Name: Establecimiento de un pH extracelular ácido sistema de cultivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprenda a establecer un sistema de cultivo extracelular con pH ácido para estudiar la malignidad tumoral y la progresión del cáncer. Este método estable permite comparar múltiples medios ácidos.

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Agradecemos a los miembros de la división de Ciencias de genoma y laboratorio para Biología de sistemas y medicina, RCAST, la Universidad de Tokio. Agradecemos especialmente al Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, la Universidad de Tokio), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida y Dr. A. Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) para discusiones útiles y apoyo. Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones para joven científico (A) (26710005, T.O.), subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (26116711 y 16 H 01567, T.O.) y subvenciones para difíciles Investigación exploratoria (16K 14605, T.O.) desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología de Japón, la Fundación de ciencia de Takeda (T.O.), la Fundación de Kobayashi de investigación del cáncer (T.O.) y el proyecto de investigación del cáncer y Evolución terapéutica (P-crear) y la investigación práctica para el Control del cáncer innovadoras de Japón Agencia de investigación médica y desarrollo, AMED (T.O.).

1. preparación de medio de cultivo ácidos
<ol><li>
Preparación de control (pH 7.4) y de medio de cultivo de pH bajo (pH 6.8)
	<ol>
<li>Disolver 4,75 g de polvo DMEM sin L-glutamina en 500 mL de agua.</li>
		<li>Preparar 0,33 M NaHCO3 solución en una botella de presión-apretado. PRECAUCIÓN: Es importante utilizar una botella de presión apretado ya que NaHCO3 emite CO2 gas cuando se calienta y se descompone térmicamente.</li>
		<li>Autoclave el medio y la solución. Permitir estos búferes enfriar a 25 ° C.</li>
		<li>Añadir 5 mL de 200 mM L-glutamina, 5 mL de penicilina-estreptomicina y 50 mL de suero fetal bovino a 500 mL de DMEM sin bicarbonato.</li>
		<li>Por medio de control (pH 7.4), agregar 2,4 mL de solución de 0,33 M NaHCO3 por cada 100 mL de DMEM sin bicarbonato. Por medio de pH bajo (pH 6.8), Añadir 0.6 mL de solución de 0,33 M NaHCO3 por cada 100 mL de DMEM sin bicarbonato.</li>
		<li>Comprobar el pH del medio después de 24 h de incubación a 37 ° C debajo del 5% CO2. Nota: La cantidad de solución de NaHCO3 debe ajustarse según el pH del medio, que puede variar dependiendo del contenido de CO2 de la incubadora y la presión de aire. Idealmente, por primera vez, es mejor medir el pH del medio con diferentes concentraciones de bicarbonato para determinar la cantidad apropiada de solución de NaHCO3 añadir a DMEM.<ol>
<li>Recoge el medio de cultivo inmediatamente después de retirar la placa de cultivo de la incubadora de CO2 y medir el pH usando un pH-metro. Mantenga la temperatura a 37 ° C utilizando un baño de agua si es necesario. Medir el pH del medio tres veces independientemente. Nota: Solución de NaHCO3 debe almacenarse a 4 ° C y cada medio debe ser recién preparado. Productos disponibles comercialmente que pueden ser utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de materiales.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de medio de cultivo ácido inducidas por lactato o inducida por el ácido clorhídrico
	<ol>
<li>Añadir 74 μl de solución de lactato o 125 μl de 1 M de HCl a 100 mL de medio control (preparado en el paso 1.1.5).</li>
		<li>Comprobar el pH del medio después de 24 h de incubación a 37 ° C debajo del 5% CO2. Nota: La cantidad de lactato o solución de ácido clorhídrico también tiene que ser ajustado según el pH del medio, que puede variar dependiendo del contenido de CO2 en la incubadora y la presión de aire. Idealmente, es mejor medir el pH del medio con lactato serial o concentraciones de HCl para determinar la cantidad apropiada para ajustar al pH deseado del medio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. recolección y tratamiento de las células
<ol><li>Empezar a cultivar las células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 por lo menos 1 semana antes de realizar experimentos. Nota: Las líneas celulares utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla de materiales.</li>
	<li>Células de paso al llegar a 70-90% de confluencia. No permita que las células a convertirse en confluentes. Cambiar el medio cada 2-3 días durante el cultivo diario.</li>
	<li>Lavar las células añadiendo 5 mL de PBS. Aspire el PBS y añadir enzima desprendimiento como 1 mL de tripsina.</li>
	<li>Incubar a 37 ° C hasta que las células se redondean y empiezan a separar.</li>
	<li>Añadir 5 mL de medio de cultivo para las células separadas y desactivar la enzima. Transferir la suspensión de células a un tubo de 15 mL y centrifugar durante 3 min a 300 x g. aspirar el sobrenadante y resuspender las células con medio de cultivo.</li>
	<li>Contar las células viables usando un hemocitómetro y azul de tripano.</li>
	<li>Semilla 5.0 x 105 células/pocillo de un plato de 10 cm en 10 mL de medio. Incube las células durante 24 h a 37 ° C debajo del 5% CO2.</li>
	<li>Aspirar el medio de cultivo, lavar las células con PBS de 5 mL y añadir 10 mL del ácido de medio de cultivo preparado en la sección 1. Incube las células durante 24 h a 37 ° C debajo del 5% CO2.</li>
</ol>3. aislamiento de RNA
<ol><li>Medio de cultivo de aspirar y lavar las células con 5 mL de PBS. Romper las células mediante la adición de reactivo de extracción de RNA (véase Tablas de materiales).</li>
	<li>Raspar el plato brevemente, luego retire el reactivo de extracción de RNA con una pipeta y depositar la RNA extracción reactivo/célula lisada en un tubo de 1,5 mL. Dejar a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
	<li>Añadir cloroformo μl 250 y agitar el tubo vigorosamente para unos 15 s. deje a temperatura ambiente durante 5 minutos y centrifugar a ≥8, 000 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Cuidadosamente Remueva la fase acuosa mediante una pipeta. Dejar detrás de algunas de la fase acuosa. Colocar en otro tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Añadir 550 de μl isopropanol para la fase acuosa y mezclar suavemente. Dejar a temperatura ambiente durante 5 minutos centrifugar a máxima velocidad (≥ 20, 000 x g) durante 20 min a 4 ° C.</li>
	<li>Quite el isopropanol y añadir 1 mL 75% de etanol en DEPC agua tratada. Mezclar suavemente. Centrifugue a 8.000 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Pipeta el etanol y dejar que secar al aire las pelotillas.</li>
	<li>Agregar que aproximadamente 15-25 μl (dependiendo de la producción) de DEPC agua tratada para el pellet de RNA. Mezclar bien.</li>
	<li>Medir la concentración de RNA aislado mediante la medición de OD en el 260 nm usando un espectrofotómetro.</li>
</ol>4. síntesis de cDNA
<ol><li>Combinar los siguientes componentes en un tubo de reacción de PCR: hasta 5 μg de ARN total, 1 μl de Oligo dT (50 μm) o mezcla al azar de cartilla (60 μm), 1 μl 10 mM dNTP y agua libre de nucleasas hasta un volumen total de 14 μl.</li>
	<li>Mezclar y centrifugar brevemente los componentes utilizando una centrífuga de sobremesa pequeño (~ 5 s). Desnaturalice la muestra cartilla de RNA durante 5 min a 65 ° C. Girar brevemente (~ 5 s) utilizando una mesa pequeña centrífuga y poner la muestra inmediatamente en hielo durante al menos 1 minuto.</li>
	<li>Añadir los siguientes componentes: 4 μL 5 x buffer de transcripción inversa, 1 μl de transcriptasa reversa (200 U/μL), 1 μl de inhibidor de la Rnasa (40 U/μL). Nota: Ejemplos de kits disponibles en el mercado se muestran en la Tabla de materiales
</li>
	<li>Cerrar el tubo, mezclar y luego centrifugar brevemente el contenido utilizando una centrífuga de sobremesa pequeño (~ 5 s). Incubar la mezcla de reacción combinado a 50-55 ° C durante 10 minutos.</li>
	<li>Inactivar la reacción por la incubación a 80 ° C durante 10 minutos.</li>
</ol>5. medición de ácido-responsivo genes mediante PCR en tiempo real
<ol><li>Combinar los siguientes componentes en una placa de 384 pocillos de reacción: 1 μl plantilla cDNA, 0,75 μl de 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0,3 μl 50 μm hacia adelante cartilla, 0,3 μl 50 μm inversa primer, 1 μl Taq polimerasa, 2,5 μl 10 x buffer de Taq polimerasa, 2,5 μl 20 mM dNTP, 16.65 μl de agua. Nota: Ejemplo de kits disponibles en el mercado se muestran en la Tabla de materiales. En la tabla 1se muestra una lista de los primers. Una placa de 96 pocillos de reacción puede ser también utilizada en esta etapa. También pueden utilizarse otros sondeos (por ejemplo, sonda Taqman).</li>
	<li>Configurar el experimento y el siguiente programa PCR en un sistema de PCR en tiempo real: 50 ° C por 2 min, 1 ciclo; 95 ° C durante 10 min, 1 ciclo; 95 ° C por 15 s y 60 ° C por 1 min, 40 ciclos; 95 ° C por 15 s, 1 ciclo; 60 ° C durante 15 s, 1 ciclo; 95 ° C por 15 s, 1 ciclo.</li>
	<li>Colocar la placa en el instrumento de la qPCR. Inicie el programa. Nota: IDI1 , Upregulation de los genes sensibles pH MSMO1y INSIG1pueden medirse por los niveles de proteína.</li>
</ol>

<ol><li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cancer+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li>
<li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li>
<li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+metabolism%3A+Warburg+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li>
<li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue%3A+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li>
<li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+pH%3A+a+perfect+storm+for+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li>
<li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Why do cancers have high aerobic glycolysis?</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li>
<li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li>
<li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752(2015).</li>
<li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li>
<li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293(2008).</li>
<li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li>
</ol>

El autor Ayano Kondo es un empleado de Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.

Aquí, describimos un sistema de cultivo simple pH ácido y su proceso de evaluación. La combinación de tres métodos de acidificación del medio, es decir, concentración de bicarbonato menor, adición de lactato y adición de HCl, nos permitió investigar el mecanismo de respuesta de pH fondo y comparar la respuesta celular a otro tumor microambiental condiciones como hipoxia o alimento del hambre.
La clave de este método es determinar las concentraciones apropiadas de ácido clorhídrico, bi...

El microambiente tumoral juega un papel crítico en la progresión del tumor y cáncer de la célula metabolismo1,2,3. Las células cancerosas a menudo se exponen a condiciones como hipoxia, la privación de nutrientes y pH extracelular ácido (pHe). Sin embargo, el papel de pHe en la progresión tumoral no ha aclarado tan extensivamente como en hambre hipoxia o nutrientes. El pHe en el tejido del tumor puede ser ácida, llegando a aproximadamente pH 6.84,5. El pH ácido se presenta de aeróbica y anaeróbica glicolítica excreción de protones (H+) y lactato por la proliferación del cáncer las células5,6.
Estudios recientes revelaron que histona ácida inducida por pHe desacetilación y oxidación del ácido graso exocitosis de lisosomas ácidas para la adaptación al ambiente ácido fuerte7,8,9,10. Sin embargo, los mecanismos a través de la cual acidificación extracelular afecta comportamiento de cáncer y la identidad de clave de los reguladores en el microambiente tumoral de pH ácido no han sido completamente determinados. Además, varios informes describen varios medios de pH ácido, usando claro concentraciones de bicarbonato, tampón Tris, tubos y HEPES o lactato y ácido clorhídrico, pero hay pocos informes para demostrar la estabilidad de la ajustada media ni integral comparación de varios medios de cultivo ácidos distintos7,8,9,10
Para aclarar los principales reguladores y cambios metabólicos en las células cancerosas en el contexto de acidificación extracelular, estableció un modelo de cultura simple en vitro para mantener un pHe ácido y examinó el papel de pHe en células de cáncer11. Usando este método, mantuvimos un ácido medio de cultivo con un pHe de 6,8 a 37 ° C debajo del 5% CO2, usando las concentraciones de bicarbonato menor en el medio de cultivo. pH 7.4 se utilizó como normal y medio de control. El pH del medio fue sostenido durante al menos 24 h y poco a poco disminuyó en 72 h en cultivo de células de cáncer de páncreas 1 PANC y AsPC-1. Porque glicólisis mejorada acelera la excreción de protones, pero también lactato7,8,9, también estableció un método de cultura mímico acidosis inducida de lactato por la adición de lactato en lugar de reducir la concentración de bicarbonato. Además, inducida por el ácido clorhídrico ácido pHe en el medio nos permite excluir la posibilidad de que las respuestas celulares a pH ácido medio de cultivo no son debido a una disminución de la concentración de bicarbonato. Por otra parte, utilizando distintos medios con un pH de 6.4 a 7.4 con concentración diferente de bicarbonato, podemos evaluar la extensión de efectos de pHe en respuestas celulares.

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes>reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco" Nissui" 2</td><td>Nissui</td><td>05919</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>Solución de L-glutamina</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Solución mixta de penicilina-estreptomicina (estabilizada)</td><td>Nacalai</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>0,5 g / l-tripsina / 0,53 mmol / l-EDTA solución, con rojo de fenol</td><td>Nacalai</td><td>32778-05</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tinción de azul de tripano al 0,5%</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>Solución de ácido láctico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252476</td><td></td></tr><tr><td>Solución de ácido clorhídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Sistema de síntesis de primera cadena</td><td>Thermo Fisher</td><td>18091</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla maestra de PCR verde SYBR de potencia&nbsp;</td><td>Biosistemas Aplicados</td><td>4368702&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Líneas celulares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>AsPC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr><tr><td>KMS-6</td><td>Banco de células JCRB</td><td></td><td></td>JCRB0432</tr><tr><td>TIG</td><td>JCRB Banco</td><td></td><td></td>de Células</tr><tr><td>MRC9</td><td>ATCC</td><td>CCL-212</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen con Wi-Fi</td> Sistema de PCR en tiempo real <td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 5</td><td>Thermo Fisher</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento de un ph extracelular ácido sistema de cultivo

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Condiciones del microambiente tumoral, tales como hipoxia o nutrientes hambre, juegan un papel crítico en la progresión del cáncer y la malignidad. Sin embargo, el papel del pH extracelular ácido en la agresividad del tumor y su mecanismo subyacente no ha sido extensivamente estudiado en comparación con las condiciones de hambre hipóxico o nutrientes. Además, un método de cultivo bien definidas para imitar el microambiente tumoral extracelular ácido no se ha completamente divulgado.
Aquí presentamos un método de cultivo simple en vitro para mantener el pH extracelular ácido utilizando reducción bicarbonato y lactato aumento o concentración de HCl en el medio de cultivo. El pH del medio fue sostenido durante al menos 24 h y poco a poco disminuyó en 72 h después de cultivo de células de cáncer de páncreas 1 PANC y AsPC-1. Tres condiciones de distintos medios ácidos en este estudio muy upregulated genes pH-sensibles tales como MSMO1, INSIG1y IDI1 compararon con hipoxia o hambre de nutrientes. La regulación al alza de estos genes puede utilizarse como marcador de pH ácido. Estas técnicas sencillas son beneficiosas para dilucidar los mecanismos subyacentes de la malignidad del tumor en el microambiente tumoral ácidos. Por lo tanto, nuestro sistema de cultura extracelular pH ácido permite descubrimiento de respuestas celulares de pH ácido en las células cancerosas, pero también en células primarias, como las células tubulares renales, en relación con los otros ácidos trastornos incluyendo, cetoacidosis diabética, acidosis láctica, la acidosis tubular renal y acidosis respiratoria.

Para determinar la concentración adecuada de bicarbonato, preparamos DMEM en el rango de 0 - 8 mM NaHCO3 (concentración final en el medio de cultivo) y tuvo éxito en la preparación de medios de cultivo con pH entre 6.4-7.4 (figura 1). Preparamos DMEM con 8 mM NaHCO3 (pH 7.4) como medio de control y 2 mM NaHCO3 (pH 6.8) como un medio con pH ácido, según un informe anterior indicando que el pH extracelular llegue a pH 6.8 para t...

El microambiente tumoral ácida juega un papel crítico en la progresión tumoral. Para evaluar los efectos del pH extracelular ácido en las células de cáncer in vitro, hemos establecido sistemas de cultivo ácidos simples.

Establecimiento de un pH extracelular ácido sistema de cultivo

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

El objetivo general de este sencillo método de cultivo in vitro es dilucidar los mecanismos subyacentes de la malignidad tumoral en un microambiente tumoral ácido. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología tumoral, como el mecanismo subyacente de la progresión del cáncer y la malignidad en respuesta al microambiente tumoral. Las principales ventajas de esta técnica son la estabilidad del pH del medio y la capacidad de comparar varios medios de pH ácido.La implicación de esta técnica se extendió a la terapia no solo del cáncer, sino también de los trastornos ácidos, ya que la acidosis puede estar asociada con varios tipos de enfermedad. Para empezar, disuelve 4,75 gramos de DMEM power con L-glutamina en 500 mililitros de agua. También prepare una solución de bicarbonato de sodio de 0,33 molares en una botella hermética.Esterilizar en autoclave el medio y la solución. Después de dejar que estos tampones se enfríen a 25 grados centígrados, agregue cinco mililitros de L-glutamina de 200 milimolares, cinco mililitros de penicilina-estreptomicina y 50 mililitros de suero fetal bovino a 500 mililitros de DMEM sin bicarbonato. Para un medio de control,

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