Inmuno-fluorescente etiquetado de microtúbulos y proteínas centrosómicas en tejido Intestinal Ex Vivo y 3D In Vitro Intestinal organitas

Presentamos los protocolos para el aislamiento de estructuras 3D intestinales del tejido en vivo y en vitro matriz sótano integrado organoides y fijación diversos detalles y protocolos optimizados para el inmuno-etiquetado de microtúbulos, la coloración proteínas centrosómicas y Unión, así como la célula de marcadores como la proteína de la célula de vástago Lgr5.

El objetivo general de este procedimiento es aislar organoides intestinales incrustados en la matriz basal in vitro en 3D y, posteriormente, fijar e inmunomarcar los microtúbulos y los organoides centrosomales proteins. 3D in vitro son modelos ideales para estudiar cuestiones biológicas clave en biología celular y del desarrollo. Pero la localización de proteínas y estructuras endógenas en modelos 3D es más compleja que en cultivos 2D.

Es importante destacar que el fijador debe preservar la delicada arquitectura 3D y, al mismo tiempo, preservar la antigenicidad del anticuerpo. Los métodos presentados incluyen el aislamiento, la fijación y el inmunomarcaje de organoides intestinales in vitro en 3D. Pero los protocolos de fijación e inmunomarcaje también se pueden utilizar en tejido aislado ex vivo.

La principal ventaja del protocolo de fijación de metanol de formaldehído presentado es que preserva las estructuras 3D al mismo tiempo que preserva la antigenicidad. Permite una buena penetración y eliminación de los anticuerpos tevel postfijados para el marcaje eficaz de microtúbulos, filamentos de actina y proteínas de unión y varias proteínas centrosomales, incluida la nineína. La doctora Deborah Goldspink, postdoc formal en mi laboratorio, y la doctora Zoe Matthews, coautora del procedimiento, demostrarán el procedimiento.

Tras el aislamiento de las criptas intestinales y las vellosidades, las estructuras epiteliales aisladas pueden fijarse para la inmunotinción. Las criptas aisladas pueden asentarse alternativamente en cúpulas matriciales que luego formarán organoides. Después de aproximadamente cinco a siete días de incubación, se habrán formado organoides.

Utilice 500 microlitros de RT-PBS para lavar los pocillos que contienen las cúpulas de la matriz del basamento con organoides. Luego, agregue 250 microlitros de solución de recuperación de celda fría a cada pocillo. A continuación, con una micropipeta P1000, raspe las cúpulas de la matriz del basamento y pipetee cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo por todo el pozo para romper y eliminar la matriz del basamento del plástico.

Asegúrese de que la solución de recuperación esté fría para ayudar a descomponer la matriz. A la hora de raspar, utilice únicamente una micropipeta P1000 para no romper los organoides y que permanezcan intactos. Recoja el sobrenadante en tubos de microcentrífuga de baja unión de 1,5 mililitros.

A continuación, invierta el tubo varias veces y compruebe al microscopio con un aumento de 50 veces que los organoides se han aislado, se mueven libremente y no están en grupos. Granular los organoides por centrifugación a 1.000 g y temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, retire el reactivo de recuperación y proceda inmediatamente a la fijación.

Para fijar organoides previamente aislados con formaldehído y metanol, vuelva a suspender los organoides en una solución fijadora de metanol de formaldehído a 20 grados centígrados negativos. Incubar los organoides a menos 20 grados centígrados en un congelador durante 15 minutos, invirtiendo el tubo cada cinco minutos. A continuación, granule los organoides por centrifugación a 1.000 g durante cinco minutos.

Retire el fijador y luego agregue la solución de lavado que consiste en PBS con 1% de suero de especies de anticuerpos secundarios o PBS con 0,1% de detergente y 1% de suero. Después de peletizar la muestra como antes, retire la solución de lavado y vuelva a suspender la muestra en una solución de lavado nueva. Utilice un rotador de tubo para lavar las células durante un total de una hora, granulando los organoides por centrifugación cada 15 minutos y reemplazando la solución de lavado.

Para bloquear las muestras de organoides intestinales, agregue un 10% de suero de especies de anticuerpos secundarios al PBS. Granular los organoides a 1.000 g durante cinco minutos y eliminar el sobrenadante. Añadir un mililitro de solución bloqueante a cada muestra para ser incubada en los diferentes anticuerpos.

A continuación, incube las muestras y la solución de bloqueo en un rotador de tubos a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, diluya los anticuerpos primarios en PBS que contengan un 10% de suero y un 0,1% de detergente. Luego, después de girar las muestras y eliminar la solución de bloqueo, use la solución de anticuerpos primarios para resuspender la pastilla de organoide.

Gire los tubos a 20 RPM y cuatro grados centígrados durante la noche para mantener los organoides en suspensión. Al día siguiente, vuelva a poner las muestras a temperatura ambiente en el rotador de tubos durante una hora. Después de centrifugar la muestra, retire la solución de anticuerpos primarios, agregue un mililitro de solución de lavado a cada tubo y vuelva a suspender los gránulos de organoides.

Luego, retire inmediatamente la solución por centrifugación. Agregue un mililitro de solución de lavado fresca y mezcle las celdas en un rotador de tubos a 20 RPM durante dos horas. A continuación, diluir los anticuerpos secundarios en PBS con 1% de suero y 0,1% de detergente.

Luego, después de peletizar el tejido, vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de solución de anticuerpos secundarios. Incube los tubos en un rotador de tubos a temperatura ambiente durante una hora. Después de girar y eliminar el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en solución de lavado e inmediatamente centrifugue las muestras para granular los organoides.

A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de solución de lavado fresca. Mezcle las muestras en un rotador de tubos a temperatura ambiente durante 1,5 a dos horas, cambiando la solución de lavado cada 20 a 30 minutos como se describió anteriormente. Para montar los organoides, después de girar y retirar toda la solución de lavado, agregue dos gotas de medio de montaje de fraguado duro con reactivo antidecoloración al pellet.

Corte el extremo de una micropipeta P200 y vuelva a suspender con cuidado el pellet en el medio de montaje. Al resuspender organoides fijos y teñidos en el medio de montaje, tenga cuidado de no introducir burbujas. Si hay burbujas, permítalas flotar hacia la superficie y luego evite transferirlas al portaobjetos.

Utilice la micropipeta para dispensar los organoides con el medio de montaje en una línea a lo largo del centro de un portaobjetos de microscopio. Luego, coloque con cuidado un cubreobjetos sobre la parte superior y evite generar burbujas. Coloque el portaobjetos de vidrio en un libro de portaobjetos y guárdelo en un refrigerador durante la noche para que el medio de montaje se asiente antes de analizarlo en un microscopio confocal.

Aquí se muestran imágenes de la fracción dos de tejido aislado del intestino delgado que contiene vellosidades y criptas y una muestra de la fracción tres que contiene principalmente criptas. Como se ve en estas imágenes, se logró una buena conservación y marcaje de los microtúbulos y la actina tanto en las vellosidades como en las criptas con el protocolo de fijación e inmunomarcaje de metanol con formaldehído descrito en este video. Los organoides del intestino delgado se generaron y crecieron en matriz basal durante tres semanas o más, luego se aislaron como se demuestra en este video.

Las células diferenciadas dentro de los dominios de vellosidades organoides contienen microtúbulos apicobasales estables que estaban bien marcados en la mayoría de los casos. EB1 también se pudo ver a lo largo de la red de microtúbulos. Aquí se muestra un organoide en la etapa del quiste y en una etapa temprana del desarrollo de las criptas.

Ambas muestras se fijaron en metanol de formaldehído e inmunomarcadas para microtúbulos y nineína, lo que demuestra una buena conservación y marcaje de los microtúbulos en los centros organizadores de microtúbulos apicales no centrosomales. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar con múltiples muestras y durante dos días. Al intentar este procedimiento, es importante raspar cuidadosamente los pocillos al recolectar organoides para evitar alterar su estructura 3D.

Además, tenga cuidado al agregar o quitar soluciones para evitar la pérdida de organoides durante el procedimiento de tinción. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fijar, inmunomarcar y montar organoides aislados y otras estructuras epiteliales como las criptas intestinales. No olvide que los reactivos fijadores funcionales en este procedimiento pueden ser extremadamente peligrosos.

Se deben realizar evaluaciones de riesgos de este procedimiento y siempre se deben tomar medidas de contención adecuadas y EPP mientras se realiza este procedimiento.