Name: Inmuno-fluorescente etiquetado de microtúbulos y proteínas centrosómicas en tejido Intestinal Ex Vivo y 3D In Vitro Intestinal organitas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprende a fijar e inmunomarcar microtúbulos y proteínas centrosómicas en organoides intestinales 3D y tejido ex vivo. Este protocolo preserva la arquitectura tridimensional y la antigenicidad para estudios de biología celular.

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Los autores agradecen a Paul Thomas de microscopio asesoramiento y asistencia. Este trabajo trata fue financiado por el BBSRC (subsidio no. BB/J009040/1 a M.M.M. y T.W.).

<ol><li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li>
<li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li>
<li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-organizing+centers%3A+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+self-renewal%2C+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li>
<li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Colorectal+Cancer+Rep%22%5BJournal%5D)">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+conditional+and+reversible+gene+knockouts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.</a> Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li>
<li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042(2015).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765(2014).</li>
<li>Coquelle, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIS1%2C+CLIP-170%27s+key+to+the+dynein%2Fdynactin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway.</a> Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).</li>
<li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li>
<li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Physiol+Educ%22%5BJournal%5D)">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li>
</ol>

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Aislamiento del tejido intestinal Aislamiento de pequeñas criptas intestinales, las vellosidades y criptas colónicas consiste en exponer la superficie de la mucosa, el tratamiento con solución de EDTA para aflojar la centrifugación, fraccionamiento (temblor) y contacto. Se ha modificado el protocolo de aislamiento intestinal presentan vellosidad/cripta de Belshaw et al. y Whitehead et al. 17 , 18
Exponer la superficie de la mucosa Hemos experimentado con un número de enfoques para exponer la superficie mucosa del tracto intestinal en el desarrollo de este procedimiento. Un enfoque clásico es evert (vuelta adentro hacia fuera) el tubo, generalmente en segmentos de aproximadamente 100 mm de largo, con una varilla metálica que está atrapada en un pliegue del tejido en un extremo y luego el tubo restante se deslizó sobre el tubo19. Para el tejido del ratón, una barra de metal (2,4 mm de diámetro) con los extremos redondeados es ideal. Este enfoque tiene la ventaja de ampliar la superficie de la mucosa que permite el acceso a la PBS y EDTA. Al principio utiliza este enfoque pero se trasladó a cortar el tubo de corta longitud (unos 5 cm) y apertura de cada sección con tijeras de disección como esto resultó más fácil. Este enfoque es apropiado si sólo tienen unos intestinos; pero si más animales debían ser utilizados en un experimento entonces un dispositivo especialmente diseñado para corte abierto el tubo longitudinalmente, como se describe por Yoneda et al. 14 sería más eficiente.
Separación de las vellosidades y las criptas de la capa muscular Inicialmente se utilizó EDTA en PBS y tiempos de incubación relativamente largo de hasta 60 min de 3 mM para aflojar la superficie de la mucosa de la subyacente tejido17,18. En esta concentración de EDTA encontramos que un tiempo de incubación de 30 min era suficiente para aflojar las criptas del colon de ratón. Sin embargo, para el aislamiento de cripta/vellosidad del intestino intentamos utilizando EDTA concentrado para un tiempo más corto, que ha demostrado para ser un enfoque eficaz. Se realizó todo el trabajo posterior con el tejido extraído mediante la técnica de EDTA 30 mM generando importantes fracciones de las vellosidades o criptas. Para criptas, normalmente se agruparon fracciones 3-5 antes de fijar, pero es importante verificar si estos son las fracciones adecuadas según los tiempos dependerá de una serie de factores como la posición a lo largo del tracto intestinal, la edad del ratón, la inflamación, la dieta anterior , etc. de manera similar, la longitud del tiempo el tejido necesita ser sacudido tras el tratamiento de EDTA sea eficaz puede variar bajo diferentes condiciones. El resultado es fracciones de tejido aislado que contiene una mezcla de vellosidades y criptas o principalmente las vellosidades o criptas (figura 2). Como en el colon no hay vellosidades, la extracción de la cripta puede ser posible en un solo paso sacudiendo el tejido en tubo de 30 s. Estas fracciones pueden fijarse y procesadas para el inmuno-etiquetado.
Aislamiento de organoides intestinal de matriz de sótano Aislamiento de organoides de sótano matriz cúpulas se logra mediante el uso de solución de recuperación de la célula. La solución trabaja por depolymerizing la matriz gelificada sótano pero el temperatura debe ser entre 2-8 ° C. Una nota de precaución es que los microtúbulos dinámicos no pueden ser preservados. Así, para el inmuno-etiquetado de microtúbulos dinámicos y + consejos como la celda EBs, recuperación de la matriz basal antes de la fijación no es recomendable. Sin embargo, la mayoría de los microtúbulos en las células diferenciadoras del organoide es relativamente estable y estos fueron preservados (figura 6). También trabajó bien para el inmuno-etiquetado de proteínas centrosómicas y Unión como marcadores de la célula.
Protocolos de fijación Formaldehído (recién hecha de PFA) es un fijador de acción relativamente rápida que forma reversible aglutina y 4% PFA funciona bien por ejemplo, en el inmuno-etiquetado microtúbulos y gamma tubulina y filamentos de actina tinción con Phalloidin. Más diluído soluciones PFA como 1% trabajado bien para el inmuno-etiquetado por ejemplo, con el marcador de célula de los marcadores Lgr5 y Paneth células CD24 dentro del nicho de células madre de cripta, mientras que concentraciones más altas de la PFA no funcionaba.
La adición de glutaraldehído da mejor preservación de los microtúbulos y la llamada fijación de PHEMO que consiste en una mezcla de 3,7% PFA, 0.05% glutaraldehído y 0.5% de detergente PHEMO tampón (tubos de 68 mM, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA y 3 mM MgCl2)2 da preservación excelente de microtúbulos sin comprometer la antigenicidad. También funciona bien para el inmuno-etiquetado gamma-tubulina β-catenina y E-cadherina y tinción filamentos de actina con phalloidin. Sin embargo, en culturas de organoides y tejido 3D, la fijación de PHEMO produce resultados inconsistentes y por lo tanto no se utilizó.
El metanol es un fijador coagulante relativamente buena penetración y tiende a preservar la antigenicidad. Fijación con metanol al 100% (-20 ° C) introduce alguna contracción da preservación de morfología moderada y funciona para muchos anticuerpos se incluyendo ninein en cultivos celulares 2D + consejos y microtúbulos. Sin embargo, algunos organoides se derrumbaron cuando se utiliza este método de fijación. Además, penetración de anticuerpos a través de criptas, vellosidades u organitas todo era inicialmente un problema, pero la adición de 0,1% detergente para la solución de lavado y lavado prolongado logra mejores resultados.
Una combinación de formaldehído y metanol había sido utilizada previamente por Rogers et al. 20 a inmuno-etiqueta EB1 en Drosophila. Un protocolo de fijación basado en una mezcla de formaldehído y metanol fue desarrollado por lo tanto para tejido intestinal y organitas basado en 3% metanol formaldehído y 97% frío a-20 ° C, pero omitiendo el carbonato de sodio 5 mM de la mezcla que fue utilizada por Rogers et al. 20 además, las muestras se fijaron en el congelador a-20 ° C. Esto trabajó particularmente bien para el inmuno-etiquetado + consejos, tales como CLIP-170 y el EBs, pero también resultó excelente para la fijación y el inmuno-etiquetado microtúbulos y actina dentro de tejido y 3D organitas. Muy buena conservación estructural era evidente y antigenicidad fue preservada por varias proteínas citoesqueléticas y asociadas así como proteínas centrosómicas como gamma tubulina y ninein, aunque etiquetado para ninein trabajó más consistentemente con metanol fijación.

Formación de epitelios polaridad apico-basal es un proceso fundamental en el desarrollo e implica una dramática reorganización de los microtúbulos y proteínas centrosómicas. Una matriz de microtúbulos radiales que emanan de un microtúbulos se encuentra organización de centro (COMT) es prominente en muchas células animales y esto es ideal para células relativamente planas. En contraste, las células epiteliales columnares, como las del intestino, montan no radiales transcelular microtubulares que soportan mejor la forma y funciones especializadas de estas células. Esta dramática reorganización de los microtúbulos es alcanzada por el centrosoma hacia el ápice y COMTs no centrosómicos apicales (n-MTOCs) formando, que se convierte en responsable de anclaje de los microtúbulos transcelular1,2 , 3 , 4 , 5.
Gran parte de nuestro conocimiento de la diferenciación epitelial y la reorganización de microtúbulos asociados proviene de las investigaciones de 2D en vitro capas celulares que se muestra la arquitectura de tejidos en vivo . Desarrollo de 3D en vitro organoide culturas por Clevers y colaboradores6, representa un gran avance tecnológico ya que imitan en vivo arquitectura y desarrollo. Una jerarquía de diferenciación epitelial es evidente en el intestino; las células de vástago en la parte inferior de las criptas dan lugar a inmaduro tránsito amplificando células que proliferan y diferencian gradualmente mientras migran hasta la cripta en la pequeña vellosidad intestinal o la superficie colónica, donde ser distinguidos completamente antes de ser arrojar sobre el lumen7. Lo importante, esto se repite en organoides intestinal donde las células del nicho de células madre proliferan formando quistes que posteriormente generan brotes de la cripta-como con las células de vástago en la parte inferior y avanzando gradualmente hacia la región del quiste, la diferenciación que se convierte en vellosidad como8. El organoide intestinal por lo tanto representa un poderoso modelo para el estudio no sólo de microtúbulos y se reorganización durante la diferenciación epitelial pero numerosas otras proteínas, así como proporcionar una plataforma ideal para la detección de drogas y alimentos compuestos de potencial terapéutico beneficia a9,10.
Organoides se adaptan bien para vivir-la proyección de imagen de proteínas fluorescentes etiquetadas y tanto golpe y organoides de knock-out pueden ser generada usando gene CRISPR/Cas9 edición11,12. Sin embargo, establecer la expresión y localización de las proteínas endógenas a estudiar es importante, especialmente para comprobar el comportamiento de las proteínas etiquetados. Inmuno-etiquetado 3D organitas en matriz de sótano o ex vivo aislado el tejido es más complejo que las células cultivadas en platos de la cultura en 2D. El protocolo de fijación debe preservar la delicada arquitectura 3D de organoides todavía conservando antigenicidad de anticuerpos (es decir, los epitopos para atar los anticuerpos). Por ejemplo, 4% paraformaldehido (PFA) es comúnmente usado como un fijador pero mientras que es relativamente rápida fijador y da buena preservación morfológica, en nuestra experiencia con frecuencia resulta en la pérdida de antigenicidad y no es conveniente para muchos anticuerpos se. También debe considerarse la capacidad de los anticuerpos y fijador para penetrar el tejido y las estructuras 3D. Con este fin, hemos modificado y desarrollados protocolos para el aislamiento de tejido y el inmuno-etiquetado indirecto de organoides 3D en vitro y ex vivo aislaron de tejido intestinal. Describimos Cómo aislar pequeñas criptas intestinales y vellosidades y tejido colónico e incluir un protocolo para el aislamiento de organoides 3D como alternativa a la fijación e inmuno-etiquetado dentro de la matriz de sótano. Presentamos tres protocolos de fijación alternativos para el inmuno-etiquetado de microtúbulos y proteínas centrosómicas, como ninein y proteínas de plus-rastreo de microtúbulos (+ consejos), como las proteínas de la EB y CLIP-170 (véase también referencias8, 13). También discutimos los pros y los contras asociados a cada protocolo.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML solución de</td><td>lavado y</td></tr><tr><td>recuperación celular</td><td>PFA Corning</td><td>354253</td><td>aislado organoides</td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>30108116</td><td>evitar que las células se peguen</td></tr><tr><td>0,5 M solución de EDTA, pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>03690-100ML Aislamiento de</td><td>cripta</td></tr><tr><td>70 &mu; colador de células m</td><td>Fisher Scientific</td><td>11517532</td><td>Aislar criptas de vellosidades</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>detergente</td></tr><tr><td>suero de cabra</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td>agente bloqueante</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td></td><td>utilizado como agente antiadherente</td></tr><tr><td>Paraformaldehído, 4% en PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td>fijador</td></tr><tr><td>Solución de formaldehído (36.5&ndash; 38% en H2O)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>utilizado como fijador</td></tr><tr><td>Metanol 99,9% de grado analítico</td><td>Fisher</td><td>M/4000/17</td><td>utilizado como fijador</td></tr><tr><td>MaxFluor Ratón en ratón Kit de detección de inmunofluorescencia Maxvision</td><td> Biosciences</td><td>MF01-S</td><td>kit de inmunofluorescencia comercial; para reducir el marcaje inespecífico</td></tr><tr><td>Rotator SB2 o SB3</td><td>Stuart</td><td></td><td>rotor de tubo de microcentrífuga</td></tr><tr><td>Recuperación de antígenos de</td><td>citrato</td><td></td><td></td> de sodio</tr><tr><td>Hydromount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td>montante</td></tr><tr><td>DABCO - 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano</td><td>Sigma</td><td>D27802</td><td>agente antidecoloración</td></tr><tr><td>Carga positiva permanente, prelavado, bordes rectificados de 90 grados</td><td>Clarity</td><td>N/C366</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos Cubreobjetos de vidrio - espesor n.º 1, 22 x 50 mm</td><td>Clarity</td><td>NQS13/2250</td><td>cubreobjetos</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Matriz basal para el cultivo de organoides en 3D</td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>para el procesamiento de tejidos/organoides</td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td>para el procesamiento de tejidos/organoides</td></tr><tr><td>Tubos LoBind de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td>para organoides aislados</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-E-cadherina</td><td>de ratón BD Biosciences</td><td>610181</td><td>anticuerpo primario 1:500</td></tr><tr><td>Rata monoclonal anti-tubulina YL1/2 anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>AB6160</td><td>anticuerpo primario 1:100</td></tr><tr><td>Conejo Anticuerpo alfa-tubulina</td><td>Abcam</td><td>AB15246</td><td>anticuerpo primario 1:100</td></tr><tr><td>Conejo anticuerpo anti-beta-actina</td><td>Abcam</td><td>ab8227</td><td>anticuerpo primario 1:100</td></tr><tr><td>anti-p150 monoclonal para ratasAnticuerpo pegado</td><td>BD Bioscience</td><td>610473/4</td><td>anticuerpo primario 1:100</td></tr><tr><td>Anticuerpo EB3KT36 monoclonal para ratas</td><td>Abcam</td><td>AB53360</td><td>Anticuerpo primario 1:200</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal EB1 de</td><td>ratón BD Bioscience</td><td>610535</td><td>anticuerpo primario 1:200</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Lgr5 para conejos</td><td>Abgent</td><td>AP2745d</td><td>Anticuerpo primario 1:100</td></tr><tr><td>Dylight anti-rata 488</td><td>Jackson</td><td>112545167</td><td>seconday anticuerpo 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-ratón 488</td><td>Jackson</td><td>ST115545166</td><td>seconday anticuerpo 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-conejo 647</td><td>Jackson</td><td>111605144</td><td>seconday anticuerpo 1:400</td></tr></tbody></table>

inmuno-fluorescente etiquetado de microtúbulos y proteínas centrosómicas en tejido intestinal ex vivo y 3d in vitro intestinal organitas

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

La llegada de las 3D en vitro organoides que imitan la arquitectura de tejido en vivo y la morfogénesis ha avanzado enormemente la capacidad para el estudio de cuestiones biológicas fundamentales en biología celular y del desarrollo. Además, organitas junto con los últimos avances técnicos en la edición de genes y genes virales se compromete a avanzar en la investigación médica y desarrollo de nuevos fármacos para el tratamiento de enfermedades. Organoides en vitro en matriz de sótano proporcionan sistemas potente modelo para estudiar el comportamiento y función de proteínas diferentes y se adaptan bien para vivir-la proyección de imagen de proteínas fluorescentes etiquetadas. Sin embargo, establecer la expresión y localización de las proteínas endógenas en tejido ex vivo y in vitro es importante verificar el comportamiento de las proteínas etiquetados organitas. Con este fin hemos desarrollado y modificado aislamiento de tejido, la fijación y el inmuno-etiquetado protocolos para localización de microtúbulos, proteínas centrosómicas y asociados en tejido intestinal ex vivo y en vitro intestinal organitas. El objetivo fue para que el fijador preservar la arquitectura 3D de organoides y tejidos también preservando la antigenicidad de anticuerpo y permitir la buena penetración y remoción de anticuerpos y fijador. Exposición al frío depolymerizes todos pero los microtúbulos estables y esto fue un factor clave cuando se modifica los distintos protocolos. Se encontró que aumentando la concentración de (EDTA) ácida etilendiaminotetracético de 3 mM a 30 mM dio la separación eficiente de las vellosidades y las criptas en el intestino, mientras que 3 mM EDTA era suficiente para las criptas colónicas. El protocolo de fijación formaldehído/metanol desarrollado dio muy buena conservación estructural también conservando antigenicidad de etiquetado eficaz de microtúbulos, actina y las proteínas (EB) final. También trabajó para el ninein proteínas centrosómicas a pesar del Protocolo de metanol más consistentemente. Además establecimos que pueden lograrse la fijación y el inmuno-etiquetado de microtúbulos y proteínas asociadas con organoides aislados o permanecer dentro de la matriz de sótano.

Presentamos los protocolos para el aislamiento de estructuras 3D intestinales del tejido en vivo y en vitro matriz sótano integrado organoides y fijación diversos detalles y protocolos optimizados para el inmuno-etiquetado de microtúbulos, la coloración proteínas centrosómicas y Unión, así como la célula de marcadores como la proteína de la célula de vástago Lgr5.

Inmuno-fluorescente etiquetado de microtúbulos y proteínas centrosómicas en tejido Intestinal Ex Vivo y 3D In Vitro Intestinal organitas

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar organoides intestinales incrustados en la matriz basal in vitro en 3D y, posteriormente, fijar e inmunomarcar los microtúbulos y los organoides centrosomales proteins. 3D in vitro son modelos ideales para estudiar cuestiones biológicas clave en biología celular y del desarrollo. Pero la localización de proteínas y estructuras endógenas en modelos 3D es más compleja que en cultivos 2D.Es importante destacar que el fijador debe preservar la delicada arquitectura 3D y, al mismo tiempo, preservar la antigenicidad del anticuerpo. Los métodos presentados incluyen el aislamiento, la fijación y el inmunomarcaje de organoides intestinales in vitro en 3D. Pero los protocolos de fijación e inmunomarcaje también se pueden utilizar en tejido aislado ex vivo.La principal ventaja del protocolo de fijación de metanol de formaldehído presentado es que preserva las estructuras 3D al mismo tiempo que preserva la antigenicidad. Permite una buena penetración y eliminación de los anticuerpos tevel postfijados para el marcaje eficaz de microtúbulos, filamentos de actina y proteínas de unión y varias proteínas centrosomales, incluida la nineína. La doctora Deborah Goldspink, postdoc formal en mi laboratorio, y la doctora Zoe Matthews, coautora del procedimiento, demostrarán el procedimiento.Tras el aislamiento de las criptas intestinales y las vellosidades, las estructuras epiteliales aisladas pueden fijarse para la inmunotinción. Las criptas aisladas pueden asentarse alternativamente en cúpulas matriciales que luego formarán organoides. Después de aproximadamente cinco a siete días de incubación, se habrán formado organoides.Utilice 500 microlitros de RT-PBS para lavar los pocillos que contienen las cúpulas de la matriz del basamento con organoides. Luego, agregue 250 microlitros de solución de recuperación de celda fría a cada pocillo. A continuación, con una micropipeta P1000, raspe las cúpulas de la matriz del basamento y pipetee cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo por todo el pozo para romper y eliminar la matriz del basamento del plástico.Asegúrese de que la solución de recuperación esté fría para ayudar a descomponer la matriz. A la hora de raspar, utilice únicamente una micropipeta P1000 para no romper los organoides y que permanezcan intactos. Recoja el sobrenadante en tubos de microcentrífuga de baja unión de 1,5 mililitros.A continuación, invierta el tubo varias veces y compruebe al microscopio con un aumento de 50 veces que los organoides se han aislado, se mueven libremente y no están en grupos. Granular los organoides por centrifugación a 1.000 g y temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, retire el reactivo de recuperación y proceda inmediatamente a la fijación.Para fijar organoides previamente aislados con formaldehído y metanol, vuelva a suspender los organoides en una solución fijadora de metanol de formaldehído a 20 grados centígrados negativos. Incubar los organoides a menos 20 grados centígrados en un congelador durante 15 minutos, invirtiendo el tubo cada cinco minutos. A continuación, granule los organoides por centrifugación a 1.000 g durante cinco minutos.Retire el fijador y luego agregue la solución de lavado que consiste en PBS con 1% de suero de especies de anticuerpos secundarios o PBS con 0,1% de detergente y 1% de suero. Después de peletizar la muestra como antes, retire la solución de lavado y vuelva a suspender la muestra en una solución de lavado nueva. Utilice un rotador de tubo para lavar las células durante un total de una hora, granulando los organoides por centrifugación cada 15 minutos y reemplazando la solución de lavado.Para bloquear las muestras de organoides intestinales, agregue un 10% de suero de especies de anticuerpos secundarios al PBS. Granular los organoides a 1.000 g durante cinco minutos y eliminar el sobrenadante. Añadir un mililitro de solución bloqueante a cada muestra para ser incubada en los diferentes anticuerpos.A continuación, incube las muestras y la solución de bloqueo en un rotador de tubos a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, diluya los anticuerpos primarios en PBS que contengan un 10% de suero y un 0,1% de detergente. Luego, después de girar las muestras y eliminar la solución de bloqueo, use la solución de anticuerpos primarios para resuspender la pastilla de organoide.Gire los tubos a 20 RPM y cuatro grados centígrados durante la noche para mantener los organoides en suspensión. Al día siguiente, vuelva a poner las muestras a temperatura ambiente en el rotador de tubos durante una hora. Después de centrifugar la muestra, retire la solución de anticuerpos primarios, agregue un mililitro de solución de lavado a cada tubo y vuelva a suspender los gránulos de organoides.Luego, retire inmediatamente la solución por centrifugación. Agregue un mililitro de solución de lavado fresca y mezcle las celdas en un rotador de tubos a 20 RPM durante dos horas. A continuación, diluir los anticuerpos secundarios en PBS con 1% de suero y 0,1% de detergente.Luego, después de peletizar el tejido, vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de solución de anticuerpos secundarios. Incube los tubos en un rotador de tubos a temperatura ambiente durante una hora. Después de girar y eliminar el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en solución de lavado e inmediatamente centrifugue las muestras para granular los organoides.A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de solución de lavado fresca. Mezcle las muestras en un rotador de tubos a temperatura ambiente durante 1,5 a dos horas, cambiando la solución de lavado cada 20 a 30 minutos como se describió anteriormente. Para montar los organoides, después de girar y retirar toda la solución de lavado, agregue dos gotas de medio de montaje de fraguado duro con reactivo antidecoloración al pellet.Corte el extremo de una micropipeta P200 y vuelva a suspender con cuidado el pellet en el medio de montaje. Al resuspender organoides fijos y teñidos en el medio de montaje, tenga cuidado de no introducir burbujas. Si hay burbujas, permítalas flotar hacia la superficie y luego evite transferirlas al portaobjetos.Utilice la micropipeta para dispensar los organoides con el medio de montaje en una línea a lo largo del centro de un portaobjetos de microscopio. Luego, coloque con cuidado un cubreobjetos sobre la parte superior y evite generar burbujas. Coloque el portaobjetos de vidrio en un libro de portaobjetos y guárdelo en un refrigerador durante la noche para que el medio de montaje se asiente antes de analizarlo en un microscopio confocal.Aquí se muestran imágenes de la fracción dos de tejido aislado del intestino delgado que contiene vellosidades y criptas y una muestra de la fracción tres que contiene principalmente criptas. Como se ve en estas imágenes, se logró una buena conservación y marcaje de los microtúbulos y la actina tanto en las vellosidades como en las criptas con el protocolo de fijación e inmunomarcaje de metanol con formaldehído descrito en este video. Los organoides del intestino delgado se generaron y crecieron en matriz basal durante tres semanas o más, luego se aislaron como se demuestra en este video.Las células diferenciadas dentro de los dominios de vellosidades organoides contienen microtúbulos apicobasales estables que estaban bien marcados en la mayoría de los casos. EB1 también se pudo ver a lo largo de la red de microtúbulos. Aquí se muestra un organoide en la etapa del quiste y en una etapa temprana del desarrollo de las criptas.Ambas muestras se fijaron en metanol de formaldehído e inmunomarcadas para microtúbulos y nineína, lo que demuestra una buena conservación y marcaje de los microtúbulos en los centros organizadores de microtúbulos apicales no centrosomales. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar con múltiples muestras y durante dos días. Al intentar este procedimiento, es importante raspar cuidadosamente los pocillos al recolectar organoides para evitar alterar su estructura 3D.Además, tenga cuidado al agregar o quitar soluciones para evitar la pérdida de organoides durante el procedimiento de tinción. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fijar, inmunomarcar y montar organoides aislados y otras estructuras epiteliales como las criptas intestinales. No olvide que los reactivos fijadores funcionales en este procedimiento pueden ser extremadamente peligrosos.Se deben realizar evaluaciones de riesgos de este procedimiento y siempre se deben tomar medidas de contención adecuadas y EPP mientras se realiza este procedimiento.

immuno-fluorescent-labeling-microtubules-centrosomal-proteins-ex-vivo

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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Inmuno-fluorescente etiquetado de microtúbulos y proteínas centrosómicas en tejido Intestinal Ex Vivo y 3D In Vitro Intestinal organitas (Video) | JoVE Journal

Inmuno-fluorescente etiquetado de microtúbulos y proteínas centrosómicas en tejido Intestinal Ex Vivo y 3D In Vitro Intestinal organitas

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