Name: Colección de postnupcial Semen del aparato reproductor femenino y las mediciones de licuefacción del Semen en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Aprende a recolectar semen post-cópula del tracto reproductor femenino y medir su licuefacción en ratones. Este método permite estudiar la liberación de espermatozoides y su movilidad en biología reproductiva.

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Este trabajo es apoyado por el fondo de puesta en marcha de Universidad de medicina veterinaria (WSU) a WW. Los autores agradecen Sierra Olsen (WSU) la lectura crítica de este manuscrito.

Todos los animales y los procedimientos utilizados en este estudio se manejaron según las directrices de la Comisión de uso y cuidado de animales de la Universidad de estado de Washington (WSU) y en cumplimiento de protocolos de animales aprobado WSU #4702 y #4735.
1. ratones
<ol><li>
Uso estándar C57BL/6J ratones machos adultos u otras cepas de interés. Mantener los animales bajo un ambiente controlado de temperatura y humedad, con acceso ad libitum de agua y alimentos.
	<ol>
<li>Utilizar mejoradores masculinos desde 8 semanas de edad hasta 10 meses de edad. Utilice sólo los criadores probados en los experimentos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utilizar ratones adultos femeninos con una canceladura selectiva del tejido del tracto reproductivo estrógeno receptor α (codificada por el gen Esr1 ) en las células epiteliales10 (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, llamado agujero ciego o «KO») y hermanos de camada (Esr1f/f, llamado "CTRL") de control en este estudio.
	<ol>
<li>Uso de 8 semanas de edad las hembras. Las edades de las mujeres variaban según el experimento de interés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinar las etapas del ciclo estral en la mañana a las 8:00 h. Utilice sólo las hembras en la etapa de estro del ciclo. Métodos detallados de manchar vaginal y análisis citológico, se refieren a los procedimientos previamente publicados en11.</li>
</ol>2. acoplamiento y la evaluación de tapones copulatoria
<ol><li>En el día del estro (16:00 h), casa de la hembra en la jaula del macho.</li>
	<li>La mañana (8:00 h), separar la hembra del ratón macho.</li>
	<li>Utilice una adaptación de un método previamente publicado12 para acceder a la presencia o ausencia de un tapón vaginal o copula como indicación de apareamiento.</li>
	<li>Sostenga el ratón hembra de la base de la cola para levantar brevemente los miembros posteriores.</li>
	<li>Encontrar el enchufe copula por la presencia de un coágulo seminal grisáceo en la apertura vaginal utilizando un palillo de dientes. Si el aparato copulador está presente, el palillo no serán capaces de introducirse en la vagina.</li>
</ol>3. preparación antes de la colección de tejidos
<ol><li>Preparar 10 mL de medios de comunicación de Leibovitz de L-15, suplementado con 1% de suero bovino fetal (llamado L15 media + 1% FBS) en un tubo de 15 mL. Incubar los medios a 37 ° C durante 15 min en un baño de agua.</li>
	<li>Para preservar la viabilidad del tejido y esperma para aplicaciones posteriores, 2 mL alícuota de precalentado media L15 + 1% FBS en una microcentrífuga de 2 mL tubo para recolección de tejido.</li>
	<li>Caliente la etapa de Estereomicroscopio a 37 ° C. Fijar el bloque de calor a 37 º C y colocar un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL vacía en el bloque.</li>
	<li>Si las aplicaciones downstream requieren la proyección de imagen de la motilidad espermática, calentar lo portaobjetos de vidrio a 37 ° C.</li>
</ol>4. tejido colección
<ol><li>Traer medios L15 precalentados + alícuota de 1% FBS a la zona de recogida de tejido.</li>
	<li>Eutanasia a la hembra (~ 08: 30h) utilizando dióxido de carbono asfixia seguida por dislocación cervical. Nota: Esto es aproximadamente 8 h después de aparearse, suponiendo que el apareamiento lleva a cabo a la medianoche.</li>
	<li>Coloque el animal en posición decúbito dorsal para exponer el área abdominal.</li>
	<li>Rocíe alcohol al 70% en el abdomen cerca de extremidades posteriores.</li>
	<li>Utilice las tijeras de disección realice un corte pequeño (~ 1 cm) en la piel del abdomen inferior.</li>
	<li>Utilizar la mano dominante para tirar de la cola (y extremidades traseras si es necesario) mientras que la mano no dominante tira la piel en la dirección opuesta (hacia la cabeza) para exponer el músculo abdominal. Este método se utiliza para minimizar la cantidad de contaminación de pelo a los órganos viscerales.</li>
	<li>Cortar el músculo abdominal en forma de V en la base del abdomen, junto a la vagina, para exponer los órganos viscerales.</li>
	<li>Mover los intestinos y grasa abdominal al lado para exponer el tracto reproductivo.</li>
	<li>Recorte de vejiga y otros tejidos por encima de la zona vaginal.</li>
	<li>Cortan sínfisis púbica para tener acceso al tejido vaginal.</li>
	<li>Levantar el tejido vaginal en la abertura vaginal y usando tijeras para separar la vagina el tejido rectal.</li>
	<li>Recorte cuidadosamente la grasa mesentérica de ambos lados del útero con unas tijeras de muelle. PRECAUCIÓN: El útero es muy frágil con el semen dentro. Tenga cuidado de no perforar el útero, o bien el semen se perderá.</li>
	<li>Levantar el tracto reproductivo inferior y cortar la almohadilla de grasa ovárica en ambos lados.</li>
	<li>Transferir el tracto reproductivo todo el tubo de precalentado Leibovitz L-15 media + 1% FBS.</li>
</ol>5. medición de la licuefacción del Semen (viscosidad) de la colección de contenido uterino
<ol><li>Sobre la platina calefactada de la Estereomicroscopio, transferencia de los tejidos en un plato de cultivo estériles para tejidos de 35 mm llenan de 3.5 mL previamente calentado L-15 media + 1% FBS para limpiar los tejidos de la sangre y otros contaminantes. PRECAUCIÓN: Mientras lava, agarrar los tejidos por la grasa, no el útero. En este punto, se espera que el semen intacto dentro del útero.</li>
	<li>Secar los tejidos del exceso de medio uso toallitas de laboratorio.</li>
	<li>Mantener el tejido en el extremo vaginal colocando los extremos ováricos en el tubo de microcentrífuga precalentado. Sujetando el extremo vaginal, cortar los cuernos uterinos en la base del útero, permitiendo que los cuernos uterinos caer en el tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Dejar que el semen flujo fuera de los cuernos uterinos en el tubo. Utilizar pinzas sin dientes para apretar suavemente los cuernos uterinos del extremo ovárico al extremo vaginal, expulsión de semen sobrante.</li>
	<li>Deseche los tejidos en bolsa de biohazard y queme.</li>
	<li>Girar brevemente por el semen en un minicentrifuge (~ 1-2 s).</li>
	<li>Colocar el tubo, paralelo a la etapa caliente - semen no se derrama hacia fuera.</li>
	<li>Tiene el temporizador listo y a 'cuenta en adelante'.</li>
	<li>Inserte un tubo capilar de 25 μl de la muestra de semen en un ángulo de 180 º (paralelo a la pared del tubo). Esto es para minimizar la variabilidad entre cada investigador de sujetando el tubo capilar en diferentes ángulos.</li>
	<li>Pulsa el cronómetro tan pronto como el tubo capilar hace contacto con el semen.</li>
	<li>Registrar el tiempo (s) que tarda el semen llegar a la línea de 25 μl.</li>
	<li>Una vez terminada la medición, coloque inmediatamente el tubo que contiene el semen en el bloque de calor seco para su posterior análisis funcional, como imágenes de video de la motilidad espermática.</li>
	<li>Desinfectar el tubo capilar que contiene semen sumergiendo el tubo en la solución de cloro 10% por 20 min y descartar el tubo capilar en el contenedor de objetos punzantes.</li>
</ol>6. video proyección de imagen de la motilidad espermática
<ol><li>Encienda el microscopio y software de proyección de imagen de vídeo.</li>
	<li>Pipetear 20 μl de semen restante sobre el portaobjetos de cristal previamente calentados, mientras que el portaobjeto se coloca sobre la platina calefactada.</li>
	<li>Cubrir con un cubreobjetos de vidrio.</li>
	<li>Deposite al lado del cubreobjetos portaobjetos en el microscopio.</li>
	<li>Utilice 20 X objetivo para encontrar el área de interés.</li>
	<li>Cambiar a lente de objetivo de 100 X para imágenes de video.</li>
	<li>Grabar el video en 12 cuadros/s (fps) de 30 s.</li>
	<li>Al azar, grabar los videos en al menos 3 diferentes áreas por animal.</li>
	<li>Realizar la proyección de imagen rápida y minimizar la exposición a la luz a la diapositiva para preservar la motilidad espermática y la viabilidad. Nota: Este procedimiento imagenológico debe realizarse dentro de 2-3 minutos.</li>
	<li>Realizar el análisis de datos utilizando el software ImageJ como se describió previamente8.</li>
</ol>

<ol><li>Suarez, S. S., Pacey, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+transport+in+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Sperm transport in the female reproductive tract.</a> Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).</li>
<li>Bedford, J. M., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+sperm+motility+after+mating+in+the+rat+and+hamster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster.</a> J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).</li>
<li>Lilja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+semenogelin%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Cell biology of semenogelin.</a> Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).</li>
<li>Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semenogelin%2C+the+predominant+protein+in+human+semen.+Primary+structure+and+identification+of+closely+related+proteins+in+the+male+accessory+sex+glands+and+on+the+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa.</a> J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).</li>
<li>Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seminal+fluid+characterization+for+male+fertility+and+prostate+cancer%3A+kallikrein-related+serine+proteases+and+whole+proteome+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches.</a> Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).</li>
<li>Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+role+of+human+KLK14+in+seminal+clot+liquefaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction.</a> J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).</li>
<li>Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+kallikrein+on+sperm+motility%2C+capillary+tube+test%2C+and+pregnancy+rate+in+an+AIH+program%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Androl%22%5BJournal%5D)">Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program.</a> Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).</li>
<li>Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+estrogen+for+the+mammalian+female+in+regulating+semen+coagulation+and+liquefaction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006743(2017).</li>
<li>Elia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+semen+hyperviscosity%3A+prevalence%2C+pathogenesis+and+therapeutic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects.</a> Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).</li>
<li>Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+epithelial+estrogen+receptor+alpha+is+dispensable+for+proliferation+but+essential+for+complete+biological+and+biochemical+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).</li>
<li>McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+vaginal+lavage%2C+crystal+violet+staining%2C+and+vaginal+cytological+evaluation+for+mouse+estrous+cycle+staging+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification.</a> J Vis Exp. (67), e4389(2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/10293">Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning.</a> JoVE. , Cambridge, MA (2017).</li>
<li>Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+therapeutic+potential+of+human+kallikrein-related+serine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).</li>
<li>Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+functions+of+tissue+kallikrein-related+peptidases+in+vaginal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid.</a> Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Recogida de semen de úteros de ratón puede proporcionar ventajas sobre el análisis de semen en vitro como la anterior puede ilustrar las interacciones fisiológicas entre el semen y las secreciones del tracto reproductivo femenino. Las técnicas presentadas en este estudio permiten a los investigadores a determinar la calidad del semen así como viabilidad espermática y la motilidad en condiciones fisiológicas ideales. Además, hay varios análisis posteriores que se pueden realizar utilizando el esperma rec...

El tracto reproductor femenino se compone de los tractos superiores e inferiores. El tracto reproductivo superior incluye las trompas de Falopio, el útero y el endocervix. El tracto reproductivo inferior incluye el exocérvix y la vagina. En los seres humanos, el eyaculado se deposita en la pared anterior de la vagina, junto al ectocérvix1. En ratones, sin embargo, el semen se barre en el útero dentro de minutos después del acoplamiento2.
Semen contiene gel seminal que se solidifica dentro de segundos de la eyaculación, causando el esperma para ser atrapados e inmovilizados3. Licuefacción libera el esperma inmovilizado cambiando semen de un tipo de gel con una consistencia acuosa. Este proceso es esencial para la motilidad espermática y la reproducción mamífera. Conocimiento de licuefacción del semen se basa sobre todo en vitro estudios donde se convierte en licuado de semen en una placa de cultivo. En los seres humanos, la actividad enzimática del antígeno prostático específico o PSA (peptidasa también conocido como relacionadas con la calicreína 3 o KLK3) es el principal para la licuefacción a través hidrólisis de semenogelins (gelificante proteínas presentes en el semen)4 ,5,6. Degradación de semenogelins libera el esperma del coágulo seminal, aumento de la movilidad del esperma. Liberado el nado de espermatozoides hacia la trompa de Falopio para fertilizar el huevo. Licuefacción (o viscosidad del semen) las pruebas son una de las proyecciones iniciales estándar para el análisis de semen en las clínicas de fertilidad para evaluar la fertilidad masculina7.
Un artículo recientemente publicado muestra que se pueden usar análisis de fluido seminal de la hembra del ratón tracto reproductivo postnupcial para ilustrar una deficiencia en licuefacción que posteriormente puede causar fertilidad defectos8. Licuefacción defectuoso como semen hiperviscosidad contribuye a 11.8 32.3% de los casos estériles en hombres9, sugiriendo que la licuefacción normal es indispensable para la reproducción de mamífero. Sin embargo, estudios y tratamiento de los defectos de licuefacción se han centrado exclusivamente en el hombre7. No se ha explorado la posibilidad de que el tracto reproductor femenino desempeña un papel en la licuefacción del semen. Por lo tanto, los métodos de colección de semen y medir el tiempo de licuefacción proporcionará a los investigadores una nueva herramienta de diagnóstico para determinar si la licuefacción puede ser una de las causas de la infertilidad en el organismo modelo de interés.

<table><tbody><tr><td>Palillo</td><td>de dientes Diamond</td><td>750-Flat</td><td>esterilizado en autoclave, use palillo de dientes romo. No utilice</td></tr><tr><td>tijeras de disección de</td> punta <td>Fisher</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>25-&mu; Tubo capilar de vidrio L</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 medios</td><td>Life Technologies 11415064</td><td></td><td>Suplemento con 1% de</td></tr><tr><td>suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-A</td><td></td></tr><tr><td>Calefactor digital de bloque seco</td><td>VWR</td><td>13259-052</td><td>Para calentar el tubo de microcentrífuga antes de la extracción de semen</td></tr><tr><td>minicentrífuga</td><td>Corning</td><td>LSE 6765</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de 35 mm</td><td>VWR</td><td>10861-656</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de polipropileno de 15 ml</td><td>VWR</td><td>10025-686</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Precision</td><td>TSGP05</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de platina calefactada</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ10F</td><td>Para mantener el tejido caliente antes de Recogida de semen</td></tr><tr><td>Microscopio de campo claro</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td>Opcional. Para la obtención de imágenes de vídeo de la motilidad de los espermatozoides, la</td></tr><tr><td>cámara</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC2900</td><td>opcional. Para la obtención de imágenes de vídeo de la motilidad de los espermatozoides</td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td>de vidrio Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Opcional. Para la adquisición de imágenes de vídeo de la motilidad de los espermatozoides</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>VWR</td><td>48393-059</td><td>Opcional. Para la obtención de imágenes de vídeo de la motilidad de los espermatozoides</td></tr>, <tr><td>lejía</td><td></td><td></td><td>diluida en dH2O a una concentración del 10%</td></tr></tbody></table>

colección de postnupcial semen del aparato reproductor femenino y las mediciones de licuefacción del semen en ratones

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

En ratones, el eyaculado se deposita en el útero. Después de la eyaculación, el semen cambia de consistencia de gel-como acuosa, un proceso llamado licuefacción. En este estudio, se muestra cómo recoger el post eyaculado en el aparato reproductor femenino en un modelo murino. Ratones hembra en primer lugar, adulto en la etapa de estro se alojaron en la jaula del macho durante la noche. A la mañana siguiente, la cópula fue confirmada por la presencia de copula tapón en la abertura vaginal. Ratones hembra con enchufes copulador fueron sacrificados, y cada tracto reproductivo fue recogido como un todo (vagina, útero, oviductos, ovarios), asegurando un sistema cerrado para contener el semen. El tracto reproductivo fue colocado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, y la vagina fue cortada para liberar el semen en el tubo. Para asegurar el volumen de semen máximo para el análisis, pinzas sin dientes se utilizan para exprimir los cuernos uterinos del extremo ovárico al extremo vaginal expulsando el semen restante. El tracto reproductivo entero luego fue descartado. El tubo que contiene el semen brevemente fue hecho girar hacia abajo. Una pipeta capilar de 25 μL se colocó en el tubo en un ángulo de 180 º (paralelo a la pared del tubo). Se registró la cantidad de tiempo usada para llenar el tubo capilar hasta la 25 μL. Semen de un criador macho probado generalmente toma aproximadamente 60-180 s para llenar un tubo capilar de 25 μL. Esta técnica de recogida de semen también puede ser utilizada en otras aplicaciones posteriores como el análisis de la proyección de imagen y de la motilidad de esperma.

Semen se recolectó de CTRL y KO hembras aproximadamente 8 h después de aparearse con los machos fértiles de CTRL. Licuefacción (o viscosidad del semen) se cuantifica por el tiempo necesario para llenar el tubo capilar de 25 μL de semen. Asumió el esperma recogido de úteros CTRL 2.06 min ±0.12 (mean±S.E.M, n = 5) para llenar el tubo capilar (figura 1). Sin embargo, el esperma recogido de úteros KO tomó más de 60 min (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) de tiempo experimental. Esto...

Licuefacción del semen es necesario para liberarse del gel seminal de los espermatozoides. Este estudio proporciona los procedimientos para la recogida de semen del coito posterior al tracto reproductor femenino y medir el tiempo de licuefacción del semen.

Colección de postnupcial Semen del aparato reproductor femenino y las mediciones de licuefacción del Semen en ratones

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

El objetivo de este estudio es determinar cómo recolectar semen post-apareamiento del tracto reproductivo femenino y cómo medir la licuefacción del semen en ratones. Los animales utilizados en este estudio se manejaron de acuerdo con las pautas del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Washington y en cumplimiento con los protocolos de animales aprobados por WSU 4702 y 4735. En el ser humano, el semen eyaculado se deposita en la pared anterior de la vagina adyacente al ectocérvix.En los ratones, sin embargo, el semen es arrastrado al útero minutos después del apareamiento. El semen contiene gel seminal que se solidifica a los pocos segundos de la eyaculación, lo que hace que los espermatozoides queden inmovilizados. El proceso de licuefacción cambia el semen de una consistencia gelatinosa a una consistencia acuosa.Este proceso es esencial para la motilidad de los espermatozoides y la reproducción de los mamíferos. La actividad enzimática del antígeno prostático específico o PSA es el principal contribuyente a la licuefacción a través de la hidrólisis del gel seminal o la proteína formadora de gel presente en el semen. La degradación de la proteína gelificadora libera los espermatozoides del coágulo seminal, lo que aumenta la movilidad de los espermatozoides para que los espermatozoides naden hacia el tracto reproductivo femenino superior para fertilizar el óvulo en la trompa de Falopio.El método para recolectar semen del tracto reproductivo femenino y la medición del tiempo de licuefacción presente en este estudio proporcionará a los investigadores una nueva herramienta de diagnóstico para determinar si la licuefacción podría ser una de las causas de infertilidad en el organismo modelo de interés. A continuación se presentan los procedimientos en los que se aparean los ratones y se determina el tapón vaginal. Se pueden utilizar ratones machos adultos estándar C57BL/6 u otras cepas de interés.Solo se utilizaron hembras en la etapa de estro del ciclo. Para obtener información detallada sobre el método para el frotis vaginal y el análisis citológico, consulte los procedimientos publicados anteriormente. A las cuatro de la tarde.El día del celo, la hembra estaba alojada en la jaula del macho. A la mañana siguiente, a las ocho, la hembra se separa de la jaula del macho. Utilizando un palillo de dientes plano estéril, la presencia o ausencia de un depósito de un tapón vaginal o copulatorio se evaluó como una indicación de apareamiento utilizando un procedimiento adaptado de un método publicado anteriormente.A continuación se realiza el procedimiento de preparación antes de la recolección de tejidos. Prepare 10 mililitros de medios L-15 de Leibovitz suplementados con 1% de suero fetal bovino o L-15 medios más 1% de FBS en un tubo de 15 mililitros. Caliente el medio a 37 grados centígrados durante 15 minutos.Con el fin de preservar la viabilidad del tejido y el esperma para aplicaciones posteriores, alicuota dos mililitros de medio en un tubo de dos mililitros para la recolección de tejido. Caliente la platina del microscopio estereoscópico a 37 grados centígrados. Ajuste el bloque de calor a 37 grados centígrados.Coloque un tubo vacío en el bloque de calor. También caliente el portaobjetos de vidrio a 37 grados centígrados si la aplicación posterior requiere imágenes de la motilidad de los espermatozoides. A continuación se detallan los procedimientos para la recolección de tejidos.Estas son las herramientas que se utilizarán para la recolección de tejidos. Eutanasiar a la hembra inmediatamente después de revisar el tapón mediante el uso de asfixia con dióxido de carbono seguida de dislocación cervical. Coloque al animal en posición supina para exponer el área abdominal.Rocíe etanol al 70% sobre el abdomen. Haz un pequeño corte de aproximadamente un centímetro en la piel de la parte inferior del abdomen. Tira de la cola y la piel en direcciones opuestas para exponer el músculo abdominal.Corta el músculo abdominal en forma de V en la base del abdomen. Mueva los intestinos y la grasa abdominal hacia un lado para exponer el tracto reproductivo. Recorta la vejiga y otros tejidos por encima de la zona vaginal.Corta la sínfisis púbica para acceder a los tejidos vaginales. Tire de la parte unida a la sínfisis púbica con pinzas de tubo para exponer el canal vaginal. Levante el tejido vaginal en la abertura vaginal y use unas tijeras para separar el canal vaginal del tejido rectal que se encuentra debajo.Recorta con cuidado la grasa mesentérica de ambos lados del útero con unas tijeras de resorte. El útero es muy frágil con el semen en su interior. Por lo tanto, el investigador debe tener cuidado de no perforar el útero o de lo contrario el semen se perderá.Corta la almohadilla de grasa ovárica de ambos lados de los ovarios. Transfiera todo el tracto reproductivo al tubo de medio precalentado. El siguiente es el método de medición de la licuefacción del semen.Aquí están las herramientas para la recolección de semen. Transfiera tres mililitros de la masa tibia a un plato de 3,5 centímetros. Transfiera el pañuelo al plato.Lave el pañuelo varias veces agarrando la almohadilla de grasa. En este punto, el semen aún debe estar intacto dentro del útero. Seca el pañuelo de papel de las toallitas Kimwipes para eliminar el exceso de medios.Sostenga el tejido en el extremo vaginal y colóquelo en el tubo precalentado levantando los extremos de los ovarios dentro de un tubo vacío. Corta ambos cuernos uterinos entre la vagina y el útero. Deje que el semen fluya desde los cuernos uterinos hacia la trompa.Use pinzas desdentadas para apretar suavemente y expulsar el semen sobrante en los cuernos uterinos. Centrifuga brevemente el semen uno o dos segundos. Coloque el tubo paralelo a la etapa calentada.Inserte un tubo capilar de 25 microlitros en la muestra de semen en un ángulo de 180 grados. Esto es para minimizar la variabilidad entre cada investigador al sostener el tubo capilar en diferentes ángulos. Registra el tiempo que tarda el semen en alcanzar los 25 microlitros de línea.El tiempo de licuefacción se cuantifica por el tiempo que se tarda en llenar un tubo capilar de 25 microlitros con semen. El semen recogido del útero de control tardó aproximadamente dos minutos en llenar el tubo capilar. Sin embargo, el semen recolectado del útero knockout tomó más de 60 minutos de tiempo experimental.Estos datos sugieren que el semen está significativamente más licuado en el control en comparación con el útero knockout. Este es uno de los ejemplos de aplicación posterior que utiliza imágenes de video de la motilidad de los espermatozoides. Utilice una punta de pipeta para pipetear 25 microlitros del semen restante en el portaobjetos de vidrio precalentado mientras el portaobjetos de vidrio se coloca en la platina del calentador.Cubra el portaobjetos con un cubreobjetos de vidrio. Transfiera el portaobjetos al microscopio colocando la cubierta del portaobjetos hacia abajo. Use una lente de objetivo de 20X para encontrar los espermatozoides.A continuación, cambie a una lente de objetivo de 100X para imágenes de vídeo. Graba el vídeo a 12 fotogramas por segundo durante 30 segundos. El semen recolectado del útero de control muestra espermatozoides nadando libremente dentro del campo microscópico.Sin embargo, el semen recogido del útero ciego mostró que la mayoría de los espermatozoides estaban agrupados con una movilidad mínima. Estos hallazgos sugieren que el semen recolectado del tracto reproductivo femenino ocho horas después del apareamiento puede usarse para un análisis posterior. Además de esas aplicaciones posteriores, los investigadores también pueden evaluar el efecto de los inhibidores o compuestos de interés que interfieren en diferentes procesos del transporte de espermatozoides, procesos como la licuefacción de los espermatozoides, el número de espermatozoides en el tracto, la motilidad de los espermatozoides o la migración de los espermatozoides en diferentes áreas del tracto reproductivo femenino.Los compuestos se pueden aplicar en el tracto reproductivo femenino antes del apareamiento. Luego, se puede evaluar el impacto de esos inhibidores o compuestos a partir de una muestra de semen después del apareamiento. Estos métodos pueden ser útiles para probar la practicidad de los medicamentos anticonceptivos que inhiben el transporte de espermatozoides.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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