Síntesis y análisis de espectrometría de masas de peptoides Oligo

Un protocolo se describe para la manual síntesis de oligo-peptoides seguido por análisis de la secuencia por espectrometría de masas.

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo sintetizar manualmente oligopeptoides y cómo analizar su secuencia de monómeros mediante el uso de técnicas de espectrometría de masas. El método puede ayudar a los principiantes a responder preguntas clave en un campo de peptoides, como cómo hacer peptoides y cómo caracterizar su secuencia de monómeros. La principal ventaja de esta técnica es que los peptoides con residuos especiales de monómeros pueden sintetizarse y analizarse en el laboratorio de química analítica estándar.

Aunque este método se centra en los oligopeptoides, también se puede aplicar a otros sistemas como los péptidos y los oligonucleótidos. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque lograr las condiciones óptimas de espectrometría de masas es difícil sin una demostración visual. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando quisimos caracterizar las características estructurales de los peptoides mediante métodos de espectrometría de masas en tándem.

Primero pesa 84 miligramos de resina de rink amida y añádela a un recipiente de reacción en fase sólida de polipropileno de 10 mililitros. A continuación, inserte un émbolo en el recipiente. Después de esto, agregue dos mililitros de TMF al recipiente de reacción y tape el recipiente con una tapa de presión.

Agite el recipiente en un agitador a temperatura ambiente en un ángulo de movimiento de aproximadamente 12 grados y 385 oscilaciones por minuto durante 30 minutos. Después de quitar la tapa, drene la solución a un contenedor de desechos empujando el émbolo del recipiente de reacción. Agregue dos mililitros de piperidina al 20% en DMF al recipiente y tape el recipiente.

Después de agitar el recipiente durante dos minutos, drene la solución al contenedor de desechos. Repita el procedimiento, agregue dos mililitros de solución de DMF al 20% de Pep al recipiente y tape el recipiente. Agite en la coctelera durante 12 minutos y drene la solución al contenedor de residuos.

Después de lavar la resina, realice una reacción de acetilación de bromo, mezclando un mililitro de ácido bromoacético 0,8 molar en DMF y un mililitro de DIC 0,8 molar en DMF en un vaso de precipitados. Transfiera la mezcla al recipiente de reacción que contiene la resina y tape el recipiente. Agite el recipiente en la coctelera a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Después de la agitación, drene la solución al contenedor de desechos. Después de lavar la resina, realice una reacción de desplazamiento pero agregando un mililitro de un molar 2 metoxietilamina en DMF al recipiente. Después de tapar el recipiente, agítelo a temperatura ambiente durante 60 minutos.

A continuación, drene la solución en el contenedor de residuos. Una vez que se completen los ciclos de adición de monómeros, mezcle 92 microlitros de anhídrido acético, 43,5 microlitros de DIPEA y dos mililitros de DMF en un vaso de precipitados para hacer el cóctel de acetilación. Añadir el cóctel de acetilación al recipiente que contiene la resina.

Después de tapar el recipiente, agítelo a temperatura ambiente durante 60 minutos. Cuando termine, drene la solución al contenedor de desechos. Después de lavar la resina con DCM, mezcle 3,8 mililitros de TFA, 100 microlitros de triisopropilsilano y 100 microlitros de agua de grado HPLC en un vaso de precipitados para hacer el cóctel de escisión.

Agregue el cóctel de escisión inmediatamente al recipiente que contiene la resina. Después de agitar el recipiente a temperatura ambiente durante dos horas, retire la tapa y recoja la solución filtrada en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros. Agregue un mililitro de TFA al recipiente y táplelo.

Después de agitar durante un minuto, recoja la solución filtrada en el mismo tubo de centrífuga. A continuación, evapore el TFA con un suave chorro de gas nitrógeno hasta que quede aproximadamente un mililitro de solución viscosa. Agregue 15 mililitros de éter dietílico a la solución viscosa y tape el tubo de centrífuga.

Incube la mezcla en un congelador a menos 20 grados centígrados durante al menos dos horas para obtener un precipitado sólido blanco. Después de la incubación, mientras se mantiene el tubo de centrífuga frío, granule el sólido con una centrífuga a 4427 veces G durante 10 minutos. Cuando termine, retire la tapa del tubo y decante cuidadosamente el éter dietílico en un vaso de precipitados.

Después de lavar el sólido con éter dietílico, séquelo con un suave chorro de gas nitrógeno. A continuación, agregue 10 mililitros de agua de grado HPLC para disolver el sólido seco. Pase la solución a través de un filtro de jeringa de nailon con un tamaño de puerto de 0,45 micras y recoja el filtrado en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros previamente pesado.

Congele la solución peptoide girando el tubo de centrífuga en una taza de poliestireno expandido doble apilada de 12 onzas, que contiene nitrógeno líquido. A continuación, liofilizar la solución congelada durante la noche para producir el peptoide sólido. Después de preparar la solución de muestra peptoide para el análisis de MS, elimine las posibles partículas insolubles en la solución diluida, realizando la centrifugación a 4427 veces G durante tres minutos.

Transfiera alrededor de 700 microlitros de la parte superior de la solución a otro tubo de centrífuga de 1,5 mililitros para hacer la solución de trabajo peptoide MS con una concentración de aproximadamente 10 a menos cinco molares. Una vez que se hayan establecido los parámetros del instrumento MS, agregue aproximadamente 300 microlitros de la solución de trabajo peptoide MS en una jeringa de un mililitro. Y conecte la jeringa a la entrada ESI mediante un tubo capilar de polieteretercetona.

A continuación, coloque la jeringa debajo de la bomba de jeringa y ajuste el caudal a 10 microlitros por minuto para infundir la solución de muestra en la entrada de ESI. Encienda el voltaje de la aguja ESI para activar el proceso ESI y luego encienda el detector. Configure la pantalla en modo de perfil y el rango de la relación de carga maestra o M / Z de 100 a 1500.

Vea el espectro de masas del perfil que se muestra en la ventana del perfil. En la ventana del método, utilice dos minutos como tiempo de ejecución. A continuación, abra la ventana de grabación, rellene un nombre de archivo propio y comience a grabar el espectro.

Optimice la intensidad del pico del peptoide proteinado en M/Z 1265. Establezca el rango M / Z de 1150 a 1350 y ajuste el voltaje capilar mientras visualiza la intensidad máxima en milivoltios que se muestra en la ventana del perfil. Ahora cambie el instrumento al modo MSMS en la ventana de métodos, use 1265 como la primera masa Q1 y deje en blanco la última masa Q1.

Use 100 como la primera masa Q3 y 1400 como la última masa Q3. A continuación, encienda el gas CID. Después de esto, configure la energía de colisión a 45 voltios.

Y la presión del gas de colisión a 1,5 militorr. Vea el espectro de masas del perfil que se muestra en la ventana de perfil observando el pico del ion peptídico en M/Z 1265 y los picos con valores M/Z más bajos que representan los iones fragmentados del ion peptoide precursor. Ahora ajuste la energía de colisión y la presión del gas de colisión para optimizar la visualización del espectro de fragmentación.

En la ventana del método, utilice dos minutos como tiempo de ejecución. A continuación, abra la ventana de grabación, introduzca un nombre de archivo adecuado y comience a grabar el espectro. Aquí se muestra la estructura del peptoide nonámero sintetizado con acetilación n terminal.

Aquí se muestra el esquema de fragmentación predicho para el peptoide, donde el protón en el círculo discontinuo indica el protón móvil que induciría la fragmentación del peptoide durante el experimento CID. Si se produce la fragmentación en todos los enlaces amida disponibles, se formarían un total de ocho fragmentos n-terminales y ocho fragmentos C-terminales. A modo de ejemplo, aquí se muestran las estructuras y los valores de carga maestra correspondientes del ion B4 y el ion Y5.

Aquí se enumeran los valores de carga maestra calculados de todos los iones de fragmento de V1 a V8 y de Y1 a Y8. El espectro de masa de barrido completo del ion peptoide proteinado muestra un pico en M/Z 1265 correspondiente a las especies proteinadas y un pico en M/Z 1287 correspondiente a la adaptación del ion sodio del peptoide. Los dos picos en M/Z 633 y 644 corresponden a peptoides sodiados doblemente proteinados y mixtos proteinados, respectivamente.

El espectro MSMS del peptoide proteinado muestra un pico en M/Z 1265 correspondiente a las especies proteinadas y picos en los valores de masa más baja para cargar correspondientes a los iones fragmentados del ion peptoide. Una vez dominada, la técnica de síntesis se puede hacer en uno o dos días y la técnica de espectrometría de masas se puede hacer en una o dos horas, si se realizan correctamente. Al intentar el procedimiento de espectrometría de masas, es importante verificar el rendimiento del instrumento.

Si es necesario, se puede realizar una afinación automática del instrumento. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el modelado de la leche, para responder a preguntas adicionales, como qué posibles confirmaciones podría adaptar un peptoide. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran la técnica avanzada de espectrometría de masas y la caracterización estructural.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar peptoides manualmente y cómo analizar una secuencia de monómeros mediante técnicas de espectrometría de masas. No olvide que trabajar con productos químicos puede ser extremadamente peligroso y siempre se debe usar equipo de protección personal mientras se realiza este procedimiento.