retire la tapa y vaciar la solución para el depósito de residuos.</li>
		<li>Lavar la resina mediante la adición de 1 mL de DMF, tapado el recipiente y agitar el recipiente durante 1 minuto sacar el tapón y vaciar la solución empujando el émbolo. Lavar la resina con DMF para 4 veces adicionales.</li>
	</ol></li>
	<li>Además del monómero y la acetilación N-terminal Nota: Cada ciclo de la adición de monómero implica desplazamiento, bromoacetylation y reacción de dos pasos.<ol>
<li>Llevar a cabo el primer ciclo de adición de monómero para formar Nme-resina.</li>
		<li>Llevar a cabo una reacción de bromoacetylation. Mezclar 1 mL de solución M BMA/DMF 0,8 y 1 mL de 0,8 M DIC/DMF solución en un vaso de precipitados. Transferir la mezcla a un recipiente de reacción que contienen resina y tapa el recipiente. Coloque el vaso en el agitador y agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos Retire la tapa y vaciar la solución para el depósito de residuos.</li>
		<li>Lavar la resina por agregar 1 mL de DMF, tapado el recipiente, agitar durante 1 min y drenar la solución empujando el émbolo. Lavar la resina por agregar 1 mL de DCM, agitando el recipiente durante 1 min y drenar la solución. Lavar la resina con DCM una vez más y luego lavar dos veces con DMF.</li>
		<li>Llevar a cabo una reacción de desplazamiento. Añadir 1 mL de 1,0 solución de M Nme/DMF, tapa el recipiente, agitar el recipiente a temperatura ambiente durante 60 minutos Retire la tapa y vaciar la solución empujando el émbolo.</li>
		<li>Lavar la resina agregando 1 mL DMF, agitando el recipiente durante 1 min y drenar la solución empujando el émbolo. Lavar la resina en 1 mL de DCM, agitando durante 1 minuto, y drenar la solución. Lave el DCM una vez más, seguido de lavado dos veces con DMF.</li>
		<li>Repetir ciclos de adición de monómero de pasos 1.3.2 a 1.3.5 formar Nae-(Npe-Nme)4-resina. Cuando repitiendo el paso de la reacción de desplazamiento (1.3.4), utilice una solución de Amina específicos según la secuencia peptoid. Nota: La cadena peptoid es alargada de la terminal C a la N-terminal con el residuo c-terminal a la resina.</li>
		<li>Realizar la acetilación N-terminal para formar Ac-Nae-(Npe-Nme)4-resina.</li>
		<li>Anhídrido acético Mix 92 μl of, 43.5 μl de N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) y 2 mL de DMF en un vaso de precipitados para hacer aproximadamente 2 mL de la acetilación de cóctel.</li>
		<li>Añadir 2 mL de acetilación cóctel al recipiente que contiene resina, tapa el recipiente y agitar a temperatura ambiente por 60 min., retire la tapa y vaciar la solución empujando el émbolo.</li>
		<li>Lavar la resina por agregar 1 mL de DMF, agitando el recipiente durante 1 min y drenar la solución empujando el émbolo. Lavar la resina por agregar 1 mL de DCM, agitando el recipiente durante 1 min y drenar la solución. Repita el lavado de la resina con DCM una vez más, luego lavado con DMF dos veces más.</li>
		<li>Lavar la resina por agregar 1 mL de DCM, agitando el recipiente durante 1 min y drenar la solución empujando el émbolo. Repetir el lavado dos veces con DCM. Retire la tapa y deje que la resina seque al aire en el recipiente de reacción durante 10 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Escote y purificación
	<ol>
<li>Mezclar 3,8 mL de TFA, 100 μl de Triisopropilsilano (consejos) y 100 μl de grado HPLC H2O en un vaso de precipitados para hacer 4 mL de escote cocktail.</li>
		<li>Añadir 4 mL de recién hechos escote cóctel al recipiente que contiene la resina, tapa el recipiente y agitar a temperatura ambiente durante 2 h.</li>
		<li>Retire la tapa y recoger la solución de filtrado en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mL. Añadir 1 mL de TFA al recipiente, tápalo y agitar durante 1 minuto recoge la solución de filtrado en el mismo tubo de centrífuga.</li>
		<li>Soplando en una corriente de gas nitrógeno suavemente hasta aproximadamente 1 mL solución viscosa se deja evaporar la TFA.</li>
		<li>Añadir 15 mL de éter etílico a la solución restante, tapa el tubo de centrífuga e incube en un congelador de-20 ° C por 2 h para toda la noche. El peptoid crudo precipita como sólido blanco.</li>
		<li>Pellet sólido utilizando una centrífuga a 4.427 x g durante 10 minutos Retire la tapa del tubo de centrífuga y decantar el éter dietílico en un vaso de precipitados con cuidado sin perder el sólido. PRECAUCIÓN: el éter dietílico es un solvente orgánico inflamable. Utilice una centrifugadora seguro de éter dietílico.</li>
		<li>Lave el sólido añadiendo 10 mL de éter dietílico helado en la centrifugadora del tubo que contiene el sólido, tapado el tubo y colocarlo en la centrífuga. Realizar la centrifugación a 4.427 x g durante 10 minutos Retire la centrifugadora del tubo de la centrífuga y decantar el éter dietílico en un vaso de precipitados con cuidado sin perder el sólido.</li>
		<li>Secar el sólido soplando suavemente en una corriente de gas nitrógeno.</li>
		<li>Añadir 10 mL de grado HPLC H2O para disolver el sólido seco. Pasar la solución a través de un filtro de jeringa de nylon con tamaño de poro de 0.45 μm y recoger el filtrado en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mL previamente ponderada.</li>
		<li>Cáscara de congelar la solución colocando y rotando el tubo de centrífuga que contiene la solución de peptoid en 12 onzas, doble-apilan ampliada poliestireno taza 1/3 lleno con nitrógeno líquido. Liofilizar la solución congelada durante la noche para producir sólido peptoid.</li>
		<li>Repetir una vez más la liofilización disolviendo el sólido peptoid en 10 mL de grado HPLC H2O, shell de congelación en nitrógeno líquido y 1.llenar durante la noche. El peptoid resultante es lo suficientemente puro para análisis de la secuencia por espectrometría de masas.</li>
	</ol></li>
</ol>2. MS medidas y análisis de la secuencia
Nota: El experimento de MS/MS se realiza en un espectrómetro de masas triple cuadrupolo acoplado a una fuente de electrospray (ESI) de ionización. Recolección de datos se controla mediante el software de adquisición de datos junto con el instrumento. El procedimiento general incluye 1) realizar el experimento de espectrometría de masas de análisis completo y registrar el espectro de masas, 2) realizar el CID MS/MS experimentar y registrar el espectro MS/MS y 3) que compararon los datos espectrales MS/MS con teóricos esquema de fragmentación predicho basado en la característica estructural de la peptoid.
<ol><li>Preparación de la solución de la muestra
	<ol>
<li>Pesar 1.0-2.0 mg sólido peptoid en un frasco de vidrio de 3 a 5 mL. Añadir 1 mL de mezcla solvente de acetonitrilo y agua (ACN/H2O, 1:1, v/v) para disolver el peptoid. Esto da la solución de muestra común con una concentración de 10-3 M.</li>
		<li>Transferir 20 μl de la solución madre a un tubo de centrífuga de 1.5 mL y añadir 1 mL de mezcla solvente de ACN/H2O para dar una solución muestra diluida de cerca de 10-5 M.</li>
		<li>Eliminar las posibles partículas insolubles en la solución muestra diluida por la realización de centrifugación a 4.427 x g por 3 minutos transferir unos 700 μl de la parte superior de la solución a otra centrífuga de 1,5 mL del tubo para hacer el peptoid MS solución de trabajo con concentración de 10-5 M.</li>
		<li>Ajustar la concentración de la solución de trabajo de MS basada en la intensidad de la señal observada durante las mediciones de espectrometría de masas.</li>
		<li>Una manera alternativa para eliminar las posibles partículas insolubles en la solución muestra diluida es la solución de la muestra a través de un filtro de jeringa 0.20 μm y recoger el filtrado en un tubo de centrífuga de 1.5 mL para hacer la peptoid MS solución de trabajo de alrededor de 10-5 M.</li>
	</ol></li>
	<li>Grabación de espectros de masas
	<ol>
<li>Recorren solvente mezclado de ACN/H2O (1:1, v/v) de la fuente (ESI) de la ionización de electrospray y configurar el instrumento en un ion positivo estándar, modo de barrido completo de espectrometría de masas con una gama de la relación masa / carga (m/z) de 100-1500. Nota: Parámetros de funcionamiento típicos: Tensión de la aguja ESI, 5 kV Tensión capilar, 40 V Secado temperatura del gas (nitrógeno), 200 ° C.</li>
		<li>Agregar aproximadamente 300 μL de solución de trabajo de peptoid MS (10-5 M) en una jeringa de 1 mL o 500 μl y conectar la jeringa a la entrada ESI usando tubos de capilares de poliéter éter cetona (PEEK). Coloque la jeringa en la bomba de la jeringuilla y el caudal en 10 μl/min para infundir la solución de muestra en la entrada ESI.</li>
		<li>Encienda la tensión de la aguja ESI para activar el proceso ESI y luego encienda el detector. Configurar la pantalla en modo de perfil y la gama de m/z de 100-1.500. Ver un perfil de espectro de masas mostrado en la ventana de perfil. El pico en m/z 1.265 (aparece como m/z de 1,264.6) corresponde a la peptoid de peptoid ion o protonada.</li>
		<li>Registrar el espectro de MS por 2 min. En la "ventana de método", utilizar 2 min como el "tiempo de ejecución". Abrir la ventana de grabación rellenar un nombre de archivo adecuado y empezar a grabar el espectro. Nota: El espectro de masas resultante se muestra en la figura 3.</li>
		<li>Optimizar la intensidad del pico en m/z de 1.265. La gama de m/z a 1.150-1.350 y ajuste la tensión capilar mientras se visualiza la intensidad de pico en mV que se muestra en la ventana de perfil. Por ejemplo, aumentar la tensión capilar a 50 V o más y ver el cambio de la intensidad de pico. La intensidad de pico óptima es alrededor de 150-200 mV. Nota: Ajuste la tensión capilar puede cambiar significativamente la abundancia de ciertos iones. Aumento de la tensión capilar puede aumentar la intensidad del ion del peptoid. Sin embargo, un alto voltaje capilar también puede inducir la disociación del ion peptoid en la fuente de iones y disminuir la intensidad observada. Ajustar la temperatura del gas de secado puede aumentar la intensidad del pico en m/z 1.265, pero es menos efectivo que el ajuste de la tensión capilar. Si el pico a m/z 1.265 no alcanza la intensidad óptima, ajuste la concentración de muestra (o ejemplo, doble la concentración de la solución de trabajo de MS).</li>
		<li>Cambiar el instrumento en el modo MS/MS. El ion precursor en m/z 1.265 y MS/MS total rango en m/z de 100-1.400. En la "ventana de método", utilizar m/z 1.265 como la "Misa primera Q1" y deje en blanco el "Q1 última misa". Uso de m/z 100 como la "Primera Misa de la Q3" y m/z 1.400 como la Misa "Q3 pasado." Nota: En el modo MS/MS, el primer cuadrupolo (Q1) funciones como filtro masa para aislar el peptoid ion como el ion del precursor, la segunda unidad de cuadrupolo (Q2) es una celda de colisión y el tercer cuadrupolo (Q3) funciones como un analizador de masas.</li>
		<li>Sistema de presión de la energía de colisión en 40 eV y el gas de colisión (argón, en este caso) en 1.5 mTorr.</li>
		<li>Ver un perfil de espectro de masas muestra en la ventana de perfil. El pico en m/z de 1.265 corresponde al ion peptoid, y los picos con valores más bajos de m/z representan los fragmentos del peptoid ion.</li>
		<li>Ajustar la energía de la colisión para optimizar la visualización del espectro de fragmentación. Por ejemplo, aumentar la energía de la colisión a 45 eV y ver el cambio del perfil del espectro. Nota: en general, aumentando la energía de colisión realzará la abundancia de los iones del fragmento y reducir la abundancia del ion del peptoid. Aumento de la presión de gas de colisión también mejorará la abundancia de los iones del fragmento. PRECAUCIÓN: No aumentar la presión del gas de colisión más allá de 2 mTorr.</li>
		<li>Registrar el espectro MS/MS por 2 min. En la "ventana de método", utilizar 2 min como el "tiempo de ejecución". Abrir la ventana de grabación rellenar un nombre de archivo adecuado y empezar a grabar el espectro.</li>
		<li>Repetir 1 - 2 veces la grabación.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de la secuencia de Peptoid Nota: Bajo la condición de CID, el ion peptoid fragmentaría en los enlaces de la amida a lo largo de la columna vertebral de peptoid para producir una serie de fragmentos N-terminal llamado B-iones y una serie de fragmentos c-terminal llamadas iones Y<ol>
<li>Dibujar la estructura química de la peptoid acetilado colocando el N-terminal en el lado izquierdo y el c-terminal a la derecha y dibuja una línea discontinua en cada enlace amida para generar un esquema de fragmentación como se muestra en la Figura 2a. Dibujar un protón con un círculo de puntos para indicar que el portador de la carga. A partir del lado izquierdo de la estructura, colocar etiquetas en las líneas punteadas para indicar los fragmentos N-terminal como B1, B2, B8. A partir de la derecha, coloque las etiquetas en las líneas discontinuas para indicar los fragmentos c-terminal Y1, Y2, Y8. Nota: Un software de dibujo químico puede ser utilizado para dibujar la estructura de peptoid.</li>
		<li>Imaginar la fragmentación en el enlace de amidath 4 del lado izquierdo y dibujar las estructuras del fragmento N-terminal y el fragmento c-terminal con cargos formales adecuados, como se muestra en la figura 2b. Coloque la etiqueta de B4 en el fragmento N-terminal y coloque la etiqueta de Y5 en el fragmento del c-terminal. Calcular el valor de m/z de B4 sumando las masas nominales de los elementos de la estructura para producir un valor de 580 y coloque m/z 580 en el fragmento N-terminal. Calcular el valor de m/z de Y5 y m/z 685 en el fragmento del c-terminal.</li>
		<li>Calcular los valores de m/z para los ocho iones de B y todos los de ocho Y en iones y montarlos en una tabla, como se muestra en la tabla 1. Nota: Los valores de m/z de los fragmentos pueden calcularse usando un producto químico, software de dibujo.</li>
		<li>Abrir el espectro MS/MS grabado de la peptoid usando el software de revisión de datos acompañado con el instrumento. Establecer las preferencias de etiquetado a "Mostrar etiquetas de iones" y sello umbral al 3%. Esto genera un espectro MS/MS con los valores de m/z en los picos.</li>
		<li>La MS/MS datos espectrales como archivo de texto en el formato CSV reconstrucción el espectro utilizando software de procesamiento de datos y el formato de exportación. Colocar valores de m/z en las cumbres. El espectro MS/MS resultante se muestra en la figura 4. Nota: Algunos espectrómetros de masas están equipados con software de procesamiento de datos capaz para generar el espectro MS/MS. En este caso, exportar los datos espectrales MS/MS no es necesario.</li>
		<li>Asignar los valores de m/z aparece en el espectro MS/MS a las que se muestran en el cuadro 1 para identificar el correspondiente B - y Y-iones. Por ejemplo, el pico en el 580 de m/z se identifica como B4-ion y m/z 685 es identificado como el Y5-ion. Etiqueta los picos con los símbolos B y Y correspondientes en el espectro, como se muestra en la figura 4.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+submonomer+synthesis+of+peptoid+Polymers+and+their+self-assembly+into+highly-ordered+nanosheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Visualized+Exp%22%5BJournal%5D)">Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets.</a> J. Visualized Exp. (57), e3373(2011).</li>
<li>Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Method+for+the+Synthesis+of+Peptoids+with+Mixed+Lysine-type%2FArginine-type+Monomers+and+Evaluation+of+Their+Anti-leishmanial+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1387380611003071">Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition.</a> Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).</li>
<li>Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Capture+Dissociation+Studies+of+the+Fragmentation+Patterns+of+Doubly+Protonated+and+Mixed+Protonated-Sodiated+Peptoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).</li>
<li>Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragmentation+Patterns+and+Mechanisms+of+Singly+and+Doubly+Protonated+Peptoids+Studied+by+Collision+Induced+Dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un nonamer peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, ha sido sintetizado mediante el protocolo presentado. El aparato de síntesis consiste en un recipiente de polipropileno jeringuilla-como en la reacción de fase sólida y un agitador mecánico. Los reactores están comercialmente disponibles y de bajo costo. Un agitador mecánico es un aparato común en laboratorios de química. Con el uso de un recipiente de reacción similar a la jeringa, soluciones pueden ser arrastradas y empujadas fuera de la nave moviendo man...

Peptoides son una clase de secuencia controlada de polímeros con estructuras de la columna vertebral imitando la estructura de los péptidos. Peptoides pueden ser sintetizados de aminas diversas, que permite peptoides exhibir propiedades altamente ajustables1,2. Peptoides se han utilizado como modelos moleculares para la investigación biofísica, considerados como agentes terapéuticos y diseñado como ligandos para proteínas3,4,5,6. Peptoides se han desarrollado en una variedad de compuestos biológicamente activos, como los materiales anti-fouling y anticuerpo miméticos, agentes antimicrobianos y enzima inhibidores7,8,9. Con una naturaleza altamente ordenada y armoniosa, peptoides han también sido considerados como un tipo de almacenamiento de información molecular10. El descubrimiento de estas llamadas de diversas aplicaciones para el desarrollo de eficientes métodos analíticos para caracterizar la secuencia y estructura de peptoides. Técnicas basadas en espectrometría de masa Tandem han demostrado promesa como el método de elección para el análisis de las propiedades de la secuencia de polímeros de secuencia controlada, incluyendo peptoides11,12,13, 14,15. Sin embargo, estudios sistemáticos de la correlación de los patrones de fragmentación de iones peptoid resultantes de estudios de espectrometría de masas y la información estructural de peptoides son muy limitadas.
Peptoides pueden sintetizarse fácilmente utilizando un método de fase sólida. El método desarrollado consiste en una iteración de un proceso de dos pasos monómero además ciclo16,17. En cada ciclo además, una amina resina es acetilada por un ácido Haloacético (típicamente Ácido bromoacético, BMA), y esto es seguido por una reacción de desplazamiento con una amina primaria. Aunque han aplicado rutinariamente protocolos de síntesis automatizada para peptoid síntesis, peptoides pueden sintetizarse manualmente con excelentes rendimientos en una química estándar laboratorio16,18,19, 20.
Nuestro laboratorio ha adoptado el método de síntesis de peptoid manual y simplificado del aparato utilizado en los métodos existentes. Anteriormente hemos estudiado los patrones de fragmentación de una serie de peptoides usando MS/MS técnicas21,22,23. Nuestros resultados muestran que peptoides producen fragmentaciones característica cuando se someten a disociación colisión-inducida (CID)21,23 o22 experimentos de disociación (ECD) de captura de electrón. En este artículo se demuestra cómo oligo-peptoides pueden sintetizarse en un laboratorio de química estándar, cómo realizar los experimentos de CID utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo y cómo analizar los datos espectrales. El peptoid a ser sintetizado y caracterizado es un nonamer con acetilación N-terminal y c-terminal amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. La estructura de la peptoid se muestra en la figura 1.

<table><tbody><tr><td>ESI-espectrómetro de masas triple cuadrupolar, Varian 320L</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td></td><td>El espectrómetro de masas fue adquirido de Varian, Inc.</td></tr><tr><td>Varian MS Workstation, versión 6.9.2, un software de adquisición y revisión de datos</td><td>Varian Inc.</td><td></td><td>El software forma parte del paquete Varian 320L</td></tr><tr><td>Agitador de muñeca Burrell Scientific Shaker, Modelo 75 DD</td><td>Fisher Scientific International Inc.</td><td>14-400-126</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Hermle, Modelo Z 206 A</td><td>Hermle Labortechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaso de reacción en fase sólida, 10 mL</td><td>Torviq</td><td>SF-1000</td><td></td></tr><tr><td>Condensadores de presión para recipientes de reacción</td><td>Torviq</td><td>PC-SF</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de jeringuilla, tamaño de poro 0,2 y mu; m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3B</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de jeringuilla, tamaño de poro 0,45 y mu; m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3A</td><td></td></tr><tr><td>Remolcadores de centrifugadora de polipropileno, 50 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-626</td><td></td></tr><tr><td>Remolcadores de centrifugadora de polipropileno, 15 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-620</td><td></td></tr><tr><td>ChemBioDraw, Ultra, versión 12.0</td><td>CambridgeSoft Corporation</td><td></td><td>CambridgeSoft forma ahora parte de PerkinElmer Inc.</td></tr><tr><td>Vaso de poliestireno, 12 oz</td><td>Supermercado Común</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resina amida de pista</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>10619</td><td></td></tr><tr><td>Piperidina</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>02351</td><td>Altamente tóxico</td></tr><tr><td>N, N'-diisopropilcarbodiimida</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00110</td><td>Altamente tóxico</td></tr><tr><td>Ácido bromoacético</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>26843</td><td>Altamente tóxico</td></tr><tr><td>2-Feniletilamina</td><td>VWR International, LLC.</td><td>EM8.07334.0250</td><td></td></tr><tr><td>2-Metioxietilamina</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>241067</td><td></td></tr><tr><td>N-Boc-etilenodiamina</td><td>VWR International, LLC.</td><td>AAAL19947-06</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido acético</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>252845</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimetilformamida</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1117-4LG</td><td>Destilación adicional antes de su uso</td></tr><tr><td>N, N-diisopropiletilamina</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00141</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropilsilano</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>01966</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00289</td><td>Altamente tóxico</td></tr><tr><td>Sistema Académico de Purificación de Agua Millipore MILLI-Q</td><td>Millipore Corporation</td><td>ZMQP60001</td><td>Para generar agua de grado HPLC</td></tr><tr><td>Agua de grado HPLC</td><td></td><td></td><td>Producido por Millipore MILLI-Q&reg; Sistema Académico de Purificación de Agua</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339USP/NF</td><td>Grado HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Fisher Scientific International, Inc.</td><td>A998-4</td><td>Grado HPLC</td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1121-19L</td><td>Destilación adicional antes de su uso</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1113-19L</td><td>Destilación adicional antes de su uso</td></tr><tr><td>Gas nitrógeno</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>NIT 50-C-F</td><td>Ultra alta pureza, 99,9995%</td></tr><tr><td>Gas argón</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>ARG 50-C-F</td><td>Ultra alta pureza, 99,9995%</td></tr></tbody></table>

síntesis y análisis de espectrometría de masas de peptoides oligo

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoides son oligómeros de péptido imitando secuencia controlado que consta de unidades de N-alquilados glicina. Entre muchas aplicaciones potenciales, peptoides han pensado de como un tipo de almacenamiento de información molecular. Análisis de espectrometría de masas se ha considerado el método de elección para la secuencia peptoides. Peptoides pueden ser sintetizados vía química de fase sólida usando un ciclo de reacción de dos pasos repetidos. Aquí presentamos un método para sintetizar manualmente oligo-peptoides y analizar la secuencia de peptoides mediante técnicas de espectrometría de masas (MS/MS) de tándem. La peptoid de la muestra es un nonamer consisten en alternar N-(2-methyloxyethyl) glicina (Nme) y N-(2-FENILETILO) glicina (Npe), así como una N-(2-aminoetil) glicina (Nae) a N-terminal. La fórmula de la secuencia de la peptoid es Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, donde Ac es el grupo acetilo. La síntesis tiene lugar en un recipiente de la reacción de fase sólida disponible en el mercado. La resina amida de pista se utiliza como soporte sólido para la peptoid con un grupo amida en el c-término. El producto resultante de la peptoid se somete a análisis de la secuencia usando un espectrómetro de masas triple cuadrupolo acoplado a una fuente de ionización por electrospray. La medida MS/MS produce un espectro de iones fragmento resultante de la disociación de peptoid cargado. Los iones fragmento se clasifican hacia fuera basado en los valores de su relación masa / carga (m/z). Los valores de m/z de los iones del fragmento se comparan con las masas nominales de iones fragmento teóricamente predicho, según el esquema de fragmentación de peptoid. El análisis genera un patrón de fragmentación de la peptoid cargada. El patrón de fragmentación está correlacionado con la secuencia de monómeros de peptoid neutro. En este sentido, el análisis por MS lee la información de la secuencia de la peptoides.

La estructura de un peptoid 9-mer con la acetilación N-terminal, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, se muestra en la figura 1. El peptoid fue sintetizado manualmente en un recipiente de la reacción de polipropileno sinterizado vía fase sólida. Pista amida resina (0,047 mmol, mg 84 con una carga de 0,56 mmol/g) es utilizado como soporte sólido para el peptoid con un amidated c-término. La cadena peptoid está construida por varios ciclos de la adición...

Un protocolo se describe para la manual síntesis de oligo-peptoides seguido por análisis de la secuencia por espectrometría de masas.

Síntesis y análisis de espectrometría de masas de peptoides Oligo

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo sintetizar manualmente oligo-peptoides y cómo analizar su secuencia de monómeros mediante técnicas de espectrometría de masas. El método puede ayudar a los principiantes a responder preguntas clave en un campo peptoideo, como cómo fabricar peptóides y cómo caracterizar su secuencia de monómeros. La principal ventaja de esta técnica es que los peptoides con residuos monómeros especiales pueden sintetizarse y analizarse en el laboratorio estándar de química analítica.Aunque este método se centra en oligo-peptoides, también puede aplicarse a otros sistemas como péptidos y oligonucleótidos. Generalmente, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque lograr condiciones óptimas de espectrometría de masas es difícil sin demostración visual. Tuvimos la idea de este método cuando queríamos caracterizar las características estructurales de los peptoides mediante métodos de espectrometría de masas en tándem.Primero pesa 84 miligramos de resina amida de Rink y añádela a un recipiente de reacción de 10 mililitros de polipropileno en fase sólida. Luego inserta un émbolo en el recipiente. A continuación, añade dos milil

synthesis-and-mass-spectrometry-analysis-of-oligo-peptoids

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Una manera rápida se describe para obtener información sobre la estructura de los polisacáridos en una matriz extracelular. El método tiene la ventaja de la especificidad de glycosylhydrolases y la sensibilidad de la espectrometría de masas permite pequeñas cantidades de materiales para ser analizados. Esta técnica se puede adaptar para utilizarse directamente sobre el tejido en sí.

Oligo perfiles Misa (OLIMP) de polisacáridos extracelulares

Normas de isótopos estables y de captura de anticuerpos anti-péptido (SISCAPA) enriquecimiento de las parejas de afinidad de los péptidos con una dilución de isótopos estables de espectrometría de masas (MRM-MS) para proporcionar una medición cuantitativa de los péptidos como sustitutos de sus respectivas proteínas. A continuación se describe el protocolo de uso de partículas magnéticas en un formato parcialmente automatizado.

La cuantificación de proteínas mediante el enriquecimiento de inmunoafinidad péptido acoplado a espectrometría de masas

Un simple y general método manual peptoide síntesis referida a un equipo y reactivos básicos, disponibles en el mercado se perfila, lo que permite peptoides para ser fácilmente sintetizada en la mayoría de los laboratorios. La síntesis, purificación y caracterización de un 36mer peptoide anfifílicas se describe, así como su auto-ensamblaje en muy ordenada nanoláminas.

En fase sólida Submonomer Síntesis de Polímeros peptoide y su auto-ensamblaje en altamente ordenadas nanoláminas

Amidas terciarias péptido (PTA) son una superfamilia de peptidomiméticos que incluyen pero no se limitan a péptidos, peptoides y péptidos N-metilado. Aquí se describe un método de síntesis que combina estrategias de sub-monómero división y piscina y para sintetizar un solo grano de la biblioteca de un compuesto de las PTA.

Síntesis Split-y-piscina y caracterización del péptido Terciario Amida Biblioteca

Aquí, presentamos protocolos detallados para la espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio amida de estado sólido (ssHDX-MS) y la espectrometría de masas de marcado fotolítico de estado sólido (ssPL-MS) para proteínas en polvos sólidos. Los métodos proporcionan información de alta resolución sobre la conformación de proteínas y las interacciones en el estado sólido amorfo, que puede ser útil en el diseño de formulaciones.

Espectrometría de masas enfoque para estudiar la estructura de la proteína y las interacciones en liofilizadas Polvos

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La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas

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Protocolo para la síntesis en fase sólida de oligómeros de ARN que contiene un 2&#39;-<emO</em&gt; -tiofenilmetilo Modificación y caracterización mediante dicroísmo circular

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Los oligonucleótidos 5′-trifosfatos son componentes ubicuos en vías biológicas esenciales y han visto un uso creciente en aplicaciones biotecnológicas. Aquí, describimos técnicas para la síntesis y purificación rutinaria de oligonucleótidos 5′-trifosfatos, a partir de oligonucleótidos preparados por técnicas de síntesis automatizadas estándar.

Trifosforilación química de oligonucleótidos

Aprenda a sintetizar oligo-peptoides manualmente y analizar su secuencia de monómeros mediante espectrometría de masas. Este protocolo guía a principiantes en química analítica y bioquímica para caracterizar estos polímeros sintéticos.

Síntesis y análisis de espectrometría de masas de peptoides Oligo

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